人型腺病毒重組六鄰體蛋白的純化及免疫學(xué)生

人3型腺病毒重組六鄰體蛋白的純化及免疫學(xué)研究Q260046902專業(yè)做論文-PAGE42－－哈爾濱醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文目錄中文摘要……………2英文摘要……………3文獻綜述……………4前言…………………13實驗材料……………15實驗方法……………21實驗結(jié)果……………27討論…………………32結(jié)論…………………35參考文獻……………36致謝…………………41個人簡歷……………42中文摘要宣目的腺病言毒(Ade撓novir安us,Ad爽V)是引起鋸人類呼吸道識和消化道感淡染的重要病愿原之一，嚴擺重威脅著人衡類的健康。伶腺病毒導(dǎo)致畢小兒肺炎，卻尤其是樓6煤個月至拉2相歲的嬰幼兒貫腺病毒肺炎崖最為嚴重，絞感染主要是鄭以乓3,5,杯7肉型為主,所恩以建立有效雄的防治腺病壓毒感染措施高意義重大。宜六鄰體是腺冠病毒主要的劃結(jié)構(gòu)蛋白，贈能夠刺激機污體產(chǎn)生相應(yīng)留的抗體，抑尼制病毒體構(gòu)具象的改變，集從而中和病漫毒體。本實沾驗組已經(jīng)成賣功克隆并表污達了重組人惰3型腺病毒亡六鄰體L1釘、L2亞基持，本次實驗恩旨在純化重房組六鄰體亞魄基蛋白，檢莊測其抗原性抖、特異性及搖體外保護情腦況。方法在宰原核表達系械統(tǒng)各E.col朋i量M15乞中高效表達脊重組人3型快腺病毒六鄰疼體蛋白。利遮用Ni-N蛋TA瓊脂糖碌親和層析柱材進行蛋白純襲化。用純化淋的重組六鄰競體蛋白免疫紫新西蘭家兔軋,利用免疫誘印跡技術(shù)檢奉測其血清中巧抗體，鑒定偵該蛋白的免每疫原性和反撿應(yīng)原性。利語用固定病毒協(xié)-稀釋血清件方法進行中堅和實驗，計甲算其中和抗插體效價。結(jié)栽果得到純多化的重組人治3型腺病毒侍六鄰體蛋白娘，該蛋白免膀疫動物后產(chǎn)飲生高效價抗灘體,達到1艱：1024販000，該吼抗體能與人哄3型腺病毒符、含有該蛋括白的重組工性程菌株以及柔重組六鄰體膚蛋白發(fā)生特眠異性的免疫謝印跡反應(yīng)(順Weste爽rnbl液ot劑)含，土不與E.c杰oli徐M15薦菌株、BS完A蛋白、柯卻薩奇病毒和侄Hela細微胞等反應(yīng)，綢證明該重組昆六鄰體蛋白依具有良好的朵免疫原性和陜反應(yīng)原性以值及3型腺病層毒特異性。根在中和實驗畢中，該抗體牲可以有效地艇中和人３型縮腺病毒的感真染，中和效甘價為1:8銅00，結(jié)論鑼所獲得的木重組人3型渡腺病毒六鄰昌體蛋白具有洗良好的抗原過性和特異性謝,耳其產(chǎn)生的抗撕體具有良好妻的保護作用愧，為開發(fā)研贏制高效、無器毒的腺病毒亭基因工程疫定苗奠定基礎(chǔ)京。鏈[關(guān)鍵詞紙]六鄰體牲；純化；免據(jù)疫保護；中勝和抗體價Purif犁icati從onan淚dstu足dyon棟the秒immun罵ology薄ofr貍ecomb息inant珍h搖exon釀ofhu沃mant露ype-3拿aden晶oviru宮s便Abstr勒act零Ob亡ject:助The版adeno姐virus渡one促ofth嫌emai按n粗patho均geny可whic殃hcau醉se奴respi約rator辯ytra再ct造and辜alime總ntary掙infe素ction淚and蛋cause角more具and抓more遠serio漫us.疲Aden父oviru牙scan簡caus復(fù)e她爛child裙pneu葵monia摩and坦them徐ajor吳infec曠tedt灣ypes絡(luò)aret互ype3科,5a軌nd7赤etal尤，sot隊oest塔ablis帆han率effec凱tive扯擱step赤to遠preve喉ntion焦and灑cure萌藏Adeno為virus留infe侮ction按has吧asig錄nific億antm字eanin質(zhì)g.He鮮xoni希sthe鵝majo落rstr衣uctur蹄epro咱tein傳ofad貝enovi粒rus.脆It艙stimu鳥lates朗the貧body嫩topr茶oduce橡anti摸-body燕and奔inhib員itsc騰onstr六ucts木hift弓ofvi洋rust餃oneu浙trali各zeth蹤evir涌usbo授dyit礙self.策weha擴veal努ready袖clon鴿edan世dexp衣resse團dthe扒刷recom淋binan及t世hexo企nof門human處type孤-3ad彼enovi袍rus.N盟owwe縣inte淹ndto狐puri矛fyth擠e福recom斤binan窄t陸hexo蘭nof自human供type席-3兆adeno濕virus凈and片detec遣tits苗anti瘡genic屢ity、哥speci翻ficit閑y眾and是conse需rvati莫on冰exv瞞itro.凍托M友ethod拖s：Un岡dert益heop施timum頃exp客ressi戶onco速nditi五ons,廊theh以exon晚prote摘inof咬huma糠ntyp慚e3a安denov六irus堂wase鬼ffici梳ently盡床expre兔ssed摔inE砍Coli燥.The稼expr狼essed掘prot手eins仿were鑒purif弟iedb動ymea伏ns桂ofN逗i-NTA叢荷affin濕ityc抄h(huán)roma什togra碑phy貪.Usi陣ngth戀epur研ified錘hexo擾nto賴immun蹦erab挎bita警ndte青stth挎ehex訪on克’尼s政antig掃enici遙ty賭with正the晌metho拾dof慎Weste誘rn-bl撕ot睛techn箱ique憶.to父test尖竿neutr及aliza衰tion盼antib倍ody扎bym殿eans發(fā)offi魂xedv春irus-謀dilut疼edse鉆rumw揉ay.Re湖sults未：The巨hexo語nof旁hum邪anty船pe3抬adeno芽virus能was枕purif與ieda坑ndwa恨spro熱vedt癢oimm烤unet倘hera腦bbit倉with超high因antib須ody聲titer揉(1:1謀02400獲0)and絮the均antib車odyr獸eacte慢dspe革cific掃with生the帝purif峰iedr特ecomb陷inant預(yù)hexo軍n,not伴reac優(yōu)tedw至ithE梯.coli廟、BSA、葡Coxsa骨ckie箭virus本and牽Hela倆cell恭,the心reco漠mbina愿ntE.根co高list舌rain攏conta傲ining蔽the套hexon肺prot牌eina內(nèi)ndth鬧etyp露e3a廳denov惱irus賠itsel皮f.Th圣usit撫was穴prove祥dtha扔tthe仔蓬recom膊binan左t劑prot繩einp稀osses宗sedb絨otho默fthe騙high掃anti皮genic勸itya注ndhi斜ghsp殖ecifi鼠city識toty饅pe3芹adeno杏virus盈.InN攔Ates緣t,t矮hean鴿tibod錦ycan錘計neutr姻alize嫁aden專oviru日seff烘ectiv介elya蜂ndit讓sneu匙trali撫zatio閣nant積ibody欠套titer領(lǐng)is1緣：墻800.身Concl接usion壤s?。嚎頣he廣recom蘿binan蘭t粗hexo福nhas銳high齊饑immun融ogeni杯city尤and鉛reac栽tiono挽genic贈ity扎and拉speci印ficit偷y.It黎’消sant紗ibody健has苦remar醒kable研存prote匹ction戴.副扮This撇isve諸ryim鞏porta咳ntto蠢prod巴ucee餐ficie至ntan黨dnon功toxic國gene疫tice蟲ngine熊ering無vacc斗ine蓬錯again新stad稼enovi塞msin嫌fecti渡o躲n濤Keyw味ords恢：hex樂on,p遇rotei球npur姑ifica賭tion婚,i邁mmuno裳genic山ity仙,neut該raliz停ation絲anti填body文獻綜述啄腺病毒(A筑denov軍irus,收AdV)是愈引起人類呼患吸道和消化愈道感染的重窄要病原之一娘，嚴重威脅熱著人類的健院康自[1]貧。在<5歲屬兒童的急性庭呼吸系統(tǒng)疾悠病中，腺病改毒引起的肺矩炎較為嚴重漠；在饞3歲以下兒鎮(zhèn)童還易引起話急性肺炎，宮以3，5，禾7型為主垃[2]槐。象近些年在北塑方地區(qū)曾有亞過腺病毒的餐暴發(fā)流行，寨嚴重地威脅牽著兒童的健跪康和生命安建全，因此，投對腺病毒進耳行快速、特伴異性診斷和視預(yù)防具有重蔽大意義。腺倍病毒六鄰體歡是腺病毒的野主要抗原，曉刺激機體產(chǎn)音生抗體，抑韻制病毒體構(gòu)優(yōu)象的改變，紹從而中和病坡毒體鍛[3]遭。本文綜述勉了近些年來葬腺病毒的國雖內(nèi)外研究現(xiàn)稻狀，對其致程病性、一般濤特征、免疫予學(xué)特性、疫輩苗及應(yīng)用進坐行探討。暗一.腺病毒功(Aden毛oviru蛋s,AdV矩)是引起人寒呼吸道和消慌化道感染的岡重要病原之萄一崇。饑腺病毒肺炎注是由腺病毒粱感染肺部引盆起的肺炎裙,釀是病毒性肺洋炎中最嚴重纏的一種。它高是由掀3慘型和省7侄型腺病毒所次引起的慰,修主要是由腺也病毒造成的客氣管、支氣疏管上皮廣泛桂壞死挑,抄引起支氣管嬸管腔閉塞推,蓬致使病情加輕重得,黨最終導(dǎo)致肺犬功能損害和雅其他功能障洋礙。不少危溉重患兒雖然之經(jīng)過搶救挽只回了生命魚,練但由于肺組竭織破壞較重首,登遺留不同程敞度的慢性肺農(nóng)部疾病繁,選如支氣管擴懷張癥等宇,顫對兒童的健追康危害極大旱[聽4頌]呀。進腸腺病毒例(ente退rica貞denov恰irus)撞是嬰幼兒腹包瀉的重要病苦原體。屬于風(fēng)普通腺病毒裁的份40,4交1盒血清型植,澤外形與普通籠腺病毒相同速,咽為直徑層70鈔～蟲80nm雖的雙鏈僻DNA腰病毒增,牽主要侵犯嬰躁幼兒恒,顛通過人與人籮的接觸傳播購,固也可經(jīng)糞丟—噸口途徑及呼柜吸道傳播槍[宵5坦]煤。本病無明駱顯季節(jié)性級,笑夏秋季略多綁,插可呈暴發(fā)流邊行。臨床表叔現(xiàn)為較重的辜腹瀉虜,息稀水樣便帽,書每日刑3遷～肆30叼次。常有呼客吸道癥狀。唯如咽炎、鼻扶炎、咳嗽等要,玻發(fā)熱及嘔吐狹較輕附,趣可有不同程缺度的脫水征竊。病程言8爛～須12d匠。多數(shù)患兒內(nèi)病后瘡5濤～鴨7南個月內(nèi)對蔗枕糖不耐受蘇,專并可伴有吸陪收不良。喇二、腺病副毒的分類及愉其一般特征厭腺病毒在自織然界分布十穩(wěn)分廣泛，存故在于各種動梳物體內(nèi),偽分為感染懼鳥類憶(Avia闖denov井irus)吉和哺乳動物球(Mast梯adeno設(shè)virus素)慎的兩個屬。打后者從9種燥不同的宿主借中共分離到劣101種,竟其中研究最底廣泛的是人鑄腺病毒。目嶺前,人類腺訂病毒共發(fā)現(xiàn)植51種血清福型拿[6]何（以英文字陣母和數(shù)字表加示）,可分耳為A～F六監(jiān)個亞屬。它辦們在組織趨況向性等方面勒都有著不同嬸的特性貌[7]伙。A～E各鍋組型病毒能壩在人的組織鍵細胞（腎細轎胞）常規(guī)培肥養(yǎng)中增殖,妨稱為普通兼腺病毒,F興組的40、但41型病毒傷是從糞便中眠發(fā)現(xiàn)用常規(guī)船細胞培養(yǎng)不表能增殖的腺浮病毒,稱為揮腸道腺病毒啊。有些腺病泥毒在動物體托內(nèi)可致瘤，掏在體外能轉(zhuǎn)爸化細胞蓬[8]薯。熟腺漂病毒無包膜葬，注20面體對妹稱，直徑為招70～90籌nm，有2荒52殼粒，脖其中20面俊頂角殼粒為雁12個五鄰忍體（pen免ton夏，82事KD），每鍋個五鄰體有管2條纖維，氏長度相同或型不同纖維上剖帶有主要的跳種特異性抗套原決定簇和陣次要的亞屬蹄特異性抗原施決定簇。除院五鄰體外有鍛240個非慧頂角殼粒，猛稱為六鄰體宜（Hexo住n,120做KD），后豎者帶有主要且的屬和亞屬鋤特異性抗原塊決定簇和次券要的種特異青性抗原決定味簇叫[尊9奪]窯（圖一）。買煉編圖一、腺病冠毒的結(jié)構(gòu)原Fig1泄.Str旺uctur派eof臥adeno類virus坐腺病毒的形列態(tài)是特征性齡的二十面體滿病毒殼體（瞎Stewa烏rtet花al.,陷1993樂）。其病毒慰殼體含有三劫種主要的蛋侄白：六鄰體陜（II），不五鄰體基底通（III）耗和纖突（I巖V），還有丸多種其他的折輔助蛋白V玉I，VII物I，IX，久IIIa和絞Iva2（趨Fig.陰1）。腺病評毒基因組是尤一個線性的涂雙鏈DNA蠻，其5’端曾與一種末端右蛋白（TP呀）共價結(jié)合白，5’端上災(zāi)還具有末端抵反向重復(fù)序肢列（ITR蘭s）。病毒敬DNA與核震心蛋白VI腐I和一個稱壇為mu的小律肽緊密結(jié)合臂。另一種蛋拐白V包被在積DNA-蛋悟白復(fù)合物上達，并且通過狠蛋白VI為出DNA-蛋閣白復(fù)合物和饅病毒殼體間產(chǎn)提供了結(jié)構(gòu)乏上的聯(lián)系紗[10]古。病毒含有夏一種病毒自閥身編碼的蛋醒白酶，這種繡蛋白酶對于靜加工某些結(jié)鞠構(gòu)蛋白從而型產(chǎn)生成熟的亦具有感染性四的病毒是必快需的愉[11]比。絞腺病毒惱家族（Ad逼enovi失ridae良）的成員可諷感染種類相皂當(dāng)廣泛的有使絲分裂后細掛胞，甚至包晌括來自高度另分化的組織斷中的細胞，跳例如骨骼肌紅細胞，肺細義胞，腦細胞仔和心臟細胞萬。因為腺病酷毒可將自身幟的基因組遞叼送到細胞核鞏中，并且高搖效率地復(fù)制想，所以腺病旨毒成為表達安和傳遞治療厲基因的主要曲候選者階[12，1檔3]嫩。喂三、六鄰體抓蛋白的結(jié)構(gòu)散和功能軍目前,已對蝕六鄰體蛋白勢（圖二）進倆行了廣泛的悶結(jié)構(gòu)和功能蠶的研究絨[14]右。每個六鄰嗽體是六鄰體狗蛋白的同源丘三聚體，是豈大于900理個殘基的復(fù)姨雜蛋白大[15]愛。三聚體的氏六鄰體分子封有一個五面格體的基底和誠三角形的塔逃尖，基底包吳含兩個區(qū)域懼P1、P2卸區(qū)，經(jīng)過對茂Ad2電子欄顯微鏡觀察乒和x線衍射病分析，P1訴、P2在內(nèi)惱部卷曲成8喘個穩(wěn)定的鞋β閃折疊反向平虎行結(jié)構(gòu),塔爭區(qū)由三個環(huán)妨構(gòu)成L鋒oop聚1、L徹oop咱2、和L攝oop4尊。通過用一帳組單克隆抗奶體來檢測不勁同型的純化土的六鄰體蛋穴白表明，在熄六鄰體表面拳有許多的抗限原決定簇存盾在在這幾個愛環(huán)上。對規(guī)Loop左1、富Loop2制、御Loop4壓進行了研究沸，其中退Loop2氏、潑Loop4譽卷曲成團，爭和三聚體中待的其它兩個府多肽鏈的相先應(yīng)區(qū)域相互棚作用,環(huán)間牲相互指狀突煙起使得三聚為體的結(jié)構(gòu)相險當(dāng)穩(wěn)定正[滾16拜]轟。氧Loop1起是最長、最倍復(fù)雜的環(huán)，剪自身折疊許億多倍，向外馳突起最大限欠度的與周圍好環(huán)境相互作移用。對15妖個不同型的態(tài)腺病毒的六利鄰體蛋白的列核酸序列研被究表明基底踢的P1、P禁2區(qū)是保守殃的，變化區(qū)苗主要集中在貪L雨oop慶1、L楚oop堆2區(qū)魄[17]漸。邊Loop尖1、檢Loop愛2的所對應(yīng)搶的氨基酸是遮1419容—披1428個邀氨基酸，其止中有250散個變化的殘攀基，存在有跟七個獨特的錫超變區(qū)（H終VR），在密這七個HV電RS中，H手VR1~H池VR6出現(xiàn)抱在L煌oop濾1中，HV戀R7在L歐oop2掩的塔尖。這搜些HVRS露在不同的血耗清型之間的集長度有所不垃同，變化范部圍在2~3頃8個氨基酸透之間。其中俱HVR1、遙HVR2、疾HVR4、賠HVR5、忘HVR7中寄含有中和抗香原決定簇的誼一部分丟[18]見，而且抗原遲決定簇的至張少包括兩個客或兩個以上勵的HVRS蘋。在這五個撤HVRS中延包括大于9侵9%的六鄰敘體型特異性巨殘基。在L竊oop凱1、丈Loop棒2當(dāng)中，這儉些保守性殘璃基形成HV薯R區(qū)的框架陜，代表著臨范近區(qū)域的不咱連續(xù)鏈的相之互作用，2林/3的保守且序列是疏水恒性的更說明圣它們承擔(dān)的拒是結(jié)構(gòu)功能舍。在HVR聚S區(qū)中，H橋VR1、H竊VR6是L扮oop1碗內(nèi)部支持區(qū)住，而且HV塞R1是殘基宗變化最多的屢區(qū)域。HV破R4、HV清R5是L陜oop1塑的主要外部層支持區(qū)，H枕VR5位于衡塔尖，塔區(qū)限的重量變化年主要由這兩庸個區(qū)域來決半定。目前，馬這五個HV做RS區(qū)相應(yīng)碎的氨基酸序識列以及所對崖應(yīng)的核苷酸恒序列已經(jīng)確宜定。由于這察五個HVR符S位于L吃oop1奪、糖Loop2彈,所以L屬oop1欄、窗Loop2咬是較好的中查和抗原決定梯簇務(wù)[19]禮。知圖二、六鄰慰體蛋白的結(jié)鉤構(gòu)蔥Fig2千.Stru過cture德ofh猴exon順六鄰體是病央毒的主要抗秧原蛋白,含扮有大量的抗按原表位,如飛型、型間及烏組特異性抗兩原表位及中向和性表位?？实蟛糠挚股砦辉诘按桨椎囊患壗Y(jié)歸構(gòu)上還沒有扭被確切定位借[20]泳。不同型別蒙的六鄰體有櫻很高的保守屑(78%～俯95%)張[21]衣，型間與組酬特異性抗原裝表位定位于塑這些保守的貫區(qū)域，可能勢具有一定的久抗原性，可岸作為病毒感焦染性疾病診劇斷的靶抗原拳位點。映在六鄰體的瞇前段和中段徑,有大量的辱抗原性高峰盼及較密的親疼水性高峰區(qū)強域。該區(qū)域妖含有大量的掉保守區(qū)，可辜能具有較強批的抗原性及球很好的暴露螺性，并期望妨能夠作為型囑間特異性表場位，誘導(dǎo)高浩效價的抗H慌AdV特異覽性抗體。六守鄰體的后段膜主要由環(huán)4辟、P2區(qū)組轟成，盡管該寶區(qū)域在病毒逃顆粒上亦有習(xí)較好的抗原傲暴露性，并趕且序列的同壞源性較高，光但疏水性氨貍基酸殘基較棟多?？乖哉忣A(yù)測分析顯掃示，六鄰體惜后段的抗原截性高峰較稀匹少，相反，肚疏水性高峰蟻多而密，提止示該區(qū)域的斯總體抗原性壤較弱。償四、腺病毒裳血清型的確瞞定竟腺病毒血清廳型的確定是始根據(jù)感染性酷中和反應(yīng)，野它是型特異透性，直接針簡對六鄰體蛋影白的中和抗觸原決定簇。愉血清型又根聞?chuàng)塑账岬陌掏葱?、纖掛維蛋白的特勤性以及生物偵學(xué)特性來區(qū)瑞分為六個亞溪型（A、B何、C、D、謀E、F）另御據(jù)研究發(fā)現(xiàn)聚，在這幾個盒中和抗原決渾定簇所在的糕幾個超變區(qū)辣HVR績1紅、HVR2恩、HVR4肆、HVR5似、HVR7蜻當(dāng)中，發(fā)生牢了廣泛的染繭色體的非正講常重組襖[22]吵，包括短的疊直接重復(fù)序殲列的缺失、菠插入、重疊飲。而且A陵dv螺血清型的進脾化是由于在位HVRS中蜜發(fā)生非正常同的重組（抗裹原行遷移）聰，并伴隨有搏單一堿基的雜突變。，而桑且六鄰體蛋旦白的血清特停異型也位于懶L可oop忘1、Loo飯p2的七個松HVR休S放中。在HV腥R絨S熊的重組又形笛成獨特的新立的血清型，面這種獨特的被血清型由組稈成中和抗原鋤決定簇的殘芹基的數(shù)目、無位置、生物挨學(xué)特性所決述定。此處需昨要指出的是帽血清型的鑒藏定不局限于口中和反應(yīng)，筐有研究者利揀用限制性酶仔切分析，鑒延定特異性區(qū)用域(SSR華)來確定血量清型，而且錘所需的時間扎比中和反應(yīng)敢所需的時間絲少的多，前驕者只需一周虎，后者要三昨周，最后二疑者的結(jié)果完堡全相同。也比有人利用六慘鄰體蛋白的畏一個結(jié)構(gòu)部融分pIX進尊行亞型的鑒軋定，pIX伸是14.3還KDa六鄰儀體很小的組斤成蛋白，它已位于每個六毅鄰體殼粒的綁中間，C末頭端序列暴露界在殼粒表面主，N末端伸狼向殼粒內(nèi)部槳，pIX的驚作用是作為坐一個粘性因器子連接六鄰組體剖—岡六鄰體，而榴且它在DN祝A包裝的過莊程中也起到鴿重要作用。殿pIX的核咸甘酸序列在緣不同的亞型助間表現(xiàn)出明燥顯的差別。列有研究小組擋設(shè)計特異的震引物，應(yīng)用塞聚合酶鏈反值應(yīng)(PCR涼)，可以是統(tǒng)全部的pI校X基因以亞扒型特異的方礎(chǔ)式進行擴增商，說明利用收pIX進行崇PCR分析姓，有助于腺戲病毒亞型的咽鑒定扎[23,2井4]歡。潔另據(jù)研究發(fā)周現(xiàn)，在這幾閃個中和抗原拉決定簇所在懷的幾個超變止區(qū)HVR1蹈、HVR2獅、HVR4除、HVR5已、HVR7斗當(dāng)中,發(fā)生栗了廣泛的染敏色體的非正糧常重組，包刪括短的直接只重復(fù)序列的博缺失、插入饅、重疊。而寄且Ad血清據(jù)型的進化是歇由于在HV心Rs中發(fā)生杰了染色體非經(jīng)正常的重組音(抗原性遷摸移)，并伴石隨有單一堿鳥基的突變。彩HVRs的黎重組又形成擾了獨特的新創(chuàng)的血清型，混這種獨特的吩血清型由組抽成中和抗原狡決定簇的殘傳基的數(shù)目、駕位置、生物潔學(xué)特性所決錯定。希五、六鄰體奴的免疫學(xué)反圾應(yīng)籮為了研究腺找病毒衣殼的鏟三個主要成位分所引起的厚免疫反應(yīng)，踏將復(fù)制缺陷茅型腺病毒（鑄Rec-A謙d監(jiān)）注射到B找ALB/C傘小鼠體內(nèi)進遺行研究。實厲驗結(jié)果表明火，采用不同狡的免疫方式茅，產(chǎn)生的免倒疫反應(yīng)有所延不同。通過誕iv喊途徑進行免際疫，產(chǎn)生潔anti-愚Fi(而抗纖維)、各anti-攤Pb(蒼抗五鄰體)績、范anti-宵Hx(緞抗六鄰體)沸的抗體；通隨過蘭ip荒途徑進行免贊疫，則可以競產(chǎn)生冒anti-鄭Hx強抗體。由此腦表明腺病毒演有三個結(jié)構(gòu)慈性抗原豎[25]裕，抗體可以描與其結(jié)合，煤發(fā)生感染性先失活：這些遼抗原分別是剛纖維、五鄰踢體、六鄰體夏。A討nti-F剛i尤抗體的作用扇主要是聚集勒病毒體；群Anti-漂pb昂抗體的中和衣作用是阻斷春酸性細胞進椒入細胞漿；復(fù)A推nti-H亡x品抗體，既可劈以通過聚集麥病毒體起中躬和作用又可罰以在低PH逝值（惕PH5.0送-PH6.聰0英）下部分抑異制病毒體的絞構(gòu)象改變，仁從而中和病遼毒體抄[26]泊。病毒的六異鄰體包膜在對最初的感染偉階段起著很洞大的作用，弦在PH值降勵低的情況下右，六鄰體蛋害白發(fā)生構(gòu)象曉的改變，暴芝露出分子的勿N-端。P肉H值誘導(dǎo)的供六鄰體構(gòu)象莫的改變，對龜于以后五鄰乎體基底的暴止露，或是參鍵與病毒體脫敞去包膜是很加必要的駱[27]驅(qū)。搬1983年盯，有研究人陜員認為六鄰濕體蛋白為型席特異性抗原制決定簇，是桌中和抗原的略靶點，是病食毒體對免疫片選擇壓力最舞敏感的部分些。它的特異傍型很可能氨補基酸的靶序剪列決定梅[28]飼。澆為了研究不臘同腺病毒六虛鄰體的抗原參決定簇的組伸成，應(yīng)用6氏1個小鼠腹珍水（包含M憤a噴b畢），分為三比組進行。其夜中不同的抗若原決定簇的材分布和標(biāo)志它由Ma南b奏進行識別。塑在研究抗原筒決定簇組成男的過程中，題反應(yīng)型和所鉆有的61個笨M疊ab燕的滴度間接進由ELIS杠A來確定筍[29]研。由M窮ab比識別的抗原朽決定簇是六延鄰體型特異彎性抗原決定拘簇。用M襯ab盒來區(qū)分21炎個不同的六依鄰體，這6攏1個Ma任b齡用交叉反應(yīng)崖類型和滴度濫的相關(guān)系數(shù)痰進行處理，影由此識別出鑰25個抗原玉決定簇類型席，而且型特步異性表位只蝴存在于同源匹六鄰體的表凈面耍[30]驅(qū)。宮有研究表明鐵，城a狡nti-H織x咸抗體有著極落強的中和反祖應(yīng)，而且閣anti-弊Fi菊和瞎anti-今pb沸抗體在丹anti-閘Hx叫抗體所獲得預(yù)的中和反應(yīng)博上有著協(xié)同漠效應(yīng)，而且冠在由蜜iv份中可以引起軋最強的中和騰反應(yīng)活性。巡A室nti-F增i問抗體雖然存交在，但是它艙們不能有效倆的阻斷病毒腹感染，所以句說纖維蛋白琴不是一個很米強的中和抗儀原決定簇，紡只具有很弱鄰的免疫原性潮。腺病毒的螞中和抗原決俊定簇主要在境于六鄰體上模，在當(dāng)六鄰汁體被替代或燈突變將會導(dǎo)藏致中和免疫擦反應(yīng)的缺失應(yīng)。因為六鄰曾體作為腺病鄉(xiāng)毒的主要結(jié)葛構(gòu)蛋白，參襪與各種各樣籍的復(fù)雜蛋白肚的相互作用妖[31]敞。所有研究者應(yīng)攪用比色法進甲行中和反應(yīng)合的分析。用準(zhǔn)于定量測定浪A晨dv賠抗體的血清精學(xué)滴度；在風(fēng)血清學(xué)的流腎行病研究中而篩選型特異萌性中和抗體芽。尤其當(dāng)抗套體的水平低奸于50-8獲0%時，用囑比色法來確薯定低水平感謀染更為有效犬。使用這種災(zāi)方法來大規(guī)敬模地篩選血括清和Ma茂b燒，以獲得存富在血清標(biāo)本年中的中和抗企體值寫[32]負。娃六、疫苗的槳研究逗八十年代，捎在軍隊中廣好泛應(yīng)用A飽d7境作為減毒活萬疫苗，來預(yù)帖防呼吸道疾華病和眼疾病么[33]關(guān)。有人研究某過應(yīng)用六鄰購體亞單位通創(chuàng)過陰離子交鞏換層析純化宇，以獲得純啞化的牛型腺懼病毒灶Ⅲ寒型的六鄰體傭免疫奸—根刺激復(fù)合體孩進行免疫，舟它可以在兔讀和牛體內(nèi)誘窄導(dǎo)產(chǎn)生中和余抗體。由此糊表明BAV偶-3六鄰體慘可以制備成曠多價亞單位差疫苗，保護鴨牛抵抗多種紫呼吸道疾病季[34]育。刺目前國際上呼主要集中研吉制腺病毒的胖基因工程疫牌苗。病毒的丙復(fù)制及病毒客基因表達的訪減少，對于篇開發(fā)活疫苗葉和用做基因摧療法的載體芽是所必要的塑。例如，細或胞毒性基因帽的失活，對隊于產(chǎn)生減毒稍活疫苗是很陸有意義的搜[35]宰。在轉(zhuǎn)導(dǎo)細沸胞內(nèi)減少病魔毒基因的表糖達，可以導(dǎo)熟致病毒載體免安全性增加慚。在腺病毒傭體內(nèi)，病毒罷基因的復(fù)制盈和病毒基因率的表達可以允通過轉(zhuǎn)換控滅制因素，啟更動子的替換倦來減少。曾足有人通過壇E4目啟動子的轉(zhuǎn)稠換，使啟動印子功能減少瘦，減少病毒儲后期基因的潮表達。在欠H1229匯細胞內(nèi)，通濃過軌E4條啟動子的替椒換而構(gòu)建的膚載體，所誘怪導(dǎo)表達的纖演維，與野生燃型相比，大去大減少黨[36]確。采隨著分子生葬物學(xué)技術(shù)的即開展，對腺里病毒的基因燙工程疫苗的俯研究也開展屬了起來。國綿際上，有人膏應(yīng)用A字d2允的幟loop1欺區(qū)的抗原決辯定簇在B組伙苛薩奇病毒川中的表達。鴿以苛薩奇病嫌毒作為載體油，重組腺病鄉(xiāng)毒六鄰體蛋布白的L1環(huán)輝，以使其在華H偉eL柔a細胞內(nèi)穩(wěn)勻定地表達，鞏所表達的蛋捎白，可以誘碎導(dǎo)產(chǎn)生既抗差腺病毒又抗施苛薩奇病毒辜的中和抗體蒜，進而研制婦多價的基因需工程疫苗警[37,3嶺8]舟。天七、病毒感戲染的特異性犧免疫例（一）體液集免疫作用臘病毒的抗體燒可自感染者些血清中檢出付，因此較早膚被發(fā)現(xiàn)并進傍行了較深入厘的研究。病瀉毒感染后最貧先出現(xiàn)的是塘IgM類特玩異抗體，一變般在感染后侵2～3腳d頭血清中開始礎(chǔ)出現(xiàn)范[39]您。以后則出秋現(xiàn)IgG類弦抗體，并隨慢不同病毒種糞類而持續(xù)時果間長短不等趙。一般經(jīng)粘經(jīng)膜感染并在飄粘膜上皮細饑胞中復(fù)制的貫病毒在局部云可誘生Ig靜A類抗體。股特異性抗體衰可用于診斷截。在體內(nèi)，踩中和抗體的或抗病毒作用忠至為重要。叨1傾、智中和抗體妻俯臟這種抗體能蟻與病毒結(jié)合處后消除病毒駝的感染能力亂，故在殺滅譜細胞外的游航離病毒中起送主要作用。寨其作用機制否是改變病毒崖表面構(gòu)型，跟或與吸附于立易感細胞受歪體的病毒表昆位結(jié)合，阻證止病毒吸附敢并侵入易感師細胞和增殖河。病毒與中歐和抗體形成撈的免疫復(fù)合扶物更容易被變巨噬細胞所載吞噬、清除啊或改變抗原史遞呈途徑。司有包膜的病凍毒表面抗原顏與中和抗體型結(jié)合后，激境活補體，可狠致病毒裂解肌。IgG、溫IgM、I懶g(shù)A三種不聯(lián)同類型免疫掉球蛋白的中鳳和抗體具有分不同的生物堪學(xué)特性。由繞于IgG分榜子量小，通口過胎盤，新野生兒可具有們來自母體的奮中和抗體而蠶得到約6個冶月的被動免薄疫保護期。秘IgM因分差子量大，不潔能通過胎盤者。如在新生度兒血中測得南被動特異性秧IgM抗體亂，可診斷為棒宮內(nèi)感染。罰病毒感染后張最早出現(xiàn)I躍gM抗體，污故檢查Ig擋M抗體可作播早期診斷。騾IgA抗體喘主要來源于護粘膜固有層誰的漿細胞，渠存在于粘膜披分泌液中，縫在局部免疫這中起主要作陵用，?？勺柘笾共《镜木謽遣空衬と肭譄o。痛2合、濤非中和抗體撓有些抗順體是針對有陪包膜病毒的喝基質(zhì)或其中證的核蛋白，減有些抗體是姿針對病毒表該面具有細胞服融合功能的補酶或病毒復(fù)福制酶等。因固這類抗原與址病毒入侵易斬感細胞不相喇關(guān)，故相應(yīng)紋抗體無中和姿作用，但有斷時具有診斷咬價值。病毒雜抗體的診斷梢方法隨不同兼病毒而異。夾3非、桂抗體介導(dǎo)對潑靶細胞的作莊用因有光包膜的病毒算感染細胞后安，細胞膜可灰出現(xiàn)病毒編傾碼的蛋白，憂能與相應(yīng)抗宵體結(jié)合，在料補體參與下誼裂解細胞；差也可通過抗慮體依賴性細霸胞介導(dǎo)的細撞胞毒作用（蓮ADCC）慕裂解與破壞嘗病毒感染的傘細胞。珠4僵、沙抗體介導(dǎo)促債進作用（e垮nhanc申ement荷）抗體配與某些病毒趟結(jié)合后，可隊促進病毒在覽感染細胞中塘的復(fù)制，如騎登革病毒、比呼吸道合胞界病毒等。對格抗體增強作殲用的機制還身不明確。實尚驗發(fā)現(xiàn)Ig梁G抗體有促造進作用，而休IgM抗體邊則無此作用桿，推測可能嬸當(dāng)抗體與病獸毒結(jié)合后，艙更多的病毒舍進入巨噬細騎胞而增殖，走在細胞表面鬧出現(xiàn)的病毒赤抗原激發(fā)了底機體的免疫勿應(yīng)答。其中起，巨噬細胞流釋放多種酶寸（如蛋白激爪酶、凝血酶壽等），進一栗步激活補體凳和凝血系統(tǒng)千，釋放血管六通透因子而傻引起一系列記病理變化而丑發(fā)生嚴重疾唱病。炮（二）胞免至疫作用事對細胞淡內(nèi)的病毒，舉機體主要通溝過CTL及恰T細胞釋放莊的淋巴因子衫發(fā)揮抗病毒鋪作用。細胞嫩免疫主要在束病毒感染的導(dǎo)局部發(fā)揮作劑用，其作用韻方式為通過攪免疫細胞接蜂觸靶細胞后靈殺傷靶細胞糊或在局部釋急放細胞因子懂，因此檢測艇細胞免疫的陣技術(shù)較體液聯(lián)免疫為復(fù)雜管。購1占、苗殺傷性T細鋪胞（CTL票）CT寶L的殺傷性辨作用具有病折毒特異性，憶一般出現(xiàn)于遷病毒感染后激7d左右。秋當(dāng)CTL活王性開始表現(xiàn)冤則NK細胞浴活性逐步降綢低。CTL藥接觸病毒感短染的細胞后籃，特異地識管別與MHC際分子結(jié)合靶射細胞表面的瘦病毒抗原特遷異肽段。在扇識別中還有額一些附加因兆子如CD3燒、CD2和貌一些粘附分奏子等。CT衣L接觸靶細糟胞后被激活填并釋放穿孔支素及細胞毒棕素，穿孔素碗是一組酶的程統(tǒng)稱，其作貸用類似補體屢的C貧9農(nóng)，致靶細胞烏出現(xiàn)許多小汪孔。細胞毒礎(chǔ)素可激活靶怠細胞內(nèi)的一掌些酶、細胞跡，或自身裂胞解，或發(fā)生綠凋亡。在多仇數(shù)病毒感染鐘中，因CT降L可以殺傷搶靶細胞達到豎清除或釋放原在細胞內(nèi)復(fù)剛制的病毒體慧，從而在抗劣體的配合下張消除病毒?？鸵虼吮徽J為蜓是使病毒感危染恢復(fù)的主妥要機制。千2犁、戰(zhàn)輔助性T（狗Th）細胞修Th莫細胞可以促販進B細胞生是長與分化，其并活化CT恨L及巨噬煙細胞。由于炊在小鼠中發(fā)絕現(xiàn)有分泌不滲同淋巴因子綱的T細胞類竟型，對可分私泌IL－2攤和IFN－脾的T細胞稱蓄為Th1類龜型，對分泌宿IL－4，冤IL－5和崇IL－10徑的T細胞稱藝為Th2類巾型。在人類固亦有類似的萬分類，但不矛如鼠中明確批。在病毒感倉染中已發(fā)現(xiàn)仇當(dāng)患者的T見h細胞有上油述類型的轉(zhuǎn)徹換時，病程情可以變化，案但其機制及涌意義還有待卷于對細胞因樸子在免疫網(wǎng)墾絡(luò)中的作用喪進一步分析發(fā)后方可闡明召。Th細胞鳳功能低下則噸可影響機體嚴的抗體產(chǎn)生借及CTL的素作用。隱3柄、鞠細胞因子救在實驗動士物及病毒感匆染者研究中那發(fā)現(xiàn)，個別添病毒感染后叢雖CTL有困抗病毒作用館，但并未發(fā)臥生靶細胞死迷亡的現(xiàn)象。鳳這一現(xiàn)象在壯神經(jīng)系統(tǒng)病千毒感染，以警及乙型肝炎舉病毒持續(xù)感冊染中已被證氧實，其機制漁是由于釋放題IFN－助等細胞因子繁所致。有人迷稱這一現(xiàn)象妹為非溶細胞攀性T細胞的洗作用，即通廚過CD陶4凈＋疾T細胞在感冒染病灶的聚悅集，受特異瞎的病毒抗原丸所激活，分河泌大量抗病蛛毒因子（I恥FN、TN妥F）。這些畝細胞因子又樣可進一步激墊活T細胞（券CTL，T劇h細胞）坊、坊巨噬細胞或兵甚至NK細驕胞，在抑制串病毒復(fù)制及槐清除靶細胞悶內(nèi)的病毒協(xié)綿同發(fā)揮作用賓。拳腺病毒六鄰湊體蛋白的L硬oop1、嶼Loop2祝是較好的中賠和抗原決定浮簇，本實驗融組已經(jīng)對這隸段基因的進劑行了克隆、導(dǎo)表達并優(yōu)化惑表達條件，才現(xiàn)將其大量善表達，純化孟重組蛋白，慈并進一步進枕行活性鑒定反，用作抗原蓮動物免疫，回并檢測其所嫌產(chǎn)生的抗體百。通過中和在實驗檢測其譽體外保護情渡況。應(yīng)用該凈方法進行疫鋤苗的研制，毛將是一種安肌全、可靠、課行之有效的竄方法。因此怎本實驗組針伏對Loop堆1、Loo夢p2區(qū)(六暑鄰體抗原決身定簇所在區(qū)不)的基因工威程疫苗的研宅制，將可能籌成為未來高擴效疫苗研制池的一個重要斬手段。付前倉言暗腺病毒卵(Aden皺oviru陶s)昂是班DNA答病毒率,竭可引起多種庸疾病傻,莫如呼吸道感臉染、流行性這角膜結(jié)膜炎查、腹瀉等。雞目前已知的符人腺病毒有牧41朝個血清型帖,建其中某些型威別無論是在過成人中還是尋在兒童中可愿引起急性呼謎吸道感染的乖現(xiàn)象已經(jīng)備充受關(guān)注臥[向40、41定]漫,研其中人薪3筐型腺病毒尖(Ad3)贊是引起急性予呼吸道疾病藍和咽膜熱的鋼常見病原體鬧,對嚴重者可引接起支氣管肺肆炎。200土3年受“階非典圍”拴在我國部分補地區(qū)流行以使來，給我國捧人民生命健酬康和國民經(jīng)刮濟帶來了極制大的危害，據(jù)也給人類上宜了嚴肅的一特課。因而，康開展對遠比折冠狀病毒種方類多、宿主壩范圍廣、感攜染途徑多、倍致病性強、根病死率高、腥危害嚴重的僵腺病毒的預(yù)舞防性研究具類有重大的社滾會意義和經(jīng)哭濟意義。奇預(yù)防傳染性矩疾病的最好啄方法就是疫手苗，目前，夢3、4、7把型腺病毒口假服減毒活疫短苗經(jīng)國外小厚規(guī)模應(yīng)用已趙證明有預(yù)防路效果，但尚住未大規(guī)模生瞞產(chǎn)和應(yīng)用麥，國內(nèi)還沒伴有相關(guān)報道管?；蚬こ滔右呙缯谘械曛七^程中。藍六鄰體是腺散病毒感染的爪主要抗原蛋唱白，其中門Loop1且、矛Loop2燦區(qū)是較好的炕中和抗原決盡定簇，能夠賢刺激機體產(chǎn)脈生相應(yīng)的抗頭體，抑制病搏毒體構(gòu)象的標(biāo)改變，從而支中和病毒體核，本實驗通搖過免疫家兔驕，觀察其狀噸態(tài)變化，檢劑測其血清中幅抗體的產(chǎn)生制及特異性，蚊并通過體外蘇實驗驗證了域其具有保護丹作用，為今錘后研制高效呆、無毒的腺灑病毒基因工教程疫苗奠定冤了基礎(chǔ)。實驗材料德一抬、碗菌株及病毒龍1糧、虜工程菌大腸籃桿菌M15框pQE31跳Hexon藝本課題組構(gòu)回建碼［42］栗。渡2肢、搏Hela真細胞、人腺調(diào)病毒3型病疼毒、感M15菌株吵由哈醫(yī)大微折生物學(xué)教研介室保存。朽二拜、現(xiàn)主要試劑盒騾1翅、怠SDS-P姿AGE中分課子量標(biāo)準(zhǔn)蛋薪白質(zhì)購自中款科院上海生墨化所。線2照、吳Ni-ag希arose斃層析柱購自榨QIAGE炮N公司。糞3濾、連DAB顯色取試劑、羊抗即兔于IgG澆抗體購自中帝山生物制品邀。煩4種、罵預(yù)染Mar與k那er佩購自中山生術(shù)物制品有限吃公司。伸三許、抄主要試劑及鳥配制方法妨（一）SD最S-柄PAGE慕電泳所需試塞劑安青1陸、概跳12%SD則S-PAG敞E廟分離膠黨涉層餅10.0臣ml播屈ddH月2滴O店妄革疫此感偶3.3跌ml東鉗30%丙烯右酰胺溶液傘掀太4.0殺ml仍桂1.5娘mol/L退Tri慶s-cl(曉pH8.8鴿)奸翻2.5m紀l是宜10%SD纏S茄安0.借08機ml撇積10%口過硫酸銨享綢0.08京ml議乖TEMED線眼照0.008殃軍ml燕2躺、徹5%SD蹲S-PAG曬E積層膠陣記芹每帽糕3.0ml何秩ddH李2細O鵝虜曬2.1揉ml原世30%丙烯擾酰胺溶液綱聯(lián)壞0.5犧ml忠攔1.0勸mol/啞LTri妨s-cl(絲pH眨6.8鴿)估乞0.38田ml屈10%SD遺S樸界集崇扭0.03篇ml站岡10%金過硫酸銨柔義0.03材ml種級TEMED煎蛋肌0.003儀ml邊3亭、休30%丙烯介酰胺溶液敞誤丙烯酰昏腸左哪完地背30.0攝g怎宣章唇殼拿亞甲雙丙烯養(yǎng)酰胺恥憤確狹烤0.8廊g花慮離子水（晚ddH鑄2武O港）攤恐誦撐100.金0田ml捏4純、索10%過硫粒酸銨盈1華g艘過硫酸銨溶徐解于10輔ml委的水中，于篇4慈℃坐貯存。室溫微、綠避光保存。僻5翅、滴2拖X禿SDS凝膠壁加樣緩沖液警4素X鞋Tris堆-HC牽l/SDS彈,Ph6.澇8(0.1駝mol/L誘)磁福2記5柏ml急學(xué)桐甘油擁[20捧%（崇W/V作）]豬私著石赤媽20ml以謠被SDS防[4%（機W/V芹）]位千趨哪4丑g緞尾長棋溴酚蘭[便0.00合1%（盲W/V娛）飛]福紀圍1溫mg刺幅加有ddH在2析O真至100參ml淡并混勻，等財量分裝成1楊ml直于-70聽℃男貯存。既6土、饅5搭陸X蜜蔑Tris-澡甘氨酸電泳爽緩沖液哪Tris堿屆頃15.1蘆g跡兩G刃l(wèi)ycin扒e賠（噸pH8.燈3烘）窄鋤94.0斗g逃擋SDS(雪電泳極戒)勝兄博爸嘴5歷.0娛g滾刃加看ddH敬2泰O單至1000印ml毫，使用時1蘭：5稀釋，蠟室溫貯存。豈7瘦、趨0．25%漏考馬斯亮蘭防R懼250碧染液仗取考馬斯亮暮蘭結(jié)R辭250說1.25仆g銜，溶解在5軌00偏ml面甲醇：水：杏冰乙酸=4誦5：45：悲10（體積島比）的溶液余中，用郊whatm漁an堵1鹿號濾紙過濾其，于室溫保簡存?？?溝、殲高濃度脫色謠液士甲挺醇：水：冰期乙酸=45床：45：1款0（體積比筍）混勻于室扮溫貯存。啄佳9擁、暢低濃度脫色豈液池綿甲醇：水：訴冰乙酸=木3祖：子1犧：循6牽（體積比）眼混勻于室溫莊貯存。饞仙10仇、勸8．1刃mol/進L訂DTT（濤二硫蘇糖醇蛇）革用20擺ml啦0.01偏mol/L莖乙酸鈉溶齒液（傲pH凱5.2）溶玩解3.09杠g穴子DTT爆，過濾除菌泉后分裝成1葵ml前小份貯存則于-20按℃極（二）純妥化試劑挨1填、弊Buffe俊rB(剪裂解液護)補磷酸二氫鈉在賞朋13.地8振g蜘Tris煙堿陪伸序1.2這g崇尿素環(huán)嘉顧猴480.5德g煩加懸ddH碌2短O賞至1000捕ml,尚用N軟aOH膜調(diào)僑pH游至撐8.0豪。型2做、騰陜Buffe蜘rC(鼻洗液賄)龍磷酸二氫鈉節(jié)染世13.8決g紛Tris疼堿挺峽疑戶1.2乏g那尿素剪辟辮悲480.5妹g爆加斤ddH五2姥O怖至1000是ml,鬼用N耕aOH垮調(diào)毛pH導(dǎo)至6.3?；?剃、跳訪Buffe堂rE放（洗脫液什）窮磷酸二氫鈉錘遲搭13.8波g塘Tris況堿盈眾叔只1.2居g籍尿素理檢杜妄井480.5值g費加糾ddH歉2斤O挑至1000竭ml,么用N井a(chǎn)OH疫調(diào)漲pH刊至頑4.5值。玩（三醬）默Weste復(fù)rn-bl揚ot所需試傭劑企1飲、搖電轉(zhuǎn)液張則螞也漁1L境蛾Gly饒cine口會藍嘴2.陜9g疲鋼Tri這s堿蒙葵訊轉(zhuǎn)5.8社g馳類SDS適頓脖垮極0.3努7g續(xù)寶甲醇死糖辣斧杰200ml黎用d核dH肆2呆0定容至蜓1L弱2恩、膊封閉液（5跳%脫脂奶粉校）耐茫脫脂奶奶粉碎吊善斬5g瘦捐PB誦S定甘屬富1炸00ml善3浩、揮1%BSA樣BSA罩期煤蓮艦1g艱PBS方前械川渾100m驅(qū)l述4爬、宰PBS(郵0.02M斗PH滋7.4)陳1L菊Na起Cl診草點膜劫8g元阻K乏Cl膏貿(mào)涉況檢0念.2g廚Na工2揪HPO拾4撿.12H綁2驕O聰捆斯3.6g梅KH哭2環(huán)PO去4龜幸種莫斑0.24怪g化dd貓H竄2蜘O廉綱虹擠80尼0ml露定容至10采00ml寺調(diào)PH至7之.4陪(四)應(yīng)等細胞培養(yǎng)液落1儲、梨生長液：黑1X164鼻0喬培養(yǎng)液勉甚票峽濤88%用擇境胎鉛牛血清拾倒拾金橡1羽0%比袍螺雙猜抗（P、S甜）廊漿袖疼1%活用5.6%聽NaHC盈O涉3扯溶液調(diào)pH趁至7.2-替7.4躁2澤、撫維飄持液：家DMEM液葡疼刑熟先潛96%吐網(wǎng)滅恭胎牛血清櫻濾兔滴鬼趕2%即繁午仿雙抗（P、擴S）褲威懂搜模1%蘋用5.6%信NaHC凈O選3央溶液調(diào)pH那至7.2～腔7.4盛(五)SB峽培養(yǎng)基及其耳所需試劑印SB培養(yǎng)將基血胰化蛋白胨誠甘20端g住酵母提取物碗偵10斥g周氯化鈉冊咱10右g企加去離子水殖牙950ml驗并攪拌使之爪完全溶解，濫用5滋mol/L御的N脂aOH荒調(diào)pH值至翅7.0，定茫容至1L，倡高壓蒸汽滅盲菌蹦(15挖磅，1.0誠34佩×游10思5遞號Pa幅)20～3匹0揚min濟，4挺℃項保存。水芽（六）其彩它常用溶液引1囑、標(biāo)1梢mol/L匆HC雨l干按以下順序噴混合化913.8杏ml標(biāo)指駐H慈2藥O競戰(zhàn)86.2金ml拳深濃鹽酸突2恩、貢10績mol/L羞N觸aOH倡庫將400秋g帳N鍬aOH境溶于450門ml魔水中，補加拼水到1L，選高壓滅菌。姻3而、茶0.5腔mol/事L少EDTA鞭（乙二胺四銜乙酸）竭稱取186茶g薦EDTA賄溶于800由ml雪去離子水中泊，加入N膚aOH裹調(diào)工pH祥8.0，補所加水至1L僑，高壓滅菌導(dǎo)。餅4昆、來50%甘油歡50疤ml疤甘油，加水辭至100柄ml姥，高壓滅菌陳。浴5云、綿10%S率DS料在900窗擾ml峰水中溶解1秧00彎g缸SDS，照加熱助溶，護加入濃鹽酸富調(diào)節(jié)溶液的艷pH代值至7.2蛋，加水定容殺至1L，分傍裝備用。亞頃煤6疫、饞IPTG繡（異丙基硫慣代-硬β裝-D半乳糖爪苷）放在8和ml巖蒸餾水中溶菜解2掛g皂IPTG后捆，用蒸餾水以定容至10猛ml嫌，用濾膜過來濾除菌，分魄裝成1慶ml攜小份，-2娘0懇℃繡貯存。驅(qū)7床、裙1毛mol/L筒效T有ris微在800視ml葉水中溶解肝121.君1局g諒粱Tris豆堿，加入濃歉鹽酸調(diào)節(jié)梢pH賀值至所需值驗。虜衫砍虎進PH壺疼扁錦鈴吩撐介藏HCl飾渴幕懸7.4污扁70ml狐童7.6懇陸極倦沖知60ml黎艱艷菊禾性8.0咽熊敵合膛免42ml屋應(yīng)使溶液冷集至室溫方可是最后調(diào)節(jié)賣pH斬值，加水定主容至1L，冤分裝后高壓癢滅菌。圍8泥、逐乙二胺四乙發(fā)酸鈉（ED掃TA）垂用去離子水先溶解EDT為A，濃度為熔0.02%撐，高壓滅菌銀，分裝小瓶刷，于4智o施C支冰箱保存。此9秋、棟青/鏈霉素滴儲存液（1漆0000U姿/mL青霉粘素和10m長g/mL鏈敵霉素）障稱取121秒mg(16值50U/m磨g)的青霉諸素和200唉mg鏈霉素蝴，溶于20榨mL去離子釣水中，經(jīng)0蛋.22例μ傳m的濾膜返濾過除菌，況分裝并儲存搏于－20道o腰C刪避光保存。軋使用時以副1悔:暖100參倍稀釋。純四缸、改主要儀器設(shè)蓮備繭Herae倍usBi課ofuge造17RS罩槽型低溫高速哭離心機魯HITA知CHI供低溫高速離糕心機只TLT-1圣3V-85禽V14回型超低溫冰癢箱撫Minsk催16E欺冰箱林WS2磨-261-喚79HW侄1棄型恒溫水浴還箱毅HH.B1熄1-500閣餃型恒溫培養(yǎng)紫箱德ML-90校2廟型定時恒溫旦磁力攪拌器黨Micro祥fuge醒Lite罪溝離心機惹THZ-C弊染恒溫震蕩器偉Bio-R蝕AD100督0存/屋500蹲型電泳儀再ZF-4泡型紫外透射鬼反射分析儀廳LIBRO吹RHEL儀-200萄型電子天平寫UV-26照5言風(fēng)光光度溜計，頃Shima嚴duzu溝QL-90爐1爪型旋渦混魄合洽YJ-87汗5因醫(yī)用凈化姓工作臺議DT-BI尼型脫色搖束床拔Milli娘-Q沈型純水器爬HW-8B很型恒溫器況松下砌NN-K5屬63S方微波爐實驗方法滋一、大量誘逆導(dǎo)表達目的開蛋白昂[42]擇1銜、懸將重組工程你菌M15/翅pQE31毫hexon蹦接種在含氨始芐（100盤ug/ml兔）和卡那（丙50ug/濁ml）的培巴養(yǎng)基中培養(yǎng)漆，同時設(shè)空杯白菌M15附作對照，過朋夜培養(yǎng)。劃2輩、殖將菌液按1煮：50的比拉例轉(zhuǎn)接到8噸00珠ml做LB培養(yǎng)基氣中，當(dāng)菌液常的OD趴600困值達到0.筐5時，加入圾IPTG(濫誘導(dǎo)劑)至撈終濃度為1獎mM進行誘障導(dǎo)，37情℃慮，150轉(zhuǎn)等/分鐘，培戶養(yǎng)4小時，證離心，60編00帝rpm膏，宗10min炊，收集沉淀開。同時取不君加誘導(dǎo)劑的返菌液作對照倍。還3遠、宗加入2單×躲SDS上樣繳緩沖液，煮答沸5分鐘，蘆進行SDS禍竟電泳，檢測蕉蛋白表達情粒況。挨二、六鄰體己蛋白的純化捧（一）裂解場細菌阿1但、統(tǒng)加入12吐mlBu葉ffer璃B惡，充分混勻岸，裂解細菌開，1赤h另；汽2則、夕輔助超聲，烤工作10丙s榜，停10追s以，功率40懼0鉆w，眾工作次數(shù)2慌0；邁3元、面溶液澄清后希，離心，1港2000泳rpm求，模25min宿；趨4姻、殲收集上清液素，以備純化垮；尊（二）大量怠純化目的蛋駕白界1、逃加3.2處ml鹿50%嗎Ni-NT襪A暑的混合物偶于12曲ml獨裂解液，室慰溫下?lián)u床振論蕩60破min霧；妥將裂解液-鮮樹脂混合物辣移入空的柱誰子；困移去尾端帽俗，收集流出轟液墊；窮2、盡用8物mlBu恩ffer廢C偽洗去未結(jié)合兩Ni-NT冬A遣的蛋白；規(guī)3、靠用8詢mlBu葡ffer旱D忠洗脫目的蛋石白；夠4、幼用4舟mlBu筆ffer彎E揭洗脫目的蛋時白；艦三、蛋白定附量煤箱Bradf皺ord法鍬[43]對1滲、妻標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)癢溶液：用P斥BS配制結(jié)梨晶牛血清清倦蛋白（BS茂A）成10扶mg/ml避的標(biāo)準(zhǔn)蛋白侮溶液。果2辱、埋標(biāo)準(zhǔn)曲線的書測定：取7濫個EP管以帖10mg/泥ml的BS紋A為母液分傲別配制0，錄0.1，0盤.25，0瞞.5，0.舉75，1.擠0，1.5往mg/ml雞的標(biāo)準(zhǔn)蛋白眨質(zhì)溶液；另及取7個EP若管每管中加燒入300住μ物l汗考馬斯亮藍正G-250你試劑，并在梳各管分別加守入以上濃度刻的標(biāo)準(zhǔn)蛋白開質(zhì)溶液5意μ桂l碎，在室溫（懸20~25乒?墻C）下放置嗎5-15m代in，通過掌蛋白質(zhì)－核趕酸微量檢測刊儀檢測。用眼標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)幫量（mg）剃為橫座標(biāo)，紙用吸光度值和A595為嬸縱座標(biāo)，作申圖，即得到稠一條標(biāo)準(zhǔn)曲曾線。由此標(biāo)通準(zhǔn)曲線，根支據(jù)測出的未秩知樣品的A蹄595值，吵即可查出未爽知樣品的蛋近白質(zhì)含量。率用未加蛋白窄質(zhì)溶液的第搖一支試管液豎作為空白對降照液.梅3駛、涂樣品的測定再：用上述同巨樣的方法，訓(xùn)測定未知樣穿品的蛋白質(zhì)憲濃度。順?biāo)摹游锩庳氁咿p1患、且初次免疫傷將500u光g純化的重驚組人腺病毒借六鄰體亞基砌蛋白與完全揭弗氏佐劑等植體積混合，拖碾磨至油包絨水狀麻[44]計。背部皮下旨注射新西蘭華家兔，觀察場記錄家兔的陸狀態(tài)變化.殼2討、售2周耳緣靜亡脈進行采血頓，離心分離科血清,分裝如保存至-2噴0度冰箱中饞.腹3懲、雄加強免疫剪第3周，以事減半量(2胸50ug)具純化的重組夾人腺病毒六涂鄰體蛋白與識不完全弗氏誕佐劑等體積棟混合,采用竹通過注射入惕腹腔的方法撐進行加強免涂疫。觀察記雨錄家兔的狀糖態(tài)變化.膨4耽、狹第4周耳緣鞋靜脈采血，茫離心分離血嶼清,分裝保爛存至-20短度冰箱中。譯檢測抗體效栗價。根據(jù)血霧清效價決定挺大量采血，騾第6周心臟烏采血，離心雹分離血清,僻分裝保存至悲-20度冰舞箱中。盒五．重組蛋啟白抗原性鑒歪定（wes鏟tern-禽blot）朽：孟（一）抗原賴性鑒定戀1、捎安裝玻璃板期2、睜配制12％查的分離膠溶南液，依次混孫合各成分。素1鑼5盾%SD患S-PAG完E尼分離膠體武量考10ml亦躁ddH賓2綢O維動淺掠律搭3犧.3優(yōu)ml智使30%丙烯途酰胺溶液與來順4.0砌ml皆吧1.5漿mol/L涌Tri太s-cl(謊pH8.0漢)寒而2.5m弱l夸意10%SD曾S坦衫0.1m據(jù)l占嚴10%簽過硫酸銨需處0.1召ml遠夢槍TEMED朗它叉堡苗凳董仍0.004械菊ml碌一旦加入T喜EMED，區(qū)馬上開始聚貴合，故應(yīng)立及即快速旋動劍混和物并進擔(dān)入下步操作駛。勸3、曲.速在兩玻政璃板的間隙斃中灌注分離莫膠溶液，留鈔出灌注積層懸膠的空間（辟梳子的尺長耳再加一厘米岸）。用吸管撈小心的在分妻離膠溶液上繡蓋一層異丁助醇。將凝膠東垂直放于室啟溫。蒜4、括分離膠聚合生完全后（3鉆0min）傅，清出覆蓋厚液體，用去臭離子水洗滌徐凝膠頂部數(shù)申次以除去未元聚合的丙稀巖酰胺。盡可材能除去凝膠集上的液體，拌再用紙巾的史邊緣吸凈殘鏡留的液體。遺5、倒配制5％積廢層膠溶液，遠依次混合各柱成分。囑5%SD奸S-PAG解E積層膠藥綢桌饑3ml中ddH拾2旬O燥秧發(fā)2.1緣ml華勾30%丙烯豪酰胺溶液高飄虛0.5飼ml儲跡10%SD襖S漢盒0.03方ml枕帖1.0絕mol/骨LTri跨s-cl(低pH前6.8僅)脹扣脂0.38你ml哄億10%勉過硫酸銨克未0.03仰ml鄙分TEME脊D素耍捆逃喬風(fēng)文0.0仿03旅ml翻一旦加入T坊EMED，梳馬上開始聚所合，故應(yīng)快側(cè)速旋動混合璃物并進入下悔步操作。竊6、敲在已經(jīng)聚合螺的分離膠上揭直接灌注積識層膠，立即翅在積層膠溶劃液中插入干嫌凈的梳子。優(yōu)小心避免混閉入氣泡，將瓶凝膠垂直的撐放于室溫下芽。闊7、艦積層膠發(fā)生黎聚合時，可挨以在樣品中策加入2透×顯SDS凝膠擾加樣緩沖液塔，在100味℃溜加熱10分貍鐘，使蛋白移質(zhì)變性。魔8、送積層膠聚合森完全后（3獎0分鐘），川小心移出梳物子，立即用棋去離子水洗德滌加樣槽以荒除去未聚合譽的丙稀酰胺秧。哪9稱、叉按順序加樣乞，每加完一不個樣品后在休下槽緩沖液俊中洗滌加樣眼注射器。最耽后在所有不檢用的樣品孔凍中加入等體榴積的2已×尖SDS凝膠痰加樣緩沖液糖。它10、豪將電泳裝置太與電源連接蠟（正極應(yīng)接倘下槽），凝螺膠上所加電苗壓為8V/列cm。當(dāng)染豆料前沿進入良分離膠后，苦把電壓提高怠到15V/授cm,繼刮續(xù)電泳直至治溴酚藍達到征底部，然后梁關(guān)閉電源。渾11、票從電泳裝置相上卸下玻璃世板，用刮勺鄙翹開玻璃板側(cè)，將膠取下灘。殺12、撕經(jīng)SDS-拾PAGE電跪泳后，將凝標(biāo)膠與6層濾攔紙、NC膜磁浸泡于轉(zhuǎn)膜命緩沖液中，錘15分鐘。玩13、傳修剪膜與濾和紙使其與凝死膠大小相等伯，半干轉(zhuǎn)印稠45分鐘。躍14、慧轉(zhuǎn)印后取膜敬置于5%脫朝脂奶粉中，緩4統(tǒng)o屆C過夜?？?5、堵加入一抗：完以封閉液1學(xué)：2000斷稀釋兔血清閱為一抗，將穴膜浸泡于其裳中蓋上盒蓋卻，37畏o棋C緩慢搖動靠，1小時。萍16、固漂洗：以P惰BS（PH丈7.4）清癥洗NC膜1忌5分鐘3鈔次。釀17、預(yù)加入二抗：拋以封閉液1納：5000櫻稀釋辣根過配氧化物酶標(biāo)聰記的二抗，駱將膜浸泡于愈其中蓋上盒容蓋，37康o奧C緩慢搖動腫，1小時。暴18、勞漂洗：以P緩BS（PH死7.4）清錄洗NC膜1負5分鐘3破次。躲19、壘顯色：DA叨B顯色，在建4mlSo及l(fā)utio綁nB中，棚滴入4ml及Solut諒ionA科清清搖動，相將NC膜浸慰入其中，觀點察2-10限分鐘，終止尾顯色，照相述。動（二）抗體報效價檢測俗進行SDS錯奉后，將兔血悶清一抗從1續(xù)：1000秩開始按倍比盡稀釋，直到細檢測不到特菠異性條帶,獎進行免疫印顛跡試驗，結(jié)請果照相保存核。炎六鈴、竹特異性鑒定伴按上述方法飛以1：10孫000倍燦稀釋的兔蛋止白血清為一湖抗與重組蛋亂白、BSA進蛋白、3型懼腺病毒、柯后薩奇病毒、挨E.col療i功M15菌株織和細胞進行萄Weste徹rn-Bl備ot檢測，另結(jié)果照相保旺存。鉗七釋、懶體外保護試班驗：梳（一）腺病國毒毒力測定條－TCID瓣50臣1國、扶細胞培養(yǎng)菠（1）斃選生長良好先的妹HeLa細靠胞，輕輕搖便動培養(yǎng)瓶數(shù)盼次，懸浮起湊浮著在細胞也表面的碎片炒，然后連同炎生長液一起燦倒出。咱（2）授從無細胞單區(qū)層的瓶壁側(cè)吹加入0.0魄2%EDT典A消化液4瞧～5mL，域翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶前，使消化液漂浸沒細胞。麗（3）確放入37繪o主C勵二氧化碳孵鏈箱5～10壟分鐘，為錯促進細胞的揮消化，可以蠟加入37蒜o章C析預(yù)熱的消化鞭液，在顯微劑鏡下觀察，蝦發(fā)現(xiàn)細胞回灑縮、細胞間肅隙增大后，幣應(yīng)立即停止騰消化。披（4）靠倒出消化液趨，沿細胞面嚷加入適量的沃生長液，用玩吸管反復(fù)吹目打瓶壁細胞愁，使細胞分沉散開，按1慰傳2或1傳記3進行傳代夏培養(yǎng)。充（5）林粉37看o喜C望二氧化碳孵誠箱培養(yǎng)，接儀種后30分遵鐘左右可貼冬壁，48小警時更換生長好液，一般3斃～4天可形鳴成單層，形狠成單層后再帽換維持液供掙實驗用。就2、寺病毒接種儉倒掉細胞培妥養(yǎng)液，將腺勒病毒懸液以頑１０倍比例濫進行倍比稀剖釋至10挑-9渴,每孔20舊0ul，3士7頓o煤C潮吸附1.5述小時，棄上瞇清，各瓶中史換3mL含盲2%胎牛血益清的細胞維厭持液，在3厲7棋o腹C按二氧化碳孵連箱中常規(guī)培著養(yǎng)。瘡3、杜觀察細胞病菜變積每隔12小竄時用普通光代學(xué)顯微鏡觀忽察細胞病變齊（CPE）屋情況。當(dāng)5托0%細胞出管現(xiàn)病變時，虹視為CPE章陽性細胞，俘收集細胞，栽對72小時鑰未出現(xiàn)細胞名病變的竄接種細胞，某視為CPE寇陰性細胞。伴同時，設(shè)定己正常較HeLa院細胞為陰性厚對照，以接沒種相應(yīng)病毒貓標(biāo)準(zhǔn)株的截HeLa魔細胞為陽性失對照。按照肚Reed-慢Muenc路h方法計算穴TCID磨50駐[45]享。薄(二)轟中和試驗（劉固定病毒-傳稀釋血清法頭）后寸本試驗盆用于鑒定爹兔歷血清中是否威含有抗曬腺病毒頭的中和抗體膝。崗試驗準(zhǔn)備胳1遲、緣Hela按細胞培養(yǎng)于離96孔微量疤細胞培養(yǎng)板奧上。津2因、廣病毒盲腺病毒懸液刮，使用前用蟻2%RPM賴I1640辟細胞維持液奔液稀釋至兔200助TCID婆50與/0.1m陷L。唉3靠、算血清待席檢血清和正爆常血清（陰擋性血清）用報等量的優(yōu)2%RPM傭I164繁0騎液（每毫升魚含青霉素2財00IU、懲鏈霉素20徹0mg）稀鐮釋后，于4清5腹℃巨滅活30m燥in，待冷悉卻后使用。博職筐操作步驟墾宅滿1朽、酷將已滅活處帆理的待檢血睜清，用扣2%RPM磨I164擋0細胞維持誕液作系列倍芬比稀釋，使障其胃血清筐稀釋度由1儀∶液50崇到1剝∶堤12800恢.勁罵桐2篇、撓分別在上述竊各管中加入病等量賺的礎(chǔ)100猶TCID專50湯的湖腺病毒加懸液，充分銳搖勻混合?；钍?督、豪于3隨7尾℃副溫育60m廊in?？环?紹、汪取出后分別炮接種于長滿題Hela真細胞單層的嚷96孔微量敞細胞培養(yǎng)板跳，每個稀釋瓶度窄4嚷孔，每孔0織.1mL。鳥雁號5歪、錄按上述步驟桑設(shè)立正常血莊清對照；將禽腺病毒柄懸液連續(xù)1臥0倍稀釋后綿（10棗-1今～10撥-7累）接種上述砌培養(yǎng)板，每瓶稀釋度4孔關(guān)，每孔0.懂1mL，作蟻病毒懸液毒已力滴度對照書；96孔微克量細胞培養(yǎng)般板H排12包孔作為正常歐細胞對照。含薦隔6畜、負各孔加入細跨胞維持液至歲總量0.2莫mL。層莫7府、炒放入炭37祥℃批培養(yǎng)箱培養(yǎng)詢，逐日觀察宋病變，記錄朗結(jié)果（按表嘉3填寫）。結(jié)果掏一滑、聞Hexon飼L1瘦、幅L2秤蛋白的誘導(dǎo)普表達：豎將重組工程輪菌蹤M15蒼/欣pQE31意hexon向與空白對照夠菌毀M15誓培養(yǎng)后加入尋IPTG標(biāo)誘導(dǎo)表達4粱h。用1婚2%的分離傻膠進行笛SDS-P忠AGE栗電泳分析，宅電泳結(jié)果表曬明在相對分箭子質(zhì)量(摔M廊r弊)約為52允×謎10霞3溜處可見一目葉的條帶，與彩預(yù)期結(jié)果相隱符，見圖3宏。廣滾平M斧r覽（旬×呼10縫3內(nèi)）貍箱M1頁2練394.067.094.067.043.030.020.114.4離圖3六鄰與體蛋白的誘嚷導(dǎo)表達犯Figur蘆e3敲expre綢ssion敘ofp抓rotei挺nhex元on肺M:mar躺ker港1:M1迫52:儀unind章uced齒3:in割duced粥ure0面二洪、挺純化結(jié)果：概經(jīng)群Ni-NT促A晚柱大量純化裙后，用12蓋%的分離膠棉進行果SDS-P我AGE件電泳分析，餡電泳結(jié)果表暖明在相對分凡子質(zhì)量約為刑52布×終10樣3首處可見一目銹的條帶，且拘純化效果理踩想。結(jié)果見芹圖4、5。他M叮r（徒×盈10異3棕）94.067.043.030.020.114.4冰衡泳M刑正1治23覺殘振494.067.043.030.020.114.4熟渡膨圖4蛋遷白大量純化促（一）亞肌Fig羅ure綁切4章Lar憲gely扭Puri公fying天Hex滋onP換rotei候n燃M駝：渣marke餐r1鼠：鬼unind古uced曠2公：熄induc克ed3蔬：簡wash悼14露：爛wash酬4取扇沒5遍：倡wash近8陳6科：千elute養(yǎng)13臥7很：譽elut嗚e16伍M劇r龍（伐×鞭10韻3欠）痕M攀踢12果3賓事45劈6腦794.067.094.067.043.030.020.1桑圖5蛋廉白大量純化斧（二）天Fig腸ure伸搖5玩Larg慈ely坑Purif貴ying短Hexo切nPr壽otein窗勤輩M傘：mark陷er1飽：elut輝e19病2：el道ute2削13：姿elute吉23拿識4：el鐮ute2動65：柜elute吧29.儀.6：e惡lute撈327缺：elut暮e35絲埋三危、鬧蛋白定量差安通過考馬斯懲亮藍法（B編radfo鉛rd法），催繪制標(biāo)準(zhǔn)曲澤線，來初步扮判定純化的屢六鄰體蛋白令的含量。結(jié)陷果見表1事表1.媽蛋白純化標(biāo)揀準(zhǔn)曲線減table抬1.秤stan絡(luò)dard黃curve軍ofp斬urifi簽edpr斜otein略粱重組六鄰體端蛋白C=1川20ug/斑ml艱四謙、塊重組蛋白抗芝原性檢測墳（一）抗原耍性檢測摸用純化的重乎組六鄰體蛋歐白免疫斃兔子六周后得采血收集血啦清，用醋Weste炕rnbl榮ot加對血清進行款檢測，結(jié)果雙表明該血清久與重組蛋白咱能夠進行特運異性反應(yīng)，況沸在鄰M波r蹲52欠×擱10引3質(zhì)雁處出現(xiàn)特異打的顯色條帶勉。說明該重霉組蛋白具有墊良好的免疫捆原性和反應(yīng)垃原性，即具恭有良好的抗偶原性。盲機倦糕M1234便產(chǎn)醫(yī)灘驢M1234鵲怎M寨r墨（翼×陪10槽3禽）52kd52kd墳圖6重組蠶蛋白免疫原筑性鑒定帽Fig6虧iden仇tific動tion壞of篩immun涌ogeni運city壁蒸M諷：池prest武ain僻marke搜r雹,1:E.鄙coli敬M15,森2榆：抄unind丸uced挑研M15pQ封E31he篩xon還,蝕3改：顛induc憑ed處M15pQ輸E31he忘xon版,去4愿：德Hela比Cell設(shè)碼迫（二）抗體豆效價的檢測糊將抗六鄰體注蛋白兔血清診一抗按倍比丹稀釋法從1儀:1000崗稀釋至1:泳1024螞000，速與六鄰體蛋贏白重組工程慮菌進行We涌stern擱-Blot三檢測，結(jié)果視表明該血清梅被稀釋至1掩:102男4000許后仍然能夠移與抗原發(fā)生穗特異性結(jié)合戒（如圖7頑），說明該腰抗體效價極可高，稀釋百患萬倍后，仍酸然可以與抗胳原發(fā)生反應(yīng)網(wǎng)。夠M1韻2鉛34岸56賺7竟89饒101群112堆1352kd口指姥兔52kd功圖7抗體照效價檢測扁Fig7東anti忙body般titer哥test獨繡智附Mpr堅ostai休nmak烈er1.豐Ecoli倒M15,袍2.拋unind弱uced殖足M15pQ伴E31he洽xon怕,武坊3-13：楚induc耍ed讀賣M15pQ唉E31he晉xon冠dete僅cted余with反dilut穴edan鵝tiser莖afro彈m基1:100頁0(lan看e3)吩to1：委1024岔000(浩lane概13)沃五黎、季抗六鄰體永蛋白血清的蒼特異性鑒定脅肯用1：10禍000倍央稀釋的兔蛋少白血清與重筋組蛋白、B私SA蛋白、田3型腺病毒煎、柯薩奇病竭毒、跟E.col詳i羞M15菌株射和細胞進行豐Weste姑rn-Bl封ot檢測，貝結(jié)果該血清哥只與良重組工程菌侍E.col伍i朱M15士/路pQE31去hexon進菌株和3型雀腺病毒發(fā)生投特異性反應(yīng)谷，而不與E刮.coli違康M15剪菌株、BS線A蛋白、柯發(fā)薩奇病毒以璃及Hela估細胞反應(yīng)(起圖8)。搭123M456籮廈車M蘭r濫（拴×權(quán)10雖3細）123M456120KD52KD擾踏劫狠候120KD52KD劉圖8重組警六鄰體蛋白栗特異性鑒定飽Fig8指死speci佳ficit經(jīng)y英iden環(huán)tific句tion鋒of叢recom響binan街th洽exon偷1:in校duced洗雨M15pQ觸E31he餡xon牽,遼2筋：受unind徒uced秀猶M15pQ皂E31he促xon準(zhǔn),伴3種：授induc膨ed浙M15.縫M:pr扎estai檢n杏marke劑r柜,4匠：光BSA,5偽：騰Adeno領(lǐng)virus喉,6:c足oxsac輝kievi中rus咳六育、中體外中和實羨驗桶：賤（固定病毒丟-稀釋血清凝法）丙（一）腺病遼毒TCID蒸50叼的測定:喇每隔12小陰時用普通光脾學(xué)顯微鏡觀展察細胞病變宇（CPE）封情況,與正華常細胞(細腰胞呈梭形)很組相比，腺唉病毒感染的諒hela細比胞變圓，細輪胞彼此相連胞呈典型的葡蘭萄串樣改變祖。當(dāng)50%嘴細胞出現(xiàn)病逆變時，視為濟CPE陽性敢細胞，對7妄2小時未出旅現(xiàn)細胞病變控的柄接種細胞，描視為CPE法陰性細胞。疾病毒稀釋度擊出現(xiàn)CPE貍數(shù)川累積CPE董數(shù)諒未出現(xiàn)CP傻E數(shù)黑CPE比例嬸百分率潛10口-3肝4/4蜓9媽0捐9/9遺100早10糊-4冠3/4灣5桌1畫5/6羨83申10厘-5施2/4即2棍3炭2/5哪10擁10榮-6行0土0培7華0/11軍0辜表2腺病毒處TCID蚊50紹的測定結(jié)果億table練2TC注ID紙50獄ofa店denov湯irus堅1．計算各勢病毒稀釋度押陽性孔數(shù)目術(shù)（1）和陰鄭性孔數(shù)目（宣2）鞭2．計算陽輝性和陰性孔查的累積數(shù)孝陽性孔累計拴數(shù)由下向上租累積（3）射；陰性孔累治積由上向下鄭累積（4）賀3．計算陽的性孔的百分建比：比率（農(nóng)5）=（3驗）/[(3駱)+（4）弦]；鉗(6)=（溜5）×10牧0眠4．計算距震離比鐵距離比例=筋（大于50壩%的陽性百袖分比-50嚼）/（大于脅50%的陽貧性比-小于獵50%的陽禿性百分比）結(jié)=（寬83－晌50）/（演83－4陽0）=夏0.7回TCID惑50婆的對數(shù)=大毒于50%的丟陽性百分比梁的最高稀釋隙對數(shù)+距離鑰比例x稀釋逢系數(shù)的對數(shù)個赤皺

=蕉4燕+0.莫7嗓×猛1土=品4.7宇TCID受50鐵=10萬-許4.7欠/100惹ul任串反礦=（83-拋50）/(呆83-40艷)=0.7晴TCID5來0=10弱-4.7宜ml領(lǐng)10齊-2.7粥病毒懸液有世100TC姻ID50.庭（二）中和歷實驗結(jié)果現(xiàn)經(jīng)過觀察，廈在48小時坑后，空白對晴照孔和陰性眨血清對照孔綠細胞出現(xiàn)病餡變，細胞變長圓,呈典型監(jiān)的葡萄串樣竊,正常細胞扔孔內(nèi)hel倒a細胞呈正份常生長狀態(tài)辭。實驗組從靠1：50到舊1：800顛稀釋度he紹la細胞呈嚼正常生長狀羊態(tài)。1：1間600組有真3孔發(fā)生C診PE，至1階：3200澤稀釋度細胞筍全部發(fā)生C天PE.血蛋清中和抗體挖效價即能保院護50％的聯(lián)細胞培養(yǎng)孔繩不產(chǎn)生病變抹的最高血清擺稀釋度，本寸實驗中血清閑中和抗體效衣價為1：8深00。皇空白對照學(xué)正常對照腐1：50猾1：100評1：200泰1：400竄1：800兆1：160傭0貴1：320屆0取1：640窄0拐1：128淘00昏陰性血清諒1樸+譯+喉+蚊+桶+貼+逗2籌+抽+飲+院+拳+汁+景3餅+沸+鈴+殃+猜+造4久+忌+斯+辮+媽+誓+蜘表3中和實臨驗結(jié)果煙table悄3.ne糧utral袍izati皆onte喉st斧討躬論莖腺病毒的感揪染十分普遍崖，引起多種麗疾病，是兒恰童呼吸道感李染的主要病改原之一閉[10-1妨2],熟有的型別盡的腺病毒還伸會引起細胞策轉(zhuǎn)化，甚至役致癌勉［13］贊。目前尚沒倚有十分有效光的預(yù)防措施何，因而，腺不病毒基因工油程疫苗的研暴制和開發(fā)有杏著廣闊的前械景。A戚d菊v動擁六鄰體是腺閃病毒的主要握抗原蛋白兄,屯刺激機體產(chǎn)突生抗體，抑糧制病毒構(gòu)象身的改變，從援而中和病毒暢體。閑本實驗組構(gòu)號建了腺病毒籍六鄰體的L住1,L2區(qū)徑[46]琴，這些區(qū)域思位于在六鄰狐體的三維結(jié)貍構(gòu)圖上位于鑰三角形頂端崇(L1,更L2)