菌種保藏技術

菌種保藏技術第1頁/共14頁第五章

菌種保藏技術第2頁/共14頁菌種保藏——把從自然界分離到的野生型或經人工選育的用于科學研究和工業(yè)生產的優(yōu)良菌種，用各種適宜的方法妥善保存，盡可能保持其原來的性狀和活力，使之不死亡、不衰退、不變異，且不被污染，以達到便于隨時供應優(yōu)良菌種給生產和科研進行研究、交換和使用。第3頁/共14頁菌種保藏機構美國典型菌種收藏所（ATCC）美國農業(yè)部北方地區(qū)研究室（NRRL）日本大阪發(fā)酵研究所（IFO）荷蘭微生物菌種保藏中心（CBS，1906年）法國里昂巴斯德研究所（IPL）英國國家典型菌種保藏所（NCTC）第4頁/共14頁中國微生物菌種保藏管理委員會CCCCM1、普通微生物菌種保藏管理中心中科院北微所（AS）：真菌、細菌武漢病毒所（AS-IV）：病毒2、農業(yè)微生物菌種農科院土肥所（ISF）3、工業(yè)微生物菌種食品發(fā)酵所（IFFI）4、醫(yī)學微生物菌種醫(yī)科院皮研所（ID）：真菌衛(wèi)生部檢定所（NICPBP）：細菌醫(yī)科院病毒所（IV）：病毒5、抗生素菌種醫(yī)科院醫(yī)藥生物技術所（IA）四川抗研所（SIA）：新抗菌種華藥抗研所（IANP）：生產菌種6、獸醫(yī)微生物菌種農業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（CIVBP）中國典型培養(yǎng)物收藏中心（武漢大學）第5頁/共14頁一、菌種保藏的基本原理在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，但又不至于死亡，才能在一定的時間內使其不發(fā)生變異而又保持生活能力，從而達到保藏的目的。菌種保藏的基本原理是使微生物的代謝作用降至極低限度，使其處于不活潑的休眠狀態(tài)。微生物——典型菌種的優(yōu)良純種，最好是休眠體（芽孢）環(huán)境條件——低溫、干燥、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護劑或酸度中和劑等。第6頁/共14頁二、菌種保藏方法1、傳代培養(yǎng)法2、懸液法3、載體法4、真空干燥法5、冷凍法第7頁/共14頁1、傳代培養(yǎng)法此法使用最早，它是將要保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基（用于厭氧細菌）培養(yǎng)好后，置4℃存放，定期進行傳代培養(yǎng)、再存放。后來發(fā)展在斜面培養(yǎng)物上面覆蓋一層無菌的液體石蠟，一方面防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面石蠟層可將微生物與空氣隔離，減弱細胞的代謝作用，達到保藏菌種的目的。這種方法保藏菌種的時間不長，且傳代過多易使菌種的主要特性減退，甚至丟失。因此它只能作為短期存放菌種用。第8頁/共14頁2、懸液法這是一種將微生物細胞懸浮在一定的溶液中，包括蒸餾水、蔗糖、葡萄糖等糖液、磷酸緩沖液、食鹽水等，有的還使用稀瓊脂。懸液法操作簡便，效果較好。有些細菌、酵母菌用這種方法能保藏幾年甚至近十年的時間。第9頁/共14頁3、載體法該法是使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進行干燥。這種載體來源很廣，如土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠或濾紙片等。該法操作通常比較簡單，普通實驗室均可進行。特別是以濾紙片（條）作載體，細胞干燥后，可將含細菌的濾紙片或濾紙條裝入無菌的小袋封閉后放在信封中郵寄很方便。第10頁/共14頁4、真空干燥法這類方法包括冷凍真空干燥法和L-干燥法。冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經低溫預凍，然后在低溫狀態(tài)下進行減壓干燥。L-干燥法不需要低溫預凍樣品，只是使樣品維持在10~20℃范圍內進行真空干燥。第11頁/共14頁5、冷凍法這是一種使樣品始終放在低溫環(huán)境下的保藏方法，包括低溫法（-80~-70℃）和液氮法（-196℃）。溶液損傷——降溫速度過慢，胞外溶液中水分大量結冰，溶液的濃度提高，胞內的水分大量向外滲透，導致細胞劇烈收縮，造成細胞損傷。胞內冰損傷——冷卻速度過快，胞內的水分來不及通過細胞膜滲出，胞內的溶液過冷而結冰，細胞的體積膨大，最后導致細胞破裂。因此，控制降溫速率是冷凍微生物細胞十分重要的步驟。第12頁/共14頁（1）保護劑：亦稱分散劑，可以使細胞經低溫冷凍時減少冰晶的形成。甘油、二甲亞砜、谷氨酸鈉、糖類、可溶性淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、血清、脫脂奶等。二甲亞砜對微生物細胞有一定的毒害，一