核酸發(fā)酵專題知識講座

核酸發(fā)酵專題知識講座核酸發(fā)酵專題知識講座第1頁核苷酸Nucleotide

由嘌呤堿或嘧啶堿、核糖或脫氧核糖以及磷酸三種物質(zhì)組成化合物。戊糖與堿基合成核苷，核苷與磷酸合成核苷酸，4種核苷酸組成核酸。依據(jù)糖不一樣，核苷酸有核糖核苷酸及脫氧核苷酸兩類。依據(jù)堿基不一樣，又有腺嘌呤核苷酸（腺苷酸，AMP）、鳥嘌呤核苷酸（鳥苷酸，GMP）、胞嘧啶核苷酸（胞苷酸，CMP）、尿嘧啶核苷酸（尿苷酸，UMP）、胸腺嘧啶核苷酸（胸苷酸，TMP）及次黃嘌呤核苷酸（肌苷酸，IMP）等。許多單核苷酸也含有各種主要生物學(xué)功效，如與能量代謝相關(guān)三磷酸腺苷（ATP）、脫氫輔酶等。一些核苷酸類似物能干擾核苷酸代謝，可作為抗癌藥品?！?核酸類物質(zhì)概述核酸發(fā)酵專題知識講座第2頁嘌呤核苷酸結(jié)構(gòu)GMPAMPIMP核酸發(fā)酵專題知識講座第3頁嘧啶核苷酸結(jié)構(gòu)核酸發(fā)酵專題知識講座第4頁1、核酸類物質(zhì)生產(chǎn)現(xiàn)實狀況1868年，Miescher從濃血細(xì)胞細(xì)胞核中發(fā)覺核酸物質(zhì)。20世紀(jì)40年代對核酸分子結(jié)構(gòu)認(rèn)識及其在生命活動中作用有重大突破。1913年日本小玉新太郎發(fā)覺干松魚鮮味是因含有5′-肌苷酸而引發(fā)。1960年日本又發(fā)覺5′-鳥苷酸呈味效果，繼而發(fā)覺呈味核苷酸與谷氨酸鈉（味精）并用時，對谷氨酸鈉含有強(qiáng)烈助鮮效果。今后很快，日本對5′-肌苷酸和5′-鳥苷酸進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，80年代年產(chǎn)量已達(dá)4000噸左右。中國80年代后對核酸制品生產(chǎn)開展研究工作，年產(chǎn)5′-肌苷酸和5′-鳥苷酸能力為50～80噸。當(dāng)前預(yù)計年產(chǎn)量在300噸。核酸發(fā)酵專題知識講座第5頁核酸發(fā)酵專題知識講座第6頁2、核酸類產(chǎn)品應(yīng)用食品添加劑：強(qiáng)化食品風(fēng)味，對咸、酸、苦、腥味等有消殺作用。以5‘-鳥苷酸（GMP)、5’-肌苷酸(IMP)和5‘-黃苷酸(XMP)及其二鈉鹽為代表。功效食品添加劑：嬰兒乳制品中添加，可增強(qiáng)嬰兒免疫功效，降低嬰兒腹瀉發(fā)生。多年來歐美、日本已在嬰兒奶粉中添加核苷酸(推薦用量為72mg/L)，這對于提升嬰兒免疫力十分有效（人奶與牛奶區(qū)分）。核酸發(fā)酵專題知識講座第7頁臨床治療藥品：嘌呤類似物8-氮鳥嘌呤和6-巰基嘌呤含有與抗生素類似功效，能夠抑制癌細(xì)胞生長；9-β-D阿拉伯呋喃糖基腺苷聚肌胞用于治療皰疹；阿糖胞苷、阿糖腺苷可治療急性白血病，含有抗癌和抗病毒功效。S-腺苷蛋氨酸及其鹽類用于治療帕金森氏癥、失眠并含有消炎鎮(zhèn)痛作用。藥品中間體：5‘-AMP可用于制造ATP、環(huán)AMP、S-腺苷甲硫氨酸等生化藥品產(chǎn)品，5’-CMP用于制造胞二磷膽堿、CTP、阿糖胞苷、聚肌胞等生化藥品；5'-UMP參加肝臟解毒物質(zhì)葡萄糖醛酸苷生化合成，含有主要生理作用，還可制造UTP、聚腺尿、UDP-葡萄糖等藥品。另外，核苷酸在農(nóng)業(yè)上也有良好應(yīng)用前景，用核苷酸及其衍生物進(jìn)行浸種、蘸根及噴霧，能夠提升農(nóng)作物產(chǎn)量。

核酸發(fā)酵專題知識講座第8頁名稱預(yù)計年產(chǎn)量(T/Y)用途5'-IMP(肌苷酸)3000食品添加劑5'-GMP(鳥苷酸)食品添加劑Inosine(肌苷)500心臟病胞苷二磷酸-膽堿4強(qiáng)心劑ATP(三磷酸腺苷)200肌肉營養(yǎng)不良FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸)少許生產(chǎn)肝或腎病NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)少許生產(chǎn)肝或腎病腺嘌呤少許生產(chǎn)白細(xì)胞降低腺苷少許生產(chǎn)冠狀缺點、咽炎、高血壓和動脈硬化5'-AMP(腺苷單磷酸)少許生產(chǎn)循環(huán)系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕病CAMP(環(huán)腺苷單磷酸)少許生產(chǎn)糖尿病、氣喘、癌癥乳清酸少許生產(chǎn)肝病6-蛋尿苷少許生產(chǎn)癌癥核酸發(fā)酵專題知識講座第9頁3、核酸類產(chǎn)品生產(chǎn)方法化學(xué)合成法：工藝復(fù)雜，設(shè)備條件要求高。核糖核酸（ribonucleicacid,簡稱RNA）水解法：酶法和化學(xué)用糖質(zhì)原料或亞硫酸制漿廢液等制備酵母菌體，從菌體中分離出RNA，水解RNA，得到5′-肌苷酸和5′-鳥苷酸。制備RNA原料，以酵母菌最為實用,產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母等酵母。工業(yè)生產(chǎn)上以2％熱食鹽水從其菌體中抽提出RNA最為簡便。RNA含量為干菌體10-15％。

核酸發(fā)酵專題知識講座第10頁核酸發(fā)酵專題知識講座第11頁用化學(xué)法水解RNA：若以氫氧化鈣作水解劑，則幾乎全部水解成核苷，分離所得到核苷，再用化學(xué)法使其磷酸化，可制得5′-肌苷酸、5′-鳥苷酸。酶法水解：采取5′-磷酸二酯酶,在橘青霉和金色鏈霉菌存在此種酶。培養(yǎng)這些菌株作為酶源。酶解RNA產(chǎn)物為5′-腺苷酸、5′-鳥苷酸、5′-胞苷酸、5′-尿苷酸混合物。還需采取米曲霉產(chǎn)生5′-腺苷酸脫氨酶將混合物中5′-腺苷酸脫氨生成5′-肌苷酸。

核酸發(fā)酵專題知識講座第12頁發(fā)酵法和化學(xué)法相結(jié)合方法：采取微生物發(fā)酵方法,生產(chǎn)核苷,再經(jīng)化學(xué)磷酸化，得到5′-肌苷酸和5′-鳥苷酸。采取枯草桿菌、產(chǎn)氨短桿菌、短小芽孢桿菌腺嘌呤營養(yǎng)缺點型發(fā)酵生產(chǎn)肌苷，再用化學(xué)法使其磷酸化得到5′-肌苷酸。亦可采取反抗菌素有抗性枯草桿菌突變株發(fā)酵生產(chǎn)鳥苷,一樣再經(jīng)化學(xué)磷酸化,生成5′-鳥苷酸。

核酸發(fā)酵專題知識講座第13頁直接發(fā)酵法：利用微生物發(fā)酵直接生產(chǎn)5′-肌苷酸、5′-黃苷酸。

以葡萄糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)5′-核苷酸，必須處理使所生成核苷酸透過細(xì)胞膜和不使生成核苷酸分解成核酸堿基和核苷問題，現(xiàn)依據(jù)代謝調(diào)控機(jī)制選育出菌株，已處理此問題。采取對錳離子不敏感產(chǎn)氨短桿菌突變株，直接發(fā)酵生產(chǎn)5′-肌苷酸，產(chǎn)率達(dá)20g/L。亦可采取產(chǎn)氨短桿菌突變株直接發(fā)酵高產(chǎn)5′-黃苷酸，進(jìn)而再由其它突變株或用酶法深入將5′-黃苷酸轉(zhuǎn)化為5′-鳥苷酸。核酸發(fā)酵專題知識講座第14頁4、核酸類產(chǎn)品生產(chǎn)菌種

發(fā)酵法生產(chǎn)核酸產(chǎn)生菌主要有：枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、產(chǎn)氨短桿菌及其變異株。

核酸發(fā)酵專題知識講座第15頁§2核酸類物質(zhì)代謝調(diào)控機(jī)制核酸發(fā)酵是在氨基酸發(fā)酵基礎(chǔ)上深入深化和發(fā)展代謝控制發(fā)酵。生物體內(nèi)大分子核酸是由單核苷酸作為原料聚合而成，所以，生物體必須先合成單核苷酸。單核苷酸有兩條完全不一樣合成路徑：⑴全合成路徑——由磷酸戊糖開始……；⑵補(bǔ)救路徑——由培養(yǎng)基中獲取……。核酸發(fā)酵專題知識講座第16頁一、核苷酸生物合成路徑采取同位素標(biāo)識法可知嘌呤環(huán)上各個元素起源：嘌呤環(huán)前體合成1分子IMP（肌苷酸）需用

1分子PRPP（磷酸核糖焦磷酸）

1分子Asp（天冬氨酸）

1分子Gly（甘氨酸）

2分子甲酸

1分子CO22分子NH3共消耗8分子ATP。核酸發(fā)酵專題知識講座第17頁1.嘌呤核苷酸全合成路徑（“從無到有”路徑）IMP－肌苷酸SAICAR－5-氨基-(N-琥珀基)代氨甲

AMP－腺苷酸酰咪唑核苷酸

GMP－鳥苷酸AICAR－5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸

XMP－黃苷酸PRPP－磷酸核糖焦磷酸

SAMP－腺苷琥珀酸PRA－5-磷酸核糖胺（次黃嘌呤核苷一磷酸）（腺嘌呤核苷一磷酸）（黃嘌呤核苷一磷酸）核酸發(fā)酵專題知識講座第18頁嘌呤核苷酸全合成路徑(1)5′-IMP生成（“從無到有”）：磷酸戊糖路徑四氫葉酸核酸發(fā)酵專題知識講座第19頁核酸發(fā)酵專題知識講座第20頁各種微生物合成IMP路徑是一樣，但從IMP分別生成AMP和GMP路徑不一樣。從IMP開始枯草桿菌以IMP為中心分出兩條環(huán)形路線，由此AMP與GMP能夠相互轉(zhuǎn)換；

產(chǎn)氨短桿菌分出兩條路線不是環(huán)形，而是單項分枝，AMP與GMP不能相互轉(zhuǎn)換合成IMP價值：深入合成AMP和GMP核酸發(fā)酵專題知識講座第21頁枯草芽孢桿菌嘌呤核苷酸全合成路徑(2)——AMP和GMP互變核酸發(fā)酵專題知識講座第22頁枯草桿菌嘌呤核苷酸生物合成路徑葡萄糖→→→5-磷酸核糖→（磷酸核糖焦磷酸）（5-磷酸核糖胺）（5-胺基-4-（N-琥珀基）-

代氨甲酰咪唑核苷酸）（5-胺基-4-氨甲酰咪唑核苷酸）肌苷酸黃苷酸鳥苷酸腺苷酸琥珀酰腺苷酸核酸發(fā)酵專題知識講座第23頁產(chǎn)氨短桿菌嘌呤核苷酸生物合成路徑核酸發(fā)酵專題知識講座第24頁2.嘧啶核苷酸全合成路徑谷氨酰胺酰胺基核酸發(fā)酵專題知識講座第25頁3.核苷酸生物合成補(bǔ)救路徑利用體內(nèi)游離嘌呤或嘌呤核苷，經(jīng)過簡單反應(yīng)，合成嘌呤核苷酸過程，稱為補(bǔ)救合成（或重新利用）路徑。定義補(bǔ)救合成生理意義補(bǔ)救合成節(jié)約從頭合成時能量和一些氨基酸消耗。體內(nèi)一些組織器官，如腦、骨髓等只能進(jìn)行補(bǔ)救合成。核酸發(fā)酵專題知識講座第26頁當(dāng)全合成受阻時，微生物可從培養(yǎng)基中取得完整嘌呤或嘧啶，和戊糖、磷酸經(jīng)過酶作用直接合成單核苷酸，所以稱為“補(bǔ)救路徑”。嘌呤堿基、核苷和核苷酸之間能經(jīng)過分段合成相互轉(zhuǎn)變。其中最主要反應(yīng)是：

堿基+PRPP5'-核苷酸+PPi核苷酸焦磷酸化酶核酸發(fā)酵專題知識講座第27頁腺嘌呤+

PRPPAMP+PPiAPRT次黃嘌呤+PRPPIMP+PPiHGPRT鳥嘌呤+

PRPPHGPRTGMP+PPi合成過程腺嘌呤核苷腺苷激酶ATPADPAMP腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶核酸發(fā)酵專題知識講座第28頁

嘧啶核苷酸補(bǔ)救合成嘧啶+

PRPP磷酸嘧啶核苷+PPi嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶尿嘧啶核苷+ATP尿苷激酶UMP+ADP

胸腺嘧啶核苷+ATP胸苷激酶TMP+ADP核酸發(fā)酵專題知識講座第29頁核苷酸補(bǔ)救合成路徑——嘌呤堿基、核苷和核苷酸相互轉(zhuǎn)換1'-磷酸核糖核酸發(fā)酵專題知識講座第30頁IMP合成系代謝控制及嘌呤核苷酸互變代謝控制二、嘌呤核苷酸代謝調(diào)整機(jī)制（枯草桿菌型）AMP脫氨酶SAMP裂解酶SAMP合成酶IMP脫氫酶GMP還原酶XMP氨化酶（5-磷酸核糖胺）AICAR（5-胺基-4-氨甲酰咪唑核苷酸）核酸發(fā)酵專題知識講座第31頁嘌呤核苷酸相互轉(zhuǎn)換系代謝控制調(diào)整位點A①②③④⑤⑥PR-ATP1-（5'-磷酸核糖基）

-三磷酸腺苷⑥AMP脫氨酶⑤SAMP裂解酶④SAMP合成酶③XMP氨化酶②GMP還原酶①IMP脫氫酶AICAR－5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸PRA-（5-磷酸核糖胺）磷酸核糖酰胺轉(zhuǎn)移酶核酸發(fā)酵專題知識講座第32頁嘌呤核苷酸從頭合成受到產(chǎn)物反饋控制。第一個控制點是由5-磷酸核糖轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岷颂墙沽姿幔≒RPP），由核糖磷酸焦磷酸激酶催化。PRPP合成酶受ADP、ATP、GTP、UTP抑制。第二個控制點是PRPP接收谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)變?yōu)?，-磷酸核糖胺（PRA），磷酸核糖酰胺轉(zhuǎn)移酶受到ADP、ATP、AMP、GTP、GDP、GMP反饋抑制。其中ADP、ATP、AMP結(jié)合在酶一個抑制位點，而GTP、GDP、GMP結(jié)合在另一抑制位點。核酸發(fā)酵專題知識講座第33頁IMP是AMP、GMP合成路徑分支點，每條分支路徑第一步反應(yīng)也是控制點，GMP反饋抑制IMP向XMP轉(zhuǎn)變，AMP則反饋抑制IMP轉(zhuǎn)變?yōu)橄佘甄晁?，從而預(yù)防生成過多AMP和GMP。GTP加速IMP向AMP轉(zhuǎn)變，而ATP則可促進(jìn)GMP生成。這么可使酰嘌呤和鳥嘌呤核苷酸水平保持相對平衡，滿足核酸合成需要。核酸發(fā)酵專題知識講座第34頁以IMP為中心兩個循環(huán)，各個反應(yīng)是不可逆IMP脫氫酶受GMP反饋抑制，也被GMP阻遏；ATP反饋抑制GMP還原酶。一樣，AMP抑制SAMP合成酶，GTP抑制AMP脫氨酶SAMP→AMP反應(yīng)供能體為GTP，XMP→GMP反應(yīng)供能體為ATP（即GTP加速IMP向AMP轉(zhuǎn)變；ATP則促進(jìn)GMP生成）總結(jié)核酸發(fā)酵專題知識講座第35頁依據(jù)上述調(diào)整機(jī)制，當(dāng)細(xì)胞中GMP水平提升到一定程度時，從IMP代謝流就自動地轉(zhuǎn)向AMP方面；反之，當(dāng)細(xì)胞AMP水平高到一定程度時，從IMP代謝流就自動地轉(zhuǎn)向GMP方面。另首先，核苷酸代謝也與組氨酸生物合成相關(guān)：AICAR→IMP→AMP→ATP→PR-ATP→AICAR形成一個循環(huán)，由PRATP經(jīng)咪唑甘油磷酸生成組氨酸。假如組氨酸過剩，則不走此路徑。核酸發(fā)酵專題知識講座第36頁一、肌苷酸（IMP）：

次黃嘌呤核苷酸，白色粉末狀或顆粒狀結(jié)晶，味鮮、易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑。食品：鮮味添加劑醫(yī)藥：白細(xì)胞或血小板降低癥，各種急慢性肝炎，肺原性心臟病，中心性視網(wǎng)膜炎，視神經(jīng)萎縮癥，毛地黃中毒癥以及血吸蟲病治療。生產(chǎn)方法：微生物直接發(fā)酵生產(chǎn)（一步法）；細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)肌苷，然后采取化學(xué)發(fā)或酶法進(jìn)行磷酸化；添加前體物次黃嘌呤，經(jīng)過補(bǔ)救路徑合成（半合成法）；利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)腺苷或5，－腺苷酸，再用化學(xué)法或酶法生產(chǎn)。§3核酸類物質(zhì)生產(chǎn)各論核酸發(fā)酵專題知識講座第37頁P(yáng)RPP轉(zhuǎn)氨酶受到AMP、ADP、ATP和GMP反饋抑制，還受腺嘌呤反饋阻遏。當(dāng)使用腺嘌呤缺點型（Ade－）突變株時，限制Ade添加量，既能夠解除Ade系化合物對PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶反饋抑制，，而且防止了腺嘌呤對PRPP反饋阻遏，為5，－IMP積累建立了首要條件。2、產(chǎn)氨短桿菌肌苷酸合成代謝調(diào)控機(jī)制核酸發(fā)酵專題知識講座第38頁1、PRPP轉(zhuǎn)氨酶受到AMP、ADP、ATP和GMP反饋抑制，還受腺嘌呤反饋阻遏。2、IMP脫氫酶受GMP反饋抑制，被鳥嘌呤阻遏3、SAMP合成酶受AMP、ADP、ATP反饋調(diào)整核酸發(fā)酵專題知識講座第39頁以腺嘌呤缺點型（喪失SAMP合成酶）為出發(fā)菌株再誘變成Xan－（黃嘌呤缺點性，喪失IMP脫氫酶），不但切斷了支路代謝，還能夠經(jīng)過限量添加Gua（鳥嘌呤）或Xan使GMP生成量降低，解除GMP對PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶反饋抑制，確保肌苷酸大量積累。核酸發(fā)酵專題知識講座第40頁3、肌苷和肌苷酸高產(chǎn)菌選育模型1）切斷兩條支路代謝，

切斷支路：IMP→SAMP→AMP；IMP→XMP，選育腺嘌呤缺點型（Ade－）和黃嘌呤缺點型（Xan－）雙重缺點型突變株；2）經(jīng)過限量腺嘌呤和鳥嘌呤來解除腺嘌呤系和鳥嘌呤系化合物對IMP生物合成酶反饋抑制；3）深入選育抗腺嘌呤、鳥嘌呤類似物和（或）抗磺胺劑突變株，從遺傳上解除正常代謝控制；選育8-AGr（抗8-氮鳥嘌呤）突變株（選育抗性突變株時，應(yīng)采取喪失腺嘌呤脫氫酶<dea－

>菌株為出發(fā)菌株）核酸發(fā)酵專題知識講座第41頁4）選育Mn2+脫敏突變株（MnINS），或控制培養(yǎng)基中Mn2+濃度，解除細(xì)胞膜滲透型障礙。5）生產(chǎn)肌苷時，肌苷酸酶活性要強(qiáng)，而肌苷酸化酶要越弱越好，以使生成肌苷不再分解。模型：Ade－+Xan－+dea－+GMPred－

+8AGr（或8AXr、ARr）+SGr+NP－

+ARr+Smr（符號見《微生物工程工藝原理》p.116）核酸發(fā)酵專題知識講座第42頁IMP發(fā)酵應(yīng)具備條件：選擇肌苷酸酶弱或喪失出發(fā)菌株（不分解肌苷酸）切斷IMP向下兩條支路，使IMP大量生成和積累；選育結(jié)構(gòu)類似物雙重抗性突變株；限量添加Mn2+，解除細(xì)胞膜滲透型障礙?？偨Y(jié)核酸發(fā)酵專題知識講座第43頁4、核苷酸分泌

：核苷酸不易分泌出胞外，試驗證實Mn2+對產(chǎn)氨短桿菌核苷酸分泌起關(guān)鍵作用。Mn2+可引發(fā)細(xì)胞形態(tài)改變，在IMP發(fā)酵中，控制Mn2+（限量）造成細(xì)胞膨脹不規(guī)則形態(tài)，膜產(chǎn)生異常，非常專一性膜透性被破壞，核苷酸生物合成補(bǔ)救路徑酶系[PRPP激酶、Hx（次黃嘌呤）焦磷酸化酶]及Hx和R-5-P都分泌于體外，在體外大量生物合成IMP。但當(dāng)Mn2+過量時，菌體呈小球狀，抑制了這些物質(zhì)分泌。核酸發(fā)酵專題知識講座第44頁5、肌苷酸產(chǎn)生菌產(chǎn)氨短桿菌谷氨酸棒桿菌谷氨酸小球菌核酸發(fā)酵專題知識講座第45頁6、肌苷酸發(fā)酵工藝試管斜面培養(yǎng)搖瓶種子培養(yǎng)二級種子罐培養(yǎng)三級種子罐培養(yǎng)發(fā)酵板框壓濾脫色活性碳吸附濃縮結(jié)晶精制（1）工藝流程離子交換核酸發(fā)酵專題知識講座第46頁（2）操作說明培養(yǎng)基：（1）碳源：淀粉水解液、葡萄糖（2）氮源：玉米漿、酵母粉、硫酸氨、尿素（補(bǔ)充無機(jī)氮和調(diào)整pH。（3）0.5%酵母膏或酵母水解液：補(bǔ)充生長所需亞適量腺嘌呤（4）2％玉米漿：富含B族維生素、生物素、嘌呤、嘧啶、氨基酸等微量有機(jī)物質(zhì)，對菌體生長有主要影響，并富含有機(jī)氮，可提供His、Lys、Gly、Ala、高絲氨酸對菌體生長有促進(jìn)作用。（5）無機(jī)鹽：1％磷酸鹽（鉀鹽）和鎂鹽（硫酸鎂），碳酸鈣（6）

Mn2＋需限量添加核酸發(fā)酵專題知識講座第47頁培養(yǎng)條件（1）接種量：2－5％（2）溫度控制：30－40℃。（3）pH控制：6.3-6.7。經(jīng)過流加氨水、尿素等方式控制發(fā)酵液pH。（4）溶氧控制：20立方發(fā)酵灌，攪拌速度130r/min，通氣比1：（0.12-0.15)核酸發(fā)酵專題知識講座第48頁核酸發(fā)酵專題知識講座第49頁7、肌苷酸提取工藝：離子交換樹脂法發(fā)酵液過濾酸化pH1.5陽離子樹脂吸附流出液堿化pH9.5減壓濃縮結(jié)晶溶解重結(jié)晶陰離子樹脂吸附洗脫肌苷酸精品鹽酸732#（H＋）型NaOH717#（OH－）型0.05mol/LHCl0.05ml/LNaCl95％乙醇（1）工藝流程核酸發(fā)酵專題知識講座第50頁（2）提取工藝說明過濾、酸化：發(fā)酵液加活性白土（15g/L)，壓濾除菌體，清液加1.5倍體積0.1mol/LHCl。陽離子交換：732#（H＋）型樹脂，上柱液體積為濕樹脂體積6倍。流出液用NaOH溶液調(diào)pH8.5-9.5。陰離子交換：上柱液體積為濕樹脂體積6倍，90％肌苷酸被吸附。洗脫：先用水沖洗柱子，再用0.05mol/LHCl洗滌至流出液pH為3.5；然后用含0.05mol/LHCl和0.05mol/LNaCl混合液進(jìn)行洗脫。搜集肌苷酸流出液。減壓濃縮：將洗脫液用40％NaOH調(diào)pH至7.5，減壓濃縮15－20倍體積。結(jié)晶：濃縮液加入2倍體積95％乙醇，低溫育晶，析出肌苷酸粗品。重結(jié)晶：肌苷酸粗品加水溶解，加乙醇低溫結(jié)晶，過濾，晶體用30％乙醇洗滌2－3次肌苷酸精品：濕肌苷酸晶體烘干，制得肌苷酸精品。核酸發(fā)酵專題知識講座第51頁核酸發(fā)酵專題知識講座第52頁核酸發(fā)酵專題知識講座第53頁

無色至白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末。水溶液在pH值2-14范圍內(nèi)穩(wěn)定。加熱30-60min幾乎無改變，250℃時分解。

5'-鳥苷酸二鈉有特殊香菇滋味，鮮味程度約為肌苷酸鈉三倍以上，5'-鳥苷酸二鈉常與谷氨酸鈉配合使用(加入量1%-5％)，有顯著增鮮作用。亦與肌苷酸二鈉混合配制成呈味核苷酸二鈉，作混合味精用。

§3核酸類物質(zhì)生產(chǎn)各論二、鳥苷：核酸發(fā)酵專題知識講座第54頁1、鳥苷酸代謝調(diào)控及發(fā)酵機(jī)制枯草芽孢桿菌嘌呤核苷酸生物合成調(diào)整機(jī)制核酸發(fā)酵專題知識講座第55頁P(yáng)RPP轉(zhuǎn)酰胺酶被AMP、ADP完全反饋抑制，IMP、GMP、XMP、ATP對其抑制較弱肌苷酸脫氫酶受GMP系物質(zhì)反饋阻遏。其次受ATP、XMP、GTP反饋抑制。在枯草芽孢桿菌中，GMP合成中專一性酶（IMP脫氫酶）僅受GMP系物質(zhì)反饋阻遏。從IMP合成AMP、GMP。傾向于優(yōu)先合成GMP。核酸發(fā)酵專題知識講座第56頁2、GMP發(fā)酵應(yīng)具備條件：枯草芽孢桿菌含有GMP環(huán)形支路：菌株因喪失SAMP合成酶（Ade－）活性，切斷從IMP到AMP通路，使生成IMP全部轉(zhuǎn)向合成GMP，同時喪失GMP還原酶活性，使生成GMP不致還原為IMP。為了積累鳥苷，核苷酶或核苷磷酸化酶等鳥苷分解酶活性必須微弱；鳥苷酸（GMP）是嘌呤核苷酸全合成終產(chǎn)物，為了積累鳥苷，必須解除GMP對PRPP轉(zhuǎn)胺酰酶，IMP脫氫酶及GMP合成酶等反饋抑制與阻遏。（封閉基因或選擇滲漏）為了抑制肌苷產(chǎn)生，高效率積累鳥苷，由IMP脫氫酶及GMP合成酶所催化反應(yīng)應(yīng)該比核苷酸酶（IMP---IR)所催化反應(yīng)優(yōu)先進(jìn)行。核酸