實(shí)驗(yàn)動物課件 5.實(shí)驗(yàn)動物微生物寄生蟲學(xué)2018.10.16

實(shí)驗(yàn)動物的微生物學(xué)質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)動物中心李曉玲2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)28名師生感染布魯氏菌病3“布魯氏菌病”

是人獸共患性全身傳染病是乙類職業(yè)病許多行業(yè)對布魯氏菌病患者都有著嚴(yán)格的限制。

原因

使用未經(jīng)檢疫的、微生物等級不達(dá)標(biāo)的動物

主要內(nèi)容一.實(shí)驗(yàn)動物的微生物學(xué)控制分類二.實(shí)驗(yàn)動物的微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)質(zhì)量監(jiān)測5

一.實(shí)驗(yàn)動物的微生物學(xué)控制分類

6（一）普通動物（Conventionalanimal，CV）（二）清潔動物（Cleananimal，CL）（三）無特定病原體動物（Specificpathogenfreeanimal，SPF)（四）無菌動物（Germfreeanimal，GF）悉生動物、無抗原動物相關(guān)動物7實(shí)驗(yàn)動物微生物等級

小鼠清潔級SPF級無菌級大鼠清潔級SPF級無菌級地鼠普通級清潔級SPF級無菌級豚鼠普通級清潔級SPF級無菌級家兔普通級清潔級SPF級無菌級犬普通級SPF級猴普通級SPF級8（一）普通動物（Conventionalanimal，簡稱CV動物）1.定義：不帶有動物烈性傳染病和人獸共患病病原體的動物。

2.普通級動物：

豚鼠、地鼠、兔、犬、豬、猴

9（一）普通動物3.飼養(yǎng)條件：普通開放環(huán)境4.來源：經(jīng)微生物學(xué)檢查不帶有上述病原體的動物，或SPF動物降級。10

（一）普通動物

5.應(yīng)用：

（1）可適用于生物醫(yī)學(xué)中教學(xué)示教之用；（2）為探索方法而從事的預(yù)試驗(yàn)之用

11

（一）普通動物

6.特點(diǎn)：

（1）微生物學(xué)特點(diǎn)：不攜帶所規(guī)定的人獸共患病病原和動物烈性傳染病的病原。

（2）飼養(yǎng)管理：飼養(yǎng)于開放系統(tǒng)。但對溫濕度，飼料，墊料，飲水等仍有控制。

（3）生理學(xué)特點(diǎn)：外觀健康，飲食排泄正常，無異常分泌物，無臨床癥狀，臟器無眼觀病灶。12（二）清潔動物（Cleananimal，簡稱CL動物）1.定義：微生物控制級別介于SPF動物和普通動物之間的動物。除普通級動物應(yīng)排除的病原外，不攜帶對動物危害大和對科學(xué)研究干擾大的病原。

2.常用的清潔級小動物：如大鼠、小鼠、地鼠、豚鼠、兔等。13（二）清潔動物3.飼養(yǎng)條件：屏障系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)或IVC系統(tǒng)中。4.來源：SPF動物或無菌動物。5.應(yīng)用：大多數(shù)教學(xué)和科研實(shí)驗(yàn)。洗刷消毒間污染走廊飼養(yǎng)室消毒后室儲物間飼養(yǎng)室飼養(yǎng)室清潔走廊檢疫室飼養(yǎng)室飼養(yǎng)室飼養(yǎng)室風(fēng)淋二更接收間淋浴污染走廊一更外走廊15

（二）清潔動物

6.特點(diǎn)—微生物特點(diǎn)

（1）比普通級動物排除的微生物和寄生蟲多；

（2）比SPF動物排除的少；（3）肉眼觀察及尸體解剖時(shí)均應(yīng)無病變。16

（二）清潔動物

6.特點(diǎn)—飼養(yǎng)管理

（1）飼養(yǎng)于屏障環(huán)境；（2）飼料、墊料、飲用水、籠器具等都經(jīng)消毒滅菌處理；（3）工作人員需換滅菌工作服、鞋、帽、口罩等進(jìn)入動物室進(jìn)行操作。17（三）無特定病原體動物（Specificpathogenfreeanimal，簡稱SPF動物)

1.定義：指不攜帶普通動物、清潔動物應(yīng)排除的病原外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對科學(xué)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原。

2.常用的SPF級動物：大鼠、小鼠

3.飼養(yǎng)條件：必須飼養(yǎng)在屏障系統(tǒng)中。

18

（三）無特定病原體動物

4.最初來源：無菌動物或悉生動物。

5.應(yīng)用：適用于所有科研實(shí)驗(yàn)。19（三）無特定病原體動物

6.特點(diǎn)：

（1）微生物特點(diǎn)：除一、二級動物應(yīng)排除的病原體外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對實(shí)驗(yàn)研究干擾大的病原。（2）來源：為無菌動物。（3）飼養(yǎng)管理：屏障系統(tǒng)。

20（四）無菌動物（Germfreeanimal，簡稱GF）

1.定義：指用現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)手段檢測，動物的體表體內(nèi)檢測不到其它生命體（包括一切微生物和寄生蟲）的實(shí)驗(yàn)動物。

2.飼養(yǎng)條件：隔離系統(tǒng)

3.來源：第一代源于無菌剖腹產(chǎn)術(shù)，人工哺乳；以后通過交配繁殖或無菌剖腹產(chǎn)術(shù)，保姆鼠代奶擴(kuò)群。21

無菌隔離器22（四）無菌動物4.特點(diǎn)：

（1）微生物特點(diǎn)：

在動物體內(nèi)外任何部位均檢不出任何活的微生物和寄生蟲。

（2）形態(tài)學(xué)特點(diǎn)—消化系統(tǒng)

1）盲腸肥大、易盲腸扭轉(zhuǎn)

2）盲腸內(nèi)容物含水量、可溶性蛋白質(zhì)等較多。23（四）無菌動物

4.特點(diǎn)：

（2）形態(tài)學(xué)特點(diǎn)—血液循環(huán)系統(tǒng)

1）心臟變??；

2）白細(xì)胞數(shù)變少，波動范圍小。

24（四）無菌動物

4.特點(diǎn)：

（2）形態(tài)學(xué)特點(diǎn)—免疫系統(tǒng)

1）胸腺、淋巴組織、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)育不良，脾臟小，無二級濾泡；

2）免疫功能基本處于原始狀態(tài)。25

（四）無菌動物

4.特點(diǎn)：

（3）生理學(xué)特點(diǎn)—免疫功能

1）血清中IgG、IgM水平低，幾乎不存在丙種球蛋白和特異性抗體；

2）免疫應(yīng)答速度慢，過敏反應(yīng)、對異體移植物的排斥反應(yīng)以及自身免疫現(xiàn)象消失或減弱。26（四）無菌動物

4.特點(diǎn)：

（3）生理學(xué)特點(diǎn)—生長率

1）無菌鳥類生長率高于同種普通鳥;

2）無菌大、小鼠與普通鼠差不多;

3）無菌豚鼠和無菌兔比普通的慢。27

（四）無菌動物

4.特點(diǎn)：

（3）生理學(xué)特點(diǎn)—生殖

1）無菌大、小鼠略高于普通大小鼠；

2）豚鼠和兔繁殖能力比普通級低。28

（四）無菌動物

4.特點(diǎn)：

（3）生理學(xué)特點(diǎn)—代謝和營養(yǎng)

1）無菌動物血中含氮量少，腸管對水的吸收率低，代謝周期比普通動物長。

2）體內(nèi)不能合成維生素B和K。29

（四）無菌動物

4.特點(diǎn)：

（3）生理學(xué)特點(diǎn)—抗輻射能力和壽命

1）無菌動物抗輻射能力強(qiáng)。

2）無菌動物的壽命普遍長于普通動物。30（四）無菌動物

5.應(yīng)用：

（5）老年病學(xué)研究；（6）心血管疾病研究；（7）毒理學(xué)研究；（8）腫瘤研究等。

（1）微生物研究；（2）免疫學(xué)研究；（3）放射醫(yī)學(xué)研究；（4）營養(yǎng)、代謝研究；31

悉生動物（Gnotobioticanimal，簡稱GN）

1.定義：又稱已知菌動物，指動物體內(nèi)帶有明確的微生物種類的動物。

2.分類：根據(jù)植入無菌動物體內(nèi)菌落數(shù)的不同，分為：單菌動物、雙菌動物、三菌動物、多菌動物。

32

悉生動物

3.飼養(yǎng)條件：無菌隔離器內(nèi)

4.來源：人為將已知的微生物投給無菌動物，使其體內(nèi)帶有已知菌。

33

悉生動物

5.特點(diǎn)：

（1）微生物特點(diǎn)：體內(nèi)外攜帶有已知微生物；

（2）來源：無菌動物植入微生物→動物與微生物的共生復(fù)合體；

（3）飼養(yǎng)管理：隔離系統(tǒng)。34悉生動物

5.特點(diǎn)：（4）與無菌動物比較

1）可以合成維生素和氨基酸，不會發(fā)生維生素缺乏癥；

2）抵抗力、生活力較強(qiáng)，易于飼養(yǎng)管理，部分實(shí)驗(yàn)中可代替無菌動物。35悉生動物

6.應(yīng)用：

（1）微生物學(xué)研究；（2）抗體制備研究；（3）微生物和寄生蟲相互關(guān)系的研究等。36

無抗原動物1.定義：是未經(jīng)過環(huán)境、飲食或人為抗原刺激，免疫系統(tǒng)未被激活的動物。2.源于無菌動物。

3.特點(diǎn)：沒有接受任何抗原物質(zhì)刺激，體內(nèi)的IgG水平非常低，甚至無法檢出。

4.飼養(yǎng)管理：無抗原環(huán)境中飼喂無抗原飼料和無抗原水37實(shí)驗(yàn)動物微生物等級與飼養(yǎng)設(shè)施要求微生物等級飼養(yǎng)設(shè)施普通級動物開放系統(tǒng)清潔級動物屏障系統(tǒng)SPF動物屏障系統(tǒng)無菌動物隔離器38

實(shí)驗(yàn)動物的四個“標(biāo)準(zhǔn)化”1.遺傳控制標(biāo)準(zhǔn)化2.微生物控制標(biāo)準(zhǔn)化3.環(huán)境設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)化4.飼料營養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化

391.實(shí)驗(yàn)動物的疾病和死亡2.動物繁殖率下降3.營養(yǎng)不良

4.干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.人獸共患病6.影響生物制品的質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)動物感染微生物、寄生蟲的危害40實(shí)驗(yàn)動物感染微生物、寄生蟲的危害

7.寄生蟲對實(shí)驗(yàn)動物的影響

（1）掠奪宿主營養(yǎng)；（2）體外寄生蟲對動物的騷擾；（3）對宿主機(jī)體產(chǎn)生機(jī)械性損傷;（4）產(chǎn)生毒性作用；（5）對宿主生理、生化和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響。41污染源實(shí)驗(yàn)動物寵物工作人員飼養(yǎng)材料設(shè)備生物材料42二.實(shí)驗(yàn)動物的微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)質(zhì)量監(jiān)測43（一）監(jiān)測意義（二）監(jiān)測方法（三）實(shí)驗(yàn)動物的衛(wèi)生防疫與隔離措施主要內(nèi)容44（一）監(jiān)測意義

1.保證工作人員的身體健康和保證動物質(zhì)量。

2.保證動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

45（二）監(jiān)測方法

根據(jù)國標(biāo)定期監(jiān)測實(shí)驗(yàn)動物的微生物、寄生蟲：

《實(shí)驗(yàn)動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測》(GB14922.2-2011）《實(shí)驗(yàn)動物寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測》(GB14922.1-2001）

46（二）監(jiān)測方法

1.檢測項(xiàng)目

分必須檢測項(xiàng)目和必要時(shí)檢測項(xiàng)目。

必須檢測項(xiàng)目：實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量評價(jià)時(shí)必須檢測的項(xiàng)目。

必要時(shí)檢測項(xiàng)目：（1）從國外引進(jìn)實(shí)驗(yàn)動物時(shí)；

（2）懷疑有本病流行時(shí)；

（3）申請實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證和實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證時(shí)必須檢測的項(xiàng)目。47

1.檢測項(xiàng)目484950（二）監(jiān)測方法

2.檢測頻率

（1）普通級動物：每三個月至少檢測動物一次。

（2）清潔級動物：每三個月至少檢測動物一次。

（3）無特定病原體動物：每三個月至少檢測動物一次。

（4）無菌動物：每年檢測動物一次。每2-4周檢查一次動物的生活環(huán)境標(biāo)本和糞便標(biāo)本。

51（二）監(jiān)測方法

3.微生物檢測程序

動物→編號→外觀檢查→麻醉→皮膚取樣（真菌檢查）→取血（分離血清，檢查病毒抗體或其它病原的抗體）→無菌解剖（氣管分泌物、腸內(nèi)容物、臟器分離細(xì)菌）→檢測→檢測報(bào)告注：具體分項(xiàng)檢測方法參照GB/T14926.1~14926.2452（二）監(jiān)測方法

寄生蟲檢測程序

動物→編號→外觀檢查→麻醉→拔毛或梳毛（體外寄生蟲檢測）→取血（弓形蟲等項(xiàng)）→擠壓或刀片刮去皮層物取樣（體外寄生蟲）→解剖，臟器、腸內(nèi)容物、糞便等取樣（體內(nèi)寄生蟲）→檢測→檢測報(bào)告注：具體分項(xiàng)檢測方法參照GB/T18448.1~18448.10-201153（二）監(jiān)測方法

4.取樣要求

（1）選擇成年動物用于檢測。（2）取樣數(shù)量：根據(jù)動物多少而不同，取樣數(shù)量見表。群體大小/只

取樣數(shù)量

＜100≥5只100-500≥10只

＞500≥20只

微生物檢測取樣數(shù)量群體大小/只

取樣數(shù)量

＜100＞5只100-500＞10只

＞500＞20只

寄生蟲檢測取樣數(shù)量54（二）監(jiān)測方法

5.取樣方法

隨機(jī)抽樣法：宜在動物群中不同方位隨機(jī)采取成年動物，選擇至少4個不同的位置采集樣品（例如四角和中央）。

哨兵動物法：將經(jīng)過檢測符合質(zhì)量要求的同種系實(shí)驗(yàn)動物（即哨兵動物）放入群內(nèi)，不時(shí)條換位置，飼養(yǎng)一定時(shí)間后解剖檢查抗體或病原。

55（二）監(jiān)測方法

6.送檢及結(jié)果判定

（1）動物送檢容器：按動物級別要求編號和標(biāo)記，包裝完好；

（2）附送檢單：送檢動物品種品系、級別、數(shù)量和檢測項(xiàng)目。

（3）在檢測的各等級動物中，如有一只動物的一項(xiàng)指標(biāo)不符合該等級標(biāo)準(zhǔn)要求，則判為不符合該等級標(biāo)準(zhǔn)。

56（二）監(jiān)測方法

7.病毒監(jiān)測細(xì)菌監(jiān)測真菌監(jiān)測寄生蟲監(jiān)測監(jiān)測方法57（二）監(jiān)測方法

實(shí)驗(yàn)動物的微生物、寄生蟲檢測具體操作方法詳見《國家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動物微生物學(xué)檢測方法》（GB/T14926.1-14926.64）和《國家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動物寄生蟲學(xué)的檢測方法》(GB/T18448.1～18448.10)。

細(xì)菌、真菌和寄生蟲以病原學(xué)檢測為主，血清學(xué)檢測為輔；但有些病原體也逐漸使用血清學(xué)方法檢測，如支原體、泰澤氏病原體、弓形體等。

病毒的常規(guī)定期檢測以血清學(xué)為主，而疾病診斷則以病原學(xué)檢測為主。58（二）監(jiān)測方法

（1）病毒監(jiān)測

1）血清學(xué)監(jiān)測—適用于實(shí)驗(yàn)動物的經(jīng)常性檢查和疫情普查。常用的方法有：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)等。

2）病原學(xué)檢測—適用于動物群中有疾病流行，需檢出病毒或確診病毒存在。常用的方法有：病毒分離與鑒定、抗體產(chǎn)生試驗(yàn)等。59（二）監(jiān)測方法

（2）細(xì)菌監(jiān)測

1）病原菌的分離與培養(yǎng)為主；

2）血清學(xué)檢查＋分離培養(yǎng)結(jié)果（如鼠傷寒沙門氏菌）；

3）病變組織壓片、鏡檢+病理檢查（不能在培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌，如泰澤氏菌）。

60（二）監(jiān)測方法

（3）真菌監(jiān)測：分離培養(yǎng)法

1）結(jié)合菌落特點(diǎn)和鏡下染色檢查可進(jìn)行種屬鑒定；

2）有時(shí)需借助生化和免疫學(xué)方法進(jìn)行最后診斷。61（二）監(jiān)測方法

（4）寄生蟲監(jiān)測

1）體外寄生蟲及蟲卵：肉眼觀察法等，主要適用于虱、螨等節(jié)肢動物；

2）腸道寄生蟲：采集動物糞便，鏡下觀察有無可見蟲體；

3）血液寄生蟲：采血，鏡檢；

4）組織內(nèi)寄生蟲：疑似感染部位組織壓片、切片檢查。62（二）監(jiān)測方法

8.影響檢測結(jié)果的因素：

（1）取材數(shù)量

（2）取材頻率（3）取材對象（動物年齡、疾病的早晚期等）

（4）方法學(xué)的選擇（病原學(xué)或血清學(xué)檢測）

（5）方法學(xué)的敏感性等。63（三）實(shí)驗(yàn)動物的衛(wèi)生防疫與隔離措施

1.平時(shí)的預(yù)防措施

（1）飼養(yǎng)人員應(yīng)嚴(yán)格按照不同等級實(shí)驗(yàn)動物的飼養(yǎng)管理制度、衛(wèi)生防疫制度以及操作規(guī)程，認(rèn)真做好各項(xiàng)記錄，發(fā)現(xiàn)情況，及時(shí)報(bào)告。

（2）實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施周圍應(yīng)無傳染源，不得飼養(yǎng)非實(shí)驗(yàn)用家畜家禽，防止昆蟲及野生動物侵入。64（三）實(shí)驗(yàn)動物的衛(wèi)生防疫與隔離措施

1.平時(shí)的預(yù)防措施（3）堅(jiān)持平時(shí)衛(wèi)生消毒制度，降低環(huán)境設(shè)施中的病原體含量。（4）各類動物應(yīng)分室飼養(yǎng)，以防交叉感染。飼養(yǎng)室嚴(yán)禁非飼養(yǎng)人員出入和各類人員互串，購買或領(lǐng)用動物者不得進(jìn)入飼養(yǎng)室內(nèi)。65（三）實(shí)驗(yàn)動物的衛(wèi)生防疫與隔離措施

1.平時(shí)的預(yù)防措施

（5）飼料和墊料庫房應(yīng)保持干燥、通風(fēng)、無蟲、無鼠，飼料應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)。

（6）飼養(yǎng)人員和獸醫(yī)技術(shù)人員應(yīng)每年進(jìn)行健康檢查，患有傳染性疾病的人員不得從事實(shí)驗(yàn)動物工作。（7）不從疫區(qū)引進(jìn)實(shí)驗(yàn)動物及用具。66（三）實(shí)驗(yàn)動物的衛(wèi)生防疫與隔離措施

1.平時(shí)的預(yù)防措施

（8）動物質(zhì)量檢查：保種單位、生產(chǎn)單位要對飼養(yǎng)的動物定期進(jìn)行質(zhì)量檢查，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)更新種群。（9）動物免疫制度：對國家標(biāo)準(zhǔn)要求必須實(shí)施預(yù)防接種的實(shí)驗(yàn)動物要定期進(jìn)行免疫接種。67（三）實(shí)驗(yàn)動物的衛(wèi)生防疫與隔離措施

1.平時(shí)的預(yù)防措施

（10）隔離和無害化處理：嚴(yán)格防止野生動物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)動物室，對死亡動物進(jìn)行無害化處理。68（三）實(shí)驗(yàn)動物的衛(wèi)生防疫與隔離措施

2.發(fā)生疫病時(shí)的撲滅措施

（1）及時(shí)發(fā)現(xiàn)、診斷和向上級管理和防疫部門上報(bào)疫情，并通知鄰近單位做好預(yù)防工作。

（2）迅速隔離患病動物，污染的環(huán)境和器具緊急消毒。實(shí)驗(yàn)期間的動物應(yīng)停止實(shí)驗(yàn)或淘汰。69（三）實(shí)驗(yàn)動物的衛(wèi)生防疫與隔離措施

2.發(fā)生疫病時(shí)的撲滅措施

（3）若發(fā)生危害性大的疫病，如鼠痘、流行性出血熱等應(yīng)：采取隔離封鎖等綜合性措施、淘汰、焚燒全部動物、對場地進(jìn)行徹底消毒、空廄后，方可解除隔離封鎖。

70（三）實(shí)驗(yàn)動物的衛(wèi)生防疫與隔離措施3.消毒措施

（1）預(yù)防性消毒：平時(shí)要定期對實(shí)驗(yàn)動物房、籠架具、飲水等進(jìn)行消毒，以達(dá)到預(yù)防的目的。

（2）隨時(shí)消毒：在發(fā)生傳染病時(shí)，為了及時(shí)消滅剛從患病動物體內(nèi)排出的病原體而采取的消毒措施。

（3）終末消毒：在患病動物解除隔離、痊愈或死亡后，為了消滅疫區(qū)內(nèi)可能殘留的病原體所進(jìn)行的全面徹底的大消毒。71（三）實(shí)驗(yàn)動物的衛(wèi)生防疫與隔離措施

4.隔離檢疫

（1）檢疫的主要目的：

1）預(yù)防實(shí)驗(yàn)群體發(fā)生傳染病；2）預(yù)防隱形感染對原有動物及工作人員造成危害；

3）使引入動物有適應(yīng)新環(huán)境的緩沖期，為設(shè)施環(huán)境、管理方法和飼料供應(yīng)的改進(jìn)提供依據(jù)。72（三）實(shí)驗(yàn)動物的衛(wèi)生防疫與隔離措施

4.隔離檢疫

（2）隔離：是把已知