免疫組織化學分析

免疫組織化學分析第1頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一第一部分基本知識第2頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一免疫組織化學的歷史、現(xiàn)狀和發(fā)展

疾病的診斷手段準確性，首推病理診斷準確性高，即病理組織學診斷。更準確、更可信、更有權威性。1974年免疫組化用于病理診斷免疫組織化學已成為病理診斷中的一種常用手段隨著免疫學和單抗技術的發(fā)展，免疫組化技術興起診斷免疫組化開始于70年代，發(fā)展高峰在80年代，90年代已在國外病理科列入病理技術室的常規(guī)工作。國內(nèi)病理科約晚10年的進程，90年代開始在診斷病理工作中普及第3頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一免疫組織化學在臨床上的應用(1)提高病理診斷準確性(2)對疾病的預后和治療的意義激素(3)癌基因蛋白的應用(4)對腫瘤增生程度的評價(5)微小病灶的發(fā)現(xiàn)微小癌，微小病灶（如羊水栓塞）(6)在腫瘤分期上的意義(7)指導腫瘤的治療(8)免疫性疾病的輔助診斷(9)病原微生物的檢測第4頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一免疫組化與抗體鑒定抗體上游鑒定方法:存在否?量多少?

免疫印跡、免疫沉淀、免疫電泳、免疫酶連抗體下游鑒定方法:價值體現(xiàn)IIF:間接免疫熒光技術,系IF的一種,步驟很簡單,特點為敏感性好,對于低濃度抗體檢出率高于以下兩種方法.IHC:免疫組織化學技術,方法不少,但具體操作基本相同,掌握一種就夠用了。ICC:免疫細胞化學技術,同上，組織換成細胞，但是處理方法不一樣了。下頁圖示第5頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一免疫組化的各種方法第6頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一IHC技術是目前常規(guī)病理診斷和臨床治療中必不可少的手段，按照美國FDA標準，IHC抗體試劑系統(tǒng)分三類：A類抗體進行病理鑒別診斷，B類抗體指導臨床治療，如ER/PR和AR，C類抗體顯示臨床用藥的靶細胞，要求試劑的安全性和穩(wěn)定性很高，此類抗體篩選要求有嚴格的內(nèi)部和外部對照。第7頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一免疫組化實驗涉及的幾個方面

1病理醫(yī)師：把握和選擇，指導實驗結果判定，2實驗員：準備片子和試劑，了解基本原理也很重要，會做也要會分析3組織處理4試劑是否可靠，實驗方法是否正確5實驗對照設立：許多實驗室忽略了這個要素。第8頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一第二部分實驗技術第9頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一免疫組化染色基本技術正式實驗前做HE染色確認片子質(zhì)量，厚度3-4um，目的細胞形態(tài)完好，沒有過多的壞死、出血、變性組織等，以免實驗完畢后發(fā)現(xiàn)片子質(zhì)量不好，浪費試劑和物力1常規(guī)處理：烤片，脫蠟，入水2抗原修復：3封閉處理：封閉組織內(nèi)源性酶，封閉組織非特異性抗原結合位點，其他封閉4抗體反應：一抗，二抗，三抗5顯色反應：DAB，AEC，BCIP/NBT6后續(xù)處理：復染/分化/返蘭，脫水，透明，封片相關知識：HE染色第10頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一相關知識：HE染色蘇木素—伊紅染色是形態(tài)學常用的染色方法，取自Hematoxyln和Eosin單詞，簡稱HE染色，蘇木素將細胞核染成藍色，伊紅將細胞漿染成紅色，顯示組織和細胞形態(tài)結構，同時將各種組織細胞成分與病變區(qū)分開來。HE染色是臨床病理診斷的方法。HE與IHC配合可以確診疾病第11頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一相關知識：HE示意圖第12頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一相關知識：HE與IHC染色第13頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一（一）

良好的標本制備，免疫組化成功的首要條件免疫組化對組織和細胞標本的要求

-保持所檢標本原有的結構、形態(tài)；

-在原位最大程度地保持待測抗原(或抗體)的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。免疫組化中常用的組織和細胞標本

*組織標本*細胞標本

石蠟切片組織印片冰凍切片細胞涂片

細胞爬片

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*石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法

-最大優(yōu)點是組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；這點對于我們來說非常重要！

-石蠟塊還能長期存檔，供回顧研究。

*石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原顯現(xiàn)有一定的影響，但可通過某些措施予以改善，因而它是大多數(shù)免疫組化中首選的組織標本制作方法。第15頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一切片的準備：APES，多聚賴胺酸剛切的石蠟片至少在58-60℃考2h以上（防止脫片），可以放置一段時間，實驗前再烤30min即可。不可高溫烤片（80℃），會導致組織抗原氧化而難以檢測。切片保存：不可長時間室溫或冰箱里保存切片，抗原會丟失，原則上切片最多可放3個月。背景：有些研究人員或技術員喜歡一次性連續(xù)切上大量片子，然后放置保存，留做實驗

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常規(guī)的石蠟切片標本均用甲醛（福爾馬林）固定，結果使得：

-抗原性物質(zhì)形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；

-蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。*要求：在染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復抗原的原有空間形態(tài)。

因為石蠟片組織含有石蠟，并且組織處于脫水的狀態(tài)，所以在實驗前期要進行相應處理，即二甲苯脫蠟和梯度酒精水化（從無水乙醇逐漸下行到75%酒精的過程，入水）下一步：抗原修復第17頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一（二）

恰當?shù)目乖迯停瑫艽蟪潭壬细淖冏罱K的實驗結果抗原修復方法

化學方法：胃蛋白酶，胰蛋白酶

加熱方法

-水浴加熱法

-微波照射法

-高壓加熱法

酸水解法以抗原修復效果而言，高壓法﹥微波法﹥化學方法﹥酸水解法﹥水煮法

細胞片和冰凍切片不需要抗原修復，但需要封閉步驟第18頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一

微波法

*將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，置微波爐加熱至95℃以上，持續(xù)l0～15分鐘，冷卻后，按免疫組化染色步驟進行。高壓法

*將玻片浸入抗原修復液內(nèi)，置高壓鍋中高壓1～2min，可取得極好的效果。

*由于高壓下受熱均勻，特別使用于大批量標本的染色。

注意事項

加熱后必須經(jīng)過室溫自然冷卻20～30分鐘，使未折疊的蛋白分子鏈恢復天然構型；

*修復液最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液；

下一步；封閉處理

第19頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一（三）

封閉處理，降低非特異性染色的必要程序這個步驟在抗原修復之后，主要有三個封閉如果最后的顯色系統(tǒng)采用HRP（辣根過氧化物酶），則需要以0.3-3%的H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，否則組織中血液系統(tǒng)的細胞會干擾實驗結果如果檢測系統(tǒng)（二抗或者三抗）以生物素作為標記，則需要封閉內(nèi)源性生物素（有專門試劑），否則肝、腎、甲狀腺等組織容易出現(xiàn)假陽性。常規(guī)的非免疫血清（正常血清）封閉。下一步：抗體反應第20頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一（四）

抗體反應，關鍵在于設置適當?shù)膶φ?陰性對照：抗體稀釋液2陽性對照：兩個方面（陽性組織細胞、陽性抗體）3抑制對照4吸收對照5自身對照（內(nèi)對照）6同型對照；同種屬來源的純IgG或其亞型7無關對照；其他抗體在病理科的日常診斷工作中，只要有陰性對照和陽性對照即可。第21頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一除一抗以外，配套的抗體檢測試劑盒種類很多，這些試劑盒本身附帶有詳細的操作說明，如二步法、三步法等，同時會建議如何選擇配套的顯色系統(tǒng)。特殊類型的一抗，例如嵌合抗體，則選擇特殊的配套試劑盒或二抗。即用型與濃縮型抗體關于一抗的孵育時間：

37℃1h4℃過夜可以根據(jù)實際需要安排

下一步；顯色反應第22頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一（五）

顯色系統(tǒng)與顯色控制，決定實驗效果目前最常用的顯示劑顯色試劑顏色

DAB棕黃色

AEC磚紅色

AP-Red鮮紅色

Fast-Blue亮綠色

BCIP/NBT蘭色前兩種用于辣根過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)后三種用于堿性磷酸酶（AP）系統(tǒng)評價：AEC顯色物溶于酒精和二甲苯，所以封片時不能用中性樹膠，以免褪色，而只能用甘油明膠或市售的AEC封片劑，采用該種試劑顯色的片子不能長期保存，不利于回顧性研究。

DAB顯色較快，鏡下控制比較容易，保存方便，實驗結果比AEC顯色者清晰，為IHC首選顯色試劑。

BCIP/NBT顯色系統(tǒng)主要用于原位分子雜交實驗，免疫組化可以選用。其缺點是不能用蘇木素復染（不能染核），但是可以用其他染料代替，比如核快紅等。第23頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一三種顯色系統(tǒng)效果圖

左上AEC左下BCIP/NBT右DAB第24頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一（六）

顯色后處理步驟，關系片子的外觀和內(nèi)觀復染，分化，返蘭前面已經(jīng)強調(diào)過，石蠟片子在實驗前經(jīng)過了脫蠟和水化處理，即二甲苯先脫蠟，然后沿無水乙醇逐漸到75%酒精。實驗完畢后，則必須沿著上面順序反向走一遍，目的是脫水和透明，使得組織細胞清晰和易于保存，同時也去掉一些附著于片子上的雜質(zhì)注意：適用于DAB和BCIP/NBT顯色系統(tǒng)，AEC不可（？）。強調(diào)：整個實驗過程不能干片第25頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一（七）

結果判斷，實驗是否成功的要素在對照實驗的基礎上進行判斷結合抗體和患者的資料熟悉病理基本知識和病變特點真陽性與假陽性真陰性與假陰性第26頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一判斷結果的基本原則陽性細胞定位是否明確，是胞膜、胞漿還是胞核陽性染色強度如何間質(zhì)清晰，無背景著色。陽性細胞要在5%以上，才能定為陽性。參考評價：

<5%-5%-25%+25%-50%++>50%+++

第27頁，共30頁，2023年，2月20日，星期一（八）

完整的IHC實驗報告實驗名稱抗體名稱、來源、亞型、克隆號檢測的組織或細胞名稱、來源、組織種屬抗體的稀釋度（效價）設