白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座

白色念珠菌檢驗方法

1、增菌培養(yǎng)取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、ml、10cm2）直接或處理后接種至適量（不少于100ml）沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48～72小時。2、分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～48小時（必要時延長至72小時）。白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第1頁

結(jié)果判斷

白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長菌落呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺摺。若平板上無菌落生長或生長菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第2頁2、如平板上生長菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選2～3個菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～48小時（必要時延長至72小時）。若平板上無綠色或翠綠色菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。3、若平板上生長菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似菌落接種于1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48小時。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢及芽管試驗。白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第3頁4、芽管試驗挑取1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤平皿內(nèi)，置35～37℃、1～3h，置顯微鏡下觀察，可見到由孢子長出短小芽管。5、若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第4頁

抑菌劑效力測定概述

1、抑菌劑效力檢驗法系用于測定滅菌、非滅菌制劑中抑菌劑活性，以評價最終產(chǎn)品抑菌效力，同時也可用于指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)在制劑研發(fā)階段抑菌劑確實定。2、假如藥品本身不含有充分抗菌活性，那么應(yīng)依據(jù)制劑特征（如水溶液制劑）添加適宜抑菌劑，以預(yù)防制劑在正常儲存和使用過程中可能發(fā)生微生物污染和大量繁殖尤其多劑量包裝制劑，防止因藥品微生物污染及對患者造成傷害。

白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第5頁

3、全部抑菌劑都含有一定毒性，而且在貯存過程中其有效性有可能因藥品活性成份提升或降低，為確保藥品質(zhì)量和用藥安全，添加防腐劑量應(yīng)依據(jù)制劑本身是否具抗菌活性，保持最低有效量并在藥品包裝上注明添加抑菌劑名稱和數(shù)量。白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第6頁

培養(yǎng)基

1、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基2、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基3、沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基

白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第7頁

培養(yǎng)基適用性檢驗

菌種銅綠假單胞菌pseudomonasaeruginosa）金黃色葡萄球菌（staphycococcus）白色念球菌（Candidaalbicans）]黑曲霉（Aspergillusniger）大腸埃希菌（EscherichiaColi）

菌液制備同控制菌培養(yǎng)基適用性檢驗白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第8頁

適用性檢驗

取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，馬上傾注胰酷胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，馬上傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置20～25℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)；同時，用對應(yīng)對照培養(yǎng)基替換被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗。白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第9頁

結(jié)果判定

被檢培養(yǎng)基菌落數(shù)與對照培養(yǎng)基菌落數(shù)相比大于70%，菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上菌落一致。判該培養(yǎng)基適用性檢驗符合要求。白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第10頁

抑菌劑效力測定

供試品分類為了到達(dá)試驗?zāi)繕?biāo)，依據(jù)供試品給藥路徑和用途將供試品分為四類，方便標(biāo)準(zhǔn)制訂和執(zhí)行，但對于一些抗酸性制劑和含活生物制劑應(yīng)考慮會降低有益菌生物活性。見表白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第11頁

表產(chǎn)品分類類別藥品

1類注射劑、其它非腸道制劑，包含乳劑、耳用制劑、無菌鼻用制劑及眼用制劑2類局部給藥制劑、非滅菌鼻用制劑及用于黏膜乳劑3類口服非固體制劑（非抗酸制劑）4類非固體抗酸制劑白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第12頁

菌種和菌液制備同培養(yǎng)基適用性檢驗

供試品接種1、抑菌劑效力可能受試驗用容器特征影響，如容器材質(zhì)、形狀、體積及封口方式等。所以，只要供試品每個包裝容器裝量足夠試驗用，同時容器便于按無菌操作接入試驗菌液、混合及取樣等，普通應(yīng)將試驗菌直接接種于供試品原包裝容器中進(jìn)行貯存。

白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第13頁2、若因供試品性狀或每個容器裝量等原因需將供試品轉(zhuǎn)移至無菌容器時，該容器材質(zhì)不得影響供試品特征（如吸附作用），尤其應(yīng)注意不得影響供試品PH，PH對抑菌劑活性影響很大，同時容器口徑大小應(yīng)便于供試品進(jìn)出及混勻。白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第14頁3、取包裝完整供試品最少5份，直接接種試驗菌，或取適量供試品分別轉(zhuǎn)移至5個適宜無菌容器中（若試驗菌侏數(shù)超出5株，應(yīng)增加對應(yīng)供試品份數(shù)），每一容器接種一個試驗菌。白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第15頁4、1、2、3類供試品1g或1ml接種菌量為105～106cfu，4類供試品中1g或1ml接種菌量為106～108cfu，接種菌液體積不得超出供試品體積0．5%～1%，充分混合，使供試品中試驗菌均勻分布。5、將接種供試品在試驗期間置20～25℃，避光貯存，貯存溫度改變應(yīng)盡可能控制在最小范圍，并預(yù)防被污染。白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第16頁

存活菌數(shù)測定

因為供試品中含有抑菌活性，所以菌數(shù)測定方法應(yīng)進(jìn)行驗證。依據(jù)菌數(shù)測定結(jié)果，計算1ml(g)供試品各試驗菌所加菌數(shù)及各間隔時間菌數(shù)，并換算成lg值。白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第17頁

測定細(xì)菌用胰酷胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，測定真菌用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基

依據(jù)產(chǎn)品類型，在要求接種時間，分別從上述每個容器中取供試ml(g)，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成1：10、1：102、1：103等稀釋級。

白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第18頁

結(jié)果判斷

1、抑菌劑效力依據(jù)各間隔時間測定菌數(shù)1.0lg值相對于初始值（0時菌數(shù)1.0lg值）降低程度進(jìn)行評價（見表），試驗結(jié)果按有效數(shù)字修約規(guī)則進(jìn)舍，保留一位小數(shù)點。結(jié)果符合表，要求可判斷該產(chǎn)品抑菌效力符合要求。

白色念珠菌和抑菌效力檢查方法專家講座第19頁表防腐劑抗菌效力標(biāo)準(zhǔn)

1類供試品細(xì)菌7天菌數(shù)下降不少于1.0lg，14天菌數(shù)下降不少于3.0lg，第14天到28天菌數(shù)不增加。真菌與初始值比，到7、14、28天菌數(shù)均不增加。

2類供試品細(xì)菌14天菌數(shù)下降不少于2.0lg，14天到28天菌數(shù)不增加。真菌與初始值比，到14、28天菌數(shù)均不增加。

3類供試品細(xì)菌14天菌數(shù)下降不少于1.0lg，14天到28天菌數(shù)均不增加。真菌與初始值比，14、28天菌