分子診斷項(xiàng)目

分子診斷項(xiàng)目分子診斷項(xiàng)目第1頁2內(nèi)容1.HBV-DNA熒光定量PCR2.流式基礎(chǔ)應(yīng)用3.染色體核型分析分子診斷項(xiàng)目第2頁3HBVDNA熒光定量PCR分子診斷項(xiàng)目第3頁4 PCR技術(shù)介紹1985年美國PE-cetus企業(yè)人類遺傳研究室mullis等人創(chuàng)造了含有劃時(shí)代意義PCR技術(shù)，從而使大家夢寐以求體外擴(kuò)增核酸片段愿望成為現(xiàn)實(shí)。1988年P(guān)E-cetus企業(yè)推出了第一臺(tái)PCR熱循環(huán)儀，從而使PCR技術(shù)自動(dòng)化成為現(xiàn)實(shí)。Mullis出因其卓越貢獻(xiàn)與寡核苷酸基因定點(diǎn)誘變創(chuàng)造者M(jìn)ichael分享了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。伴隨PCR技術(shù)日臻成熟1995年出現(xiàn)熒光基因探針雜交定量PCR方法分子診斷項(xiàng)目第4頁5PCR基礎(chǔ)原理類似DNA體內(nèi)復(fù)制，以單鏈DNA為模板，利用DNA聚合酶依賴于模板特征，在附加一對寡核苷酸引物之間催化合成互補(bǔ)鏈過程。分子診斷項(xiàng)目第5頁6DNA合成必備要素DNAPolymerasedNTPssingle-strandedtemplateprimer分子診斷項(xiàng)目第6頁7定量PCR概念以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過對PCR終產(chǎn)物分析或PCR過程監(jiān)測，對PCR起始模板量定量分子診斷項(xiàng)目第7頁8常規(guī)PCR與定量PCR比較分子診斷項(xiàng)目第8頁9實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR進(jìn)程，最終經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。Ct（cyclethreshold)值定義：每個(gè)反應(yīng)管熒光信號(hào)抵達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷循環(huán)數(shù)。熒光閾值（threshold)缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差10倍，即：

threshold=10×SDcycle0-15分子診斷項(xiàng)目第9頁10Ct值與起始模板關(guān)系每個(gè)模板Ct值與該模板起始拷貝數(shù)對數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板數(shù)越多，Ct值越小，利用已知起始拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要取得未知樣品Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品起始拷貝數(shù)。分子診斷項(xiàng)目第10頁11熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線未知標(biāo)本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target38分子診斷項(xiàng)目第11頁12熒光檢測模式（1）SYBRGreenI染料（2）水解探針（Taqman）

（3）雜交探針（HybridizationProbes）（4）分子信標(biāo)（molecularbeacon)

發(fā)夾引物（sunriseprimer)

蝎狀引物（scorpionprimer)

復(fù)合探針（complexprobes)分子診斷項(xiàng)目第12頁13探針5'端標(biāo)識(shí)一個(gè)熒光基團(tuán)，3'標(biāo)識(shí)另一個(gè)熒光基團(tuán)。5'端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近3’端熒光淬滅基團(tuán)（FRET），正常情況下檢測不到該探針5'端熒光基團(tuán)發(fā)出熒光信號(hào)。Taqman探針原理分子診斷項(xiàng)目第13頁14當(dāng)溶液中模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在引物介導(dǎo)下，Taq酶沿模板向前合成子鏈，當(dāng)延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈置換；Taqman探針原理分子診斷項(xiàng)目第14頁15Taqman探針原理Taq酶5‘—3’外切酶活性將探針5‘端連接熒光基團(tuán)從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3’端熒光淬滅基團(tuán)屏蔽，發(fā)出熒光，熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物數(shù)量成百分比。所以依據(jù)PCR反應(yīng)液熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板數(shù)量。分子診斷項(xiàng)目第15頁16定量PCR在乙肝檢測中意義1.判斷疾病嚴(yán)重程度和傳染性2.PCR結(jié)果與血清免疫學(xué)結(jié)果綜合評價(jià)3.觀察抗病毒藥品療效，指導(dǎo)藥品用量4.獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸篩查及早期診療5.預(yù)測病情、判斷預(yù)后6.器官移植、母嬰垂直傳輸分子診斷項(xiàng)目第16頁17分子診斷項(xiàng)目第17頁18標(biāo)本留取及檢測步驟標(biāo)本：靜脈血3ml，黃色蓋試管。標(biāo)本防止溶血和脂血。檢測步驟：1.反應(yīng)液配制

2.核酸提取

3.核酸擴(kuò)增結(jié)果分析：采取樣點(diǎn)擬正當(dāng)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到病毒拷貝或IU/ML。分子診斷項(xiàng)目第18頁191.分區(qū)操作：PCR含有超敏感性，所以在檢測過程中應(yīng)分區(qū)操作，即分為試劑準(zhǔn)備區(qū)，樣品處理區(qū)，PCR擴(kuò)增區(qū)。2.試驗(yàn)前試驗(yàn)室應(yīng)使用紫外消毒最少30分鐘。3.操作時(shí)戴一次性手套，加樣頭要求及時(shí)更換，吸液時(shí)防止飛濺。注意事項(xiàng)分子診斷項(xiàng)目第19頁204.天天試驗(yàn)前，在廢物缸內(nèi)套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸鈉液，試驗(yàn)時(shí)將吸頭、離心管丟入廢液缸中浸泡。5.全部試劑試驗(yàn)前充分融化，防止重復(fù)凍融。6.每次PCR反應(yīng)均應(yīng)設(shè)置陰陽性對照。注意事項(xiàng)分子診斷項(xiàng)目第20頁21

流式基礎(chǔ)應(yīng)用

分子診斷項(xiàng)目第21頁22流式細(xì)胞術(shù)概念流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一個(gè)能夠快速、準(zhǔn)確、客觀，而且能夠同時(shí)檢測快速直線流動(dòng)狀態(tài)中單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）多項(xiàng)特征，并加以定量技術(shù)，同時(shí)能夠?qū)μ囟ㄈ后w加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等研究微粒特征包含各種物理及生物學(xué)特征分子診斷項(xiàng)目第22頁23流式細(xì)胞儀檢測范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面面積核漿百分比DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞功效細(xì)胞表面/胞漿/核特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體分子診斷項(xiàng)目第23頁24散射光信號(hào)RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

細(xì)胞相對大小及其表面積

側(cè)向角散射光（SSC,SideScatter）

細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器相對復(fù)雜性分子診斷項(xiàng)目第24頁25外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖

（紅細(xì)胞溶解后）分子診斷項(xiàng)目第25頁26熒光信號(hào)使用熒光標(biāo)識(shí)單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號(hào)強(qiáng)弱，反應(yīng)了細(xì)胞抗原表示含量分子診斷項(xiàng)目第26頁27數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)顯示:

直方圖(Histogram)

二維點(diǎn)圖(DotPlot)

等高線圖(ContourPlot)

密度圖(Density)

三維圖（3DPlot）分子診斷項(xiàng)目第27頁28流式臨床應(yīng)用淋巴細(xì)胞亞群分析白血病和淋巴瘤免疫分型腫瘤細(xì)胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞移植免疫狀態(tài)監(jiān)測干細(xì)胞計(jì)數(shù)陣發(fā)性血紅蛋白尿HLA-B27檢驗(yàn)血小板功效及相關(guān)疾病HIV免疫分型，CD4絕對計(jì)數(shù)分子診斷項(xiàng)目第28頁29淋巴細(xì)胞亞群分析使用經(jīng)熒光素標(biāo)識(shí)特異單克隆抗體，進(jìn)行多色染色，同時(shí)分析淋巴細(xì)胞膜上各種白細(xì)胞分化抗原（CD分子）表示，能夠?qū)⒘馨图?xì)胞亞群區(qū)分開，進(jìn)行定性分析各淋巴細(xì)胞亞群百分含量淋巴細(xì)胞亞群絕對計(jì)數(shù)，進(jìn)行定量分析分子診斷項(xiàng)目第29頁30依據(jù)功效，淋巴細(xì)胞主要分為B淋巴細(xì)胞（CD19+），與體液免疫相關(guān)T淋巴細(xì)胞（CD3+），與細(xì)胞免疫相關(guān)總T和總B能夠用來判斷一些免疫缺點(diǎn)和本身免疫性疾病NK細(xì)胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功效，能夠介導(dǎo)對一些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞細(xì)胞毒性作用。分子診斷項(xiàng)目第30頁31依據(jù)CD4、CD8表示，T淋巴細(xì)胞又分為T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+），即Th/TiT抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞（CD3+CD8+）,即Ts/TcTh/Ts比值可用于評價(jià)本身免疫失調(diào)、被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺點(diǎn)病人免疫狀態(tài)分子診斷項(xiàng)目第31頁32臨床意義診療原發(fā)性免疫缺點(diǎn)病（如先天性無r球蛋白血癥）或繼發(fā)性免疫缺點(diǎn)病（如AIDS）造血干細(xì)胞移植后免疫重建（6個(gè)月NK；9個(gè)月T、B）Th/Ts：機(jī)體免疫功效亢進(jìn)：本身免疫性疾病，如SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等（治療有效恢復(fù)正常）Th/Ts：機(jī)體免疫功效低下：AIDS、病毒感染、慢性活動(dòng)性肝炎和活動(dòng)性肝硬化、再障、結(jié)核、腫瘤等分子診斷項(xiàng)目第32頁33臨床意義移植后動(dòng)態(tài)免疫監(jiān)測：急排臨床癥狀出現(xiàn)前1-5天，活化T和Th/Ts連續(xù)，>1.2預(yù)示急排；Th/Ts連續(xù)表明可能感染，比值<1.08，可能性大，<0.2應(yīng)停用免疫抑制劑；實(shí)體腫瘤療效和病人免疫狀態(tài)觀察治療前常伴T

、Th/Ts，放/化療有效可恢復(fù)；淋巴細(xì)胞免疫表型正常或治療后能恢復(fù)正常者預(yù)后常很好；探索疾病發(fā)病機(jī)理、進(jìn)程和預(yù)后（炎癥、腫瘤）分子診斷項(xiàng)目第33頁34淋巴細(xì)胞亞群雙色分析分子診斷項(xiàng)目第34頁35先天性無r球蛋白血癥分子診斷項(xiàng)目第35頁36淋巴細(xì)胞亞群雙色分析分子診斷項(xiàng)目第36頁37HLA-B27☆HLA-B27是MHCI類抗原，在有核細(xì)胞上廣泛表示

HLA-B27表示與強(qiáng)直性脊柱炎高度相關(guān)，超出90%強(qiáng)直性脊柱炎患者HLA-B27陽性。其它，如Reiters綜和癥陽性率70-90%，銀屑病性關(guān)節(jié)炎陽性率50-60%，葡萄膜炎陽性率40-50%☆檢測采取全血，無需分離淋巴細(xì)胞，操作簡單，能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地分析HLA-B27?！罱Y(jié)果匯報(bào)檢測平均熒光強(qiáng)度，依據(jù)界值判定，得到陰性/陽性結(jié)果。試驗(yàn)靈敏度為100%，特異性為97.5%。分子診斷項(xiàng)目第37頁38流式細(xì)胞儀應(yīng)用（血液）

白血病和淋巴瘤免疫分型造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)陣發(fā)性血紅蛋白尿（PNH）診療網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)血小板分析血小板膜糖蛋白分子表示血小板活化網(wǎng)織血小板分析分子診斷項(xiàng)目第38頁39流式細(xì)胞儀應(yīng)用（腫瘤）

細(xì)胞周期和倍體分析

腫瘤相關(guān)基因表示研究抗腫瘤藥品作用機(jī)制研究放療/化療療效研究

多藥耐藥基因研究細(xì)胞凋亡分析凋亡細(xì)胞分析凋亡相關(guān)蛋白分析分子診斷項(xiàng)目第39頁40流式標(biāo)本留取

紫色蓋試管，EDTA抗凝血或骨髓1-2ml。不能有凝塊。單細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)不少于106個(gè)。分子診斷項(xiàng)目第40頁41

染色體核型分析分子診斷項(xiàng)目第41頁42基礎(chǔ)概念染色體核型：指一個(gè)物種所特有染色體數(shù)目和每一條染色體形態(tài)特征。------人類體細(xì)胞中共有23對染色體，22對常染色體，一對性染色體。核型分析：將待測細(xì)胞核型進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)特征分析過程稱核型分析。如正常女性核型：46,XX正常男性核型：46，XY。核型模式圖：是指將一個(gè)染色體組全部染色體逐一按其特征繪制下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來圖像。分子診斷項(xiàng)目第42頁43染色體模式圖分子診斷項(xiàng)目第43頁44人類23對染色體分子診斷項(xiàng)目第44頁45分子診斷項(xiàng)目第45頁46染色體編號(hào)(人X染色體)記述一特定帶時(shí)，需要寫明4個(gè)內(nèi)容：染色體號(hào)，長短臂，區(qū)號(hào)序和帶號(hào)序。這些內(nèi)容按次序?qū)懀挥瞄g隔或加標(biāo)點(diǎn)。假如某一帶被再細(xì)分，在原帶號(hào)數(shù)后加一小數(shù)點(diǎn)，編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)仍按從著絲粒往臂端序貫編號(hào)。如1p31.2代表一號(hào)染色體短臂3區(qū)1帶第2亞帶分子診斷項(xiàng)目第46頁47染色體標(biāo)本常規(guī)制備

方法：中期染色體G帶顯色原理：采取秋水仙素處理培養(yǎng)細(xì)胞，使細(xì)胞停留在分裂中期，再用低滲液處理細(xì)胞，使細(xì)胞脹大，以進(jìn)行染色體制片。G-帶是標(biāo)本片經(jīng)過預(yù)處理后，用Giemsa染色顯示帶紋。分子診斷項(xiàng)目第47頁48操作步驟

細(xì)胞培養(yǎng)：

細(xì)胞培養(yǎng)液5mL（含植物凝血素），加0.3mL肝素抗凝全血37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)68～72小時(shí)。收獲細(xì)胞：

終止培養(yǎng)前1～1.5小時(shí)加入秋水仙素。

制片：低滲-預(yù)固定-固定-滴片-干燥老化

G-顯帶，圖像分析：胰酶消化，

Giemsa染色，采集圖像，分析20-30個(gè)中期分裂相分子診斷項(xiàng)目第48頁49核型描述首先列出染色體總數(shù)，然后是性染色體組成，接著列出異常染色體數(shù)目或形態(tài)。以下統(tǒng)一命名符號(hào)：A-G染色體組名稱1-22染色體編號(hào)X,Y性染色體del缺失der結(jié)構(gòu)重排染色體dup重復(fù)inv倒位t易位+/-在染色體符號(hào)前表示染色體增加或降低，在染色體符號(hào)后表示染色體多出或缺乏一個(gè)別分子診斷項(xiàng)目第49頁50檢驗(yàn)適應(yīng)癥及意義生殖功效障礙

在不孕癥、多發(fā)性流產(chǎn)和畸胎等有生殖功效障礙婦夫中最少有7%~10%是染色體異常攜帶者。常見有染色體結(jié)構(gòu)異常如平衡易位和倒位以及數(shù)量異常如因?yàn)榕陨僖粭lX染色體造成45，XO，或多一條Y染色體造成47，XXY。平衡易位和倒位因?yàn)闊o基因丟失，攜帶者本身常并不發(fā)病，卻可因其生殖細(xì)胞染色體異常而造成不孕癥、流產(chǎn)和畸胎等生殖功效障礙。性染色體數(shù)目異常除可造成不孕外，還常出現(xiàn)第二性征異常。

分