血清學(xué)試驗(yàn)資料

血清學(xué)試驗(yàn)資料第1頁/共45頁動物微生物血清學(xué)試驗(yàn)的概念由于抗體主要存在于血清中，所以將體外發(fā)生的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)或血清學(xué)試驗(yàn)。

第2頁/共45頁動物微生物血清學(xué)試驗(yàn)的特點(diǎn)特異性和交叉性

敏感性

可逆性

反應(yīng)的二階段性

最適比例與帶現(xiàn)象

用已知測未知

第3頁/共45頁動物微生物特異性和交叉性特異性

抗原只能與相應(yīng)抗體結(jié)合，而不能與其他抗體相結(jié)合。

交叉性兩種不同的抗原之間含有共同的抗原決定簇，則發(fā)生交叉反應(yīng)。第4頁/共45頁動物微生物反應(yīng)的二階段性

第二階段

抗原抗體復(fù)合物出現(xiàn)可見反應(yīng)階段。此階段反應(yīng)慢、需數(shù)分鐘、數(shù)十分鐘或更久。第一階段抗原與抗體的特異性結(jié)合階段，此階段反應(yīng)快、僅數(shù)秒至數(shù)分鐘，但不出現(xiàn)可見反應(yīng)。第5頁/共45頁動物微生物敏感性抗原抗體的結(jié)合還具有高度敏感性的特點(diǎn)，不僅可檢測定性，還可以定量檢測微量、極微量的抗原或抗體。第6頁/共45頁動物微生物最適比例與帶現(xiàn)象抗原與抗體結(jié)合，其比例適當(dāng)時(shí)才可出現(xiàn)肉眼可見反應(yīng)。抗體除IgM是5價(jià)，SIgA4價(jià)外，一般抗體都含有兩個結(jié)合位點(diǎn)（二價(jià)）；抗原則根據(jù)分子大小，有10～50個不等的結(jié)合點(diǎn)。當(dāng)抗原抗體比例適當(dāng)時(shí)，兩者結(jié)合后，尚有未飽和的結(jié)合點(diǎn)，可以繼續(xù)與游離的抗體、抗原或與抗原抗體結(jié)合物的未飽和點(diǎn)相聯(lián)結(jié)，逐漸形成愈來愈大的復(fù)合物，出現(xiàn)了肉眼可見反應(yīng)。比例最適合，出現(xiàn)反應(yīng)最快，反應(yīng)產(chǎn)物愈多。如果抗原或抗體過多，抗體和抗原結(jié)合點(diǎn)的聚合一開始時(shí)即達(dá)到飽和，形成小的復(fù)合物則不能繼續(xù)與相鄰抗原、抗體結(jié)合，不出現(xiàn)可見反應(yīng)，謂之帶現(xiàn)象。第7頁/共45頁前帶

后帶

第8頁/共45頁動物微生物可逆性抗原與抗體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合是可逆的，結(jié)合條件為0℃～40℃、pH4～9。如溫度超過60℃或pH降到3以下，或加入解離劑時(shí)，則抗原抗體復(fù)合物又可重新解離，并且分離后抗原或抗體的性質(zhì)仍不改變。第9頁/共45頁動物微生物用已知測未知所有的血清學(xué)試驗(yàn)都是用已知抗原測定未知抗體，或用已知抗體測定未知抗原。第10頁/共45頁動物微生物影響血清學(xué)試驗(yàn)的因素電解質(zhì)：血清學(xué)反應(yīng)須在適當(dāng)濃度的電解質(zhì)參與下，才出現(xiàn)可見反應(yīng)。0.9%氯化鈉溶液。8-10%溫度：在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，抗原、抗體分子運(yùn)動速度越快，這可以增加其碰撞的機(jī)會，加速抗原抗體結(jié)合和反應(yīng)現(xiàn)象的出現(xiàn)。第11頁/共45頁動物微生物酸堿度：血清學(xué)反應(yīng)通常用pH6～8，過酸或過堿都可使復(fù)合物解離，pH值在等電點(diǎn)時(shí)，可引起非特異凝集。振蕩：適當(dāng)?shù)臋C(jī)械振蕩能增加分子或顆粒間的相互碰撞，加速抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，但強(qiáng)烈的振蕩可使抗原抗體復(fù)合物解離。雜質(zhì)和異物：試驗(yàn)介質(zhì)中如有與反應(yīng)無關(guān)的雜質(zhì)、異物存在時(shí)，會抑制反應(yīng)的進(jìn)行或引起非特異性反應(yīng)。

第12頁/共45頁動物微生物血清學(xué)試驗(yàn)的類型凝集試驗(yàn)沉淀試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中和試驗(yàn)免疫標(biāo)記技術(shù)第13頁/共45頁動物微生物凝集試驗(yàn)的概念細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原，或吸附在紅細(xì)胞、乳膠等顆粒性載體表面的可溶性抗原，與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時(shí)間，復(fù)合物互相凝聚形成肉眼可見的凝集團(tuán)塊，稱為凝集試驗(yàn)。第14頁/共45頁動物微生物凝集試驗(yàn)的類型直接凝集試驗(yàn)

間接凝集試驗(yàn)

第15頁/共45頁動物微生物直接凝集試驗(yàn)概念：顆粒性抗原與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)的參與下，直接結(jié)合，凝集成團(tuán)的現(xiàn)象，稱直接凝集試驗(yàn)。

類型：按其操作方法可分為玻片法和試管法。

第16頁/共45頁動物微生物1．玻片凝集試驗(yàn)方法：在玻璃板或瓷片上進(jìn)行。

特點(diǎn)：簡單、快速。用途：定性試驗(yàn)，如細(xì)菌鑒定、血型鑒定等。第17頁/共45頁動物微生物2．試管凝集試驗(yàn)方法：在試管中進(jìn)行。特點(diǎn)：準(zhǔn)確、耗時(shí)。用途：定量試驗(yàn)，如診斷布氏桿菌病，測定抗體的凝集價(jià)。第18頁/共45頁第19頁/共45頁結(jié)果判定結(jié)果用“+”表示反應(yīng)強(qiáng)度。++++：液體完全透明，菌體完全被凝集呈傘狀沉于管底。+++：液體透明，菌體基本被凝集沉于管底。++：液體不甚透明，管底有明顯的凝集沉淀。+：液體透明度不明顯或不透明，有不明顯的沉淀或有沉淀的痕跡?！阂后w不透明，呈均勻混濁，管底無凝集。有時(shí)有少量菌體集中于管底中心，呈臍狀，但振搖時(shí)，立即散開呈均勻渾濁。以出現(xiàn)“++”的最高血清稀釋倍數(shù)即為該份血清的效價(jià)，又叫凝集價(jià)。大動物（馬，牛，駱駝等）以凝集價(jià)1：100以上判為陽性，1：50的凝集價(jià)判為可疑。中小動物（豬，羊，狗等）以凝集價(jià)1：50以上判為陽性，1：25的凝集價(jià)判為可疑。如對照管不符合要求時(shí)，試管須廢棄重做。第20頁/共45頁動物微生物間接凝集試驗(yàn)概念：將可溶性抗原或抗體與載體連接后，再與相應(yīng)的抗體或抗原作用，所出現(xiàn)的特異性凝集反應(yīng)為間接凝集試驗(yàn)。類型：

間接血凝試驗(yàn)

乳膠凝集試驗(yàn)協(xié)同凝集試驗(yàn)第21頁/共45頁動物微生物致敏紅細(xì)胞紅細(xì)胞抗原紅細(xì)胞抗原致敏紅細(xì)胞被檢抗體紅細(xì)胞凝集間接血凝試驗(yàn)原理第22頁/共45頁第23頁/共45頁凝集強(qiáng)度判定＋（100%紅細(xì)胞凝集）：邊緣不整齊，有紅色顆粒布滿孔底）±（50%紅細(xì)胞凝集）V型孔：孔底可見紅色顆粒，中央有少量紅細(xì)胞沉淀－紅細(xì)胞呈點(diǎn)狀沉于孔底，無紅色顆粒。能使雞紅細(xì)胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)，為該病毒的紅細(xì)胞凝集滴度，即一個凝集單位。如表18-1-1的病毒血凝滴度為27，即將病毒原液作27倍稀釋，其中含一個血凝單位的病毒。由于病毒血凝抑制試驗(yàn)中需要的病毒液應(yīng)含4個血凝單位，因此，需要對原病毒液進(jìn)行25倍稀釋。第24頁/共45頁以能使100%紅細(xì)胞不發(fā)生凝集的血清最大稀釋倍數(shù)為該血清的HI滴度，以2的指數(shù)表示。

第25頁/共45頁動物微生物沉淀試驗(yàn)的概念可溶性抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時(shí)間，形成肉眼可見的白色沉淀，稱為沉淀試驗(yàn)。第26頁/共45頁動物微生物沉淀試驗(yàn)的類型環(huán)狀沉淀試驗(yàn)瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)免疫電泳第27頁/共45頁動物微生物環(huán)狀沉淀試驗(yàn)方法：在小口徑試管中進(jìn)行。原理：試管內(nèi)，下層沉淀素與上層沉淀原在液界面應(yīng)形成白色沉淀環(huán)。用途：主要用于抗原的定性試驗(yàn)，如炭疽桿菌的Ascoli試驗(yàn)、鏈球菌的血清型鑒定、血跡鑒定等。白色沉淀環(huán)沉淀原沉淀素第28頁/共45頁動物微生物瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)原理

1%瓊脂凝膠孔徑為85nm，能使許多可溶性抗原與抗體在凝膠中擴(kuò)散。當(dāng)抗原與抗體在凝膠中的一定位置上相遇時(shí)，則兩者結(jié)合形成沉淀線。第29頁/共45頁動物微生物瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)類型單向單擴(kuò)散單向雙擴(kuò)散雙向單擴(kuò)散雙向雙擴(kuò)散方法

用途

第30頁/共45頁動物微生物雙向雙擴(kuò)散方法此法系采用1%瓊脂倒于平皿或玻片上，制成凝膠板，可按需要打孔。將抗原、抗體分別滴入孔內(nèi)，放置濕盒中，在37?C濕箱中24-72h后觀察。第31頁/共45頁動物微生物雙向雙擴(kuò)散用途

抗原的比較和鑒定：在抗原與抗體孔間形成沉淀帶。每一種抗原成分出現(xiàn)一條沉淀帶。如兩個相鄰孔之間抗原相同，則沉淀帶融合，如1、2；抗原不同，則互相交叉，如3；部分相同則部分融合，另外不同部分則交叉，如4。第32頁/共45頁動物微生物免疫電泳免疫電泳技術(shù)是把凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)與電泳技術(shù)相結(jié)合的免疫檢測技術(shù)。即將瓊脂擴(kuò)散置于直流電場中進(jìn)行，讓電流來加速抗原與抗體的擴(kuò)散并規(guī)定其擴(kuò)散方向，在比例合適處形成可見的沉淀帶。第33頁/共45頁動物微生物補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

試驗(yàn)系統(tǒng)、原理和結(jié)果判定

反應(yīng)系統(tǒng)已知抗原（抗體）待檢血清（抗原）補(bǔ)體綿羊紅細(xì)胞溶血素如溶血則為陰性如不溶血則為陽性指示系統(tǒng)反應(yīng)結(jié)果的判定第34頁/共45頁動物微生物第35頁/共45頁動物微生物中和試驗(yàn)概念：根據(jù)抗體能否中和病毒的感染性而建立的免疫學(xué)試驗(yàn)。

原理：病毒與抗血清中抗體特異結(jié)合后失去感染易感動物、雞胚或細(xì)胞活性。舉例

IBDV

9～11d雞胚24～48h雞胚死亡

IBDV

+抗血清

9～11d雞胚雞胚不死亡

第36頁/共45頁動物微生物免疫標(biāo)記技術(shù)抗原與抗體結(jié)合了，但復(fù)合物小，不能通過凝集或沉淀用肉眼觀察到。

該怎么辦？將抗體或抗原聯(lián)結(jié)在一個特定的易于檢測的物質(zhì)上，通過檢測特定物質(zhì)的存在，間接反映抗原抗體發(fā)生了結(jié)合。第37頁/共45頁動物微生物熒光抗體標(biāo)記技術(shù)原理：將熒光色素標(biāo)記在抗體或抗原上，與相應(yīng)的抗原或抗體特異性結(jié)合后，用熒光顯微鏡觀察所標(biāo)記的熒光，以分析示蹤相應(yīng)的抗原或抗體的方法。熒光素：熒光色素是能產(chǎn)生明顯熒光，又能作為染料使用的有機(jī)化合物。最常用的是異硫氰酸熒光素(FITC)。第38頁/共45頁動物微生物熒光抗體染色染色方法

抗補(bǔ)體法

直接法

間接法抗原抗體熒光素抗抗體抗補(bǔ)體抗體第39頁/共45頁動物微生物酶標(biāo)抗體技術(shù)原理：將酶分子標(biāo)記在抗體或抗原分子上，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性及酶的高催化活性進(jìn)行檢測。用于標(biāo)記的酶：辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。

第40頁/共45頁動物微生物免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

斑點(diǎn)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶標(biāo)抗體技術(shù)分類第41頁/共45頁動物微生物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試驗(yàn)方法

間接法：用于測定抗體夾心法：用于測定大分子抗原雙夾心法：用于測定大分子抗原原理通過化學(xué)方法將酶與抗體結(jié)合起來。酶標(biāo)記后的抗體仍然保持著能與相應(yīng)抗原結(jié)合的免疫學(xué)活性及酶的催化活性。酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合后，形成酶標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物。復(fù)合物上的酶，在遇到相應(yīng)的底物時(shí)，催化底物分解，使底物中的供氧體由無色的還原型變成有色的氧化型，呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，用肉眼或酶標(biāo)儀判定結(jié)果。第42頁/共