大腸菌群計數(shù)

大腸菌群計數(shù)第1頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一大腸菌群的定義指一群在36℃條件下培養(yǎng)48h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便,作為糞便污染指標評價食品的衛(wèi)生狀況,推斷食品中腸道致病菌污染的可能。大腸菌群不是細菌學上分類命名，而是一組與糞便污染有關的細菌。這群細菌包括：大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌。生化特征及血清學反應并非完全一致。第2頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一分布：廣泛分布于自然環(huán)境。來源于人和溫血動物的糞便。衛(wèi)生學意義大腸菌群作為糞便污染的指標菌評價樣品中是否受到糞便的污染。大腸菌群計數(shù)的高低，直接反映了樣品受糞便污染的程度。表示對人體健康是否具有潛在的危險性。第3頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一大腸菌群是理想的糞便污染的指標菌是人類和溫血動物腸道菌群，在數(shù)量上占優(yōu)勢。隨糞便排出體外后，在外界環(huán)境影響下，其存活時間應與腸道致病菌大致相似或稍長。檢驗方法簡便，易于檢出與計數(shù)。對消毒劑的抵抗力應不低于腸道致病菌。第4頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一主要修改內(nèi)容將原標準拆分為大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌計數(shù)三個獨立的標準方法，標準名稱變化。大腸菌群的MPN法中乳糖膽鹽等培養(yǎng)基改為月桂基硫酸鹽胰蛋白眎(LST)肉湯為主的培養(yǎng)基；增加了對樣品勻液的pH范圍要求；增加了大腸菌群的平板計數(shù)法和紙片檢測法；MPN法的結果報告由原“每100g（mL）大腸菌群的MPN值”，修改為“每1g（mL）大腸菌群的MPN值”；第5頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一大腸菌群計數(shù)第一法：MPN法第二法：平板計數(shù)法第三法：Petrifilm測試片法第6頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一第一法大腸菌群檢驗MPN法第7頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一原標準乳糖膽鹽發(fā)酵管EMB瓊脂乳糖發(fā)酵管培養(yǎng)基改變情況新標準第一法：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）第二法：結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）第8頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一操作步驟的改變原標準初發(fā)酵EMB分離培養(yǎng)染色，復發(fā)酵報告現(xiàn)標準LST初發(fā)酵BGLB驗證報告第9頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一大腸菌群檢驗程圖(新國標MPN法)檢樣稀釋月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）36±１℃，24~48±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）36±１℃，24~48±2h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣大腸菌群陰性大腸菌群陽性報告第10頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一樣品的處理和稀釋固體和半固體食品：以無菌操作取25g）樣品,放入裝有225mL生理鹽水的無菌均質杯內(nèi),于8000r/min均質1min～2min,制成1:10樣品勻液，或放入225mL生理鹽水的無菌均質袋中，用均質器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。液體食品：以無菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無菌玻璃瓶(瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的玻璃珠)中,以30cm幅度、于7s內(nèi)振搖25次(或以機械振蕩器振搖),制成1:10的樣品勻液。第11頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一根據(jù)對樣品污染情況的估計,按上述操作，依次制成系列十倍系列樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。樣品勻液的pH值應在6.5～7.5之間，必要時要進行調節(jié)，如有些果汁pH值很低，如果不進行調節(jié)，檢驗結果的誤差可能就會比較大。第12頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一選擇適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，液體樣品可以包括未經(jīng)稀釋的原液，每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量需要超過1mL，則用雙料LST肉湯）。36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生或輕搖試管時是否有密集連續(xù)的細小氣泡從管底逸出，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h。第一步：初發(fā)酵第13頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性；對產(chǎn)氣者，則進行復發(fā)酵試驗。注意：以48h±2h為最終觀察結果時限。結果也以此時為最終結果。第14頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一用接種環(huán)從所有48h±2h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，置36℃±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。第二步：復發(fā)酵第15頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一月桂基磺酸鈉能抑制革蘭氏陽性菌的生長，同時比膽鹽的選擇性和穩(wěn)定性好。由于膽鹽與酸產(chǎn)生沉淀，沉淀有時候會使對產(chǎn)氣情況的觀察變得有些困難；

乳糖是大腸菌群可利用發(fā)酵的糖類。有利于大腸菌群的生長繁殖并有助于鑒別大腸菌群和腸道致病菌；胰蛋白胨提供基本的營養(yǎng)成分；LST肉湯是國際上通用的培養(yǎng)基，與乳糖膽鹽肉湯的作用和意義相同，但具有更多的優(yōu)越性。月桂基磺酸鹽胰蛋白胨（LST）第16頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一發(fā)酵試驗判定原則：產(chǎn)氣為陽性。檢測步驟減少（不必分離培養(yǎng)），檢測時間縮短24h。注：如接種量超過1mL，則應用雙料LST肉湯第17頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一膽鹽可抑制革蘭氏陽性菌?；途G是抑菌抗腐劑，可增強對革蘭氏陽性菌的抑制作用。乳糖是大腸菌群可利用發(fā)酵的糖類。有利于大腸菌群的生長繁殖并有助于鑒別大腸菌群和腸道致病菌。發(fā)酵試驗判定原則：產(chǎn)氣為陽性。由于配方里有膽鹽，膽鹽遇到大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)生的酸形成膽酸沉淀，培養(yǎng)基可由原來的綠色變?yōu)辄S色，同時可看到管底通常有沉淀?；途G乳糖膽鹽肉湯（BGLB）第18頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一結果報告根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù),查MPN檢索表，報告每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。第19頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一MPN檢索表的應用MPN（最可能數(shù)）是表示樣品中活菌密度的估測。因此MPN值只是活菌密度的估算值，并不是樣品中活菌數(shù)的真值。第20頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一1g(mL)檢樣中最大可能數(shù)（MPN）表--420>1100333948.7272124,1001801100233424.5201122,00090460133423.7150121,00042240033424.5202021,00090290323423.61410243040210223381.49.200242037150123424.5160314201893023424.51512142040160313423.61102142037120213383.6111112001775113201.37.4011180943013383.6112011801764203181.37.21011108.738103180.173.6001944.623003383.69.4030948.736132181.26.2020948.729032181.26.1110948.735222110.153.0010948.7281229.60.153.0100424.5210229.5--<3.0000高低0.0010.010.10高低0.0010.010.1095%置信區(qū)間MPN陽性管數(shù)95%置信區(qū)間MPN陽性管數(shù)第21頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一使用MPN檢索表的注意點這個MPN檢索表是ISO、FDA、AOAC、USDA/FSIS、北歐等標準通用的。表里的數(shù)字是有小數(shù)點的。報告單位不同?，F(xiàn)報告單位為g/ml，而原報告單位是100g/ml。原標準MPN表有64個組合，而現(xiàn)標準MPN表只有40個組合。第22頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一當實驗結果在MPN表中無法查找到MPN值時，如：陽性管數(shù)為122，123，232，233等時，建議增加稀釋度(可做4~5個稀釋度)，使樣品的最高稀釋度能達到獲得陰性終點，然后再遵循相關的規(guī)則進行查找，最終確定MPN值。第23頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一第二法平板計數(shù)法第24頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一適用范圍與培養(yǎng)基平板計數(shù)法相對于MPN法來說，檢驗結果更精確。適合用于污染比較嚴重的樣品，但對于污染菌量太少的樣品，還是MPN法更有優(yōu)勢。所用培養(yǎng)基：VRBA瓊脂、BGLB培養(yǎng)基。第25頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一平板計數(shù)法的檢驗程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質10倍系列稀釋選擇2~3個適宜稀釋度的樣液，接種VRBA平板計數(shù)典型和可疑菌落36℃±1℃18~24hBGLB肉湯證實試驗36℃±1℃18~24h報告結果注：VRBA(結晶紫中性紅膽鹽瓊脂)又稱為：VRB或VRBL第26頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一操作要點樣品稀釋同第一法。選取適宜的2~3個連續(xù)稀釋度,每個稀釋度接種兩個滅菌平皿,每皿1mL。另取1mL生理鹽水做個空白對照。將冷至46℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)約15mL傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL~4

mLVRBA覆蓋平板表層。第27頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一平板菌落數(shù)的選擇選擇菌落數(shù)在30~150之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有膽鹽與酸形成的沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。第28頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，進行證實試驗。BGLB肉湯管產(chǎn)氣者，所對應的菌落即為大腸菌群陽性菌落。證實試驗第29頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一結果報告經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的BGLB管的百分比乘以計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g(mL)樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1ml在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取10個接種BGLB肉湯，證實6個為陽性。則樣品大腸菌群數(shù)為：100×6/10×10-4/g(mL)=6.0×105cfu/g(mL)第30頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一什么樣的菌落必須要做證實試驗?一是非典型菌落，如在顏色、直徑與典型菌落不符合的菌落。另一種情況是被檢樣品中含有乳糖以外的其他糖類，如牛奶、飲料等樣品。本來大腸菌群的定義是發(fā)酵乳糖，但由于樣品含有的其他糖類混入了培養(yǎng)基，使得不能分解乳糖但能分解其他糖類的細菌也能夠長出紅色菌落，所以需要進行證實實驗。第31頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)VRBA的主要成分：乳糖、膽鹽、結晶紫、中性紅及細菌生長所必需的營養(yǎng)成分如:蛋白胨、酵母膏等。結晶紫和中性紅為VRBA的指示劑系統(tǒng)，在酸性條件下為紫紅色。大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)生的酸與膽鹽結合，可形成沉淀。第32頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一第三法大腸菌群PetrifilmTM測試片法第33頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一大腸菌群PetrifilmTM

測試片法原理PetrifilmTM大腸菌群測試片是一種預先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng)，含有VRB培養(yǎng)基，冷水可溶性凝膠和TTC指示劑，可增強菌落計數(shù)效果。表面覆蓋的膠膜，可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。培養(yǎng)結束后計數(shù)紅點周圍有氣泡的菌落為大腸菌群數(shù)。第34頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一大腸菌群PetrifilmTM

測試片檢驗程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質10倍系列稀釋選擇2~3個適宜稀釋度的樣液，接種PetrifilmTM大腸菌群測試紙片計數(shù)紅色帶氣泡菌落報告結果36℃±1℃24±2h第35頁，共40頁，2023年，2月20日，星期一操作要點按第一法的樣品制備方法進行。樣品勻液的pH值應在6.5～7.5之間，pH值過低或過高時分別用1MNaOH或1MHCl予以調節(jié)。合理稀釋度的選擇，每稀釋度接種2張測試片。接種時避免氣泡產(chǎn)生。培養(yǎng)基未凝固時勿挪動。