實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離

實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第1頁試驗目標:1.進行大腸桿菌擴增，利用液體培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)操作2.進行大腸桿菌分離,用固體平板培養(yǎng)基進行細菌劃線培養(yǎng)3.說明大腸桿菌培養(yǎng)條件和操作要求原理實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第2頁特點：結(jié)構(gòu)都相當簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有甚至沒有細胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)普通不含有葉綠素.不能進行光合作用.微生物包含哪五類：病毒細菌放線菌真菌原生動物原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基礎知識：

(一)微生物：是一切肉眼看不見或看不清楚微小生物總稱．實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第3頁(二)細菌常識1、結(jié)構(gòu)2、分裂3、生殖4、變異類型5、在基因工程中應用實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第4頁大腸桿菌實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第5頁細菌外形與大小大腸桿菌屬于桿狀菌圖1-1常見三種細菌經(jīng)典形態(tài)A.球菌B.桿菌C.弧菌實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第6頁細菌營養(yǎng)類型依據(jù)細菌所利用能源和碳源不一樣將細菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌:異養(yǎng)菌:腐生菌寄生菌大個別病原菌光能自養(yǎng)型:光合細菌化能自養(yǎng)型:硝化細菌,鐵細菌,硫細菌大腸桿菌屬于異養(yǎng)兼性厭氧菌實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第7頁細菌革蘭氏染色革蘭氏染色法是一個用于細菌染色法。此法將細菌分為兩類，即革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。所謂革蘭氏陽性菌就是用革蘭氏染液染色后，再用脫色液處理，細菌仍保留染色液顏色；革蘭氏陰性菌則相反。這兩種菌差異在于細胞壁成份不一樣。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第8頁☆

培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成，專供微生物生長繁殖使用混合營養(yǎng)液。固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基類型(三)細菌培養(yǎng)成份區(qū)分：瓊脂實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第9頁2.不一樣微生物往往需要采取不一樣培養(yǎng)基配方3.不論哪種培養(yǎng)基，普通都含有水、碳源、和氮源、無機鹽、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、氧氣、滲透壓要求．細菌喜葷，霉菌喜素大腸桿菌配方：酵母提取物

0.5g蛋白胨

0.5gNacl

0.5g瓊脂

1g水:50ml實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第10頁4.培養(yǎng)基用途液體培養(yǎng)基：擴增細菌、工業(yè)生產(chǎn)固體培養(yǎng)基：純化（分離），判定、保藏菌種實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第11頁單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見，含有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)子細胞群體，叫做菌落。菌落是判定菌種主要依據(jù)?！罹?/p>

實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第12頁液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第13頁☆無菌技術1.無菌技術概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物操作中，全部預防雜菌污染方法。成功地培養(yǎng)微生物關鍵。實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第14頁（１）消毒定義：2.消毒與滅菌概念及二者區(qū)分

（2）滅菌定義：3.常見消毒與滅菌方法是指殺滅病原微生物方法。是指殺滅或去除環(huán)境中一切微生物（包含芽胞、孢子）方法實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第15頁1、灼燒滅菌滅菌方法：實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第16頁2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第17頁1.無菌技術除了用來預防試驗室培養(yǎng)物被其它外來微生物污染外，還有什么目標？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。假如需要，請選擇適當方法。（1）培養(yǎng)細菌用培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）試驗操作者雙手答：無菌技術還能有效防止操作者本身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。思索1實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第18頁二、大腸桿菌培養(yǎng)和分離試驗操作（一）培養(yǎng)基配置與滅菌取2個250ml三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基（剛配好，還未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min。LB液體培養(yǎng)基——細菌擴充培養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基——細菌劃線分離封口膜：既通氣又不使菌進入實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第19頁（二）倒平板滅菌后培養(yǎng)基在無菌操作臺上倒入4個培養(yǎng)皿中，倒后馬上置于水平位置上，輕輕晃動，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第20頁注意事項：1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時，才能用來倒平板2.滅菌及消毒：無菌操作臺用超凈紫外燈和過濾風滅菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

3.操作時右手無名指和小指夾住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培養(yǎng)皿并打開上蓋一邊,在酒精燈火焰旁操作.4.需要使錐形瓶瓶口經(jīng)過火焰，灼燒滅菌5.平板冷凝后，要將平板倒置,既能夠使培養(yǎng)基表面水分更加好地揮發(fā)，又能夠預防皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基，造成污染.實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第21頁（三）大腸桿菌擴充培養(yǎng)將斜面上培養(yǎng)大腸桿菌菌種接種到滅菌后液體培養(yǎng)基中,使其在37℃搖床培養(yǎng)12小時。注意事項:1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復原.實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第22頁（四）大腸桿菌劃線分離分離方法:劃線分離法和涂布分離法實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第23頁1、劃線分離法無菌操作臺上用接種環(huán)取菌后在固體培養(yǎng)基平板上連續(xù)劃線.實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第24頁平板劃線操作實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第25頁不能使用脫脂棉，不然輕易吸水，造成污染。實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第26頁一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以到達分離單菌落目標；二是存留在劃破處單個細胞無法形成規(guī)矩菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀菌落。實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第27頁實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第28頁（四）大腸桿菌劃線分離注意事項:1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不一樣位置連續(xù)劃線屢次.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h1、劃線分離法實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第29頁問題討論

1.為何在操作第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，依然需要灼燒接種環(huán)嗎？為何？

答：操作第一步灼燒接種環(huán)是為了防止接種環(huán)上可能存在微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上菌種直接起源于上次劃線末端，從而經(jīng)過劃線次數(shù)增加，使每次劃線時菌種數(shù)目逐步降低，方便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留菌種，防止細菌污染環(huán)境和感染操作者。實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第30頁2.在灼燒接種環(huán)之后，為何要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后劃線操作時，為何總是從上一次劃線末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細菌數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線末端開始，能使細菌數(shù)目伴隨劃線次數(shù)增加而逐步降低，最終能得到由單個細菌繁殖而來菌落。實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第31頁2、涂布分離法:是指將培養(yǎng)菌液稀釋一定倍數(shù),然后取一定量稀釋液加在固體培養(yǎng)基上,用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上.實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第32頁劃線分離法和涂布分離法哪個更加好呢？劃線分離：方法簡單，但單菌落較難分開。涂布分離：單菌落更易分開，但操作復雜。實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第33頁分離后,一個菌體便會形成一個菌落,這是消除污染雜菌通用方法,也是用于篩選高表示量菌株最簡便方法之一實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第34頁（五）大腸桿菌分離后保留1、暫時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保留。2、長久保留：甘油冷凍管藏法實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第35頁1.怎樣操作才能夠盡可能防止被雜菌污染?(1)膽大心細，操作快捷。（2）注意滅菌操作標準，滅菌徹底，降低環(huán)境污染概率。（3）注意微生物生長條件，如PH、滲透壓、溫度等。細菌喜堿，喜蛋白質(zhì)，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第36頁2.在培養(yǎng)后怎樣判斷是否有雜菌污染?（1）菌落形態(tài)看，是否濕潤，透明，粘稠，顏色等。是區(qū)分細菌、酵母、放線菌和霉菌關鍵指標。（2）顯微鏡觀察其形態(tài)、大小、看是否有菌絲、孢子、芽孢。是區(qū)分細菌、酵母、放線菌和霉菌關鍵指標。（3）上述方法較難區(qū)分同類不一樣物種，需借助化學和深入形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法等。實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第37頁3.進行恒溫培養(yǎng)時為何要將培養(yǎng)皿倒置?恒溫培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中水分會以水蒸氣形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；假如正放，則水分形成水滴會落入培養(yǎng)基表面并擴散開。假如培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會造成菌隨水擴散，極難再分成單菌落，達不到分離目標。實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第38頁4.試驗完成后,接種過細菌器皿應怎樣處理?全部接觸過菌器皿都要先高壓滅菌后再洗滌（尤其是培養(yǎng)基）；使用后廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第39頁5.假如分離是轉(zhuǎn)基因大腸桿菌,怎樣確保不被普通大腸桿菌所污染?轉(zhuǎn)基因用質(zhì)粒不是細菌中原有，而是經(jīng)過改造，通常加入了抗性基因DNA序列，所以可用含有對應抗生素培養(yǎng)基對菌體進行培養(yǎng)。實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第40頁【課堂練習】例1．關微生物營養(yǎng)物質(zhì)敘述中，正確是（）

A.是碳源物質(zhì)不可能同時是氮源

B.凡碳源都提供能量

C.除水以外無機物只提供無機鹽

D.無機氮源也能提供能量D實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第41頁例2．下面對發(fā)酵工程中滅菌了解不正確是（）A.預防雜菌污染B.接種前菌種要進行滅菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前B實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第42頁編號成份含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培養(yǎng)基成份，請據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)微生物類型是

。（2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費此培養(yǎng)基，可再加入

.自養(yǎng)型微生物

含碳有機物

實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第43頁（3）若除去成份②，加入