質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)11課件

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)重組DNA技術(shù)質(zhì)粒DNA的提取瓊脂糖凝膠電泳復(fù)制翻譯轉(zhuǎn)錄不同來(lái)源的DNA分子通過(guò)磷酸二酯鍵連接成新的DNA分子，這一過(guò)程稱(chēng)為DNA重組。不同來(lái)源的DNA分子重組DNA分子重組DNA技術(shù)基本過(guò)程載體的特點(diǎn)1.對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害，不影響受體細(xì)胞正常生命活動(dòng)2.具有自主復(fù)制能力3.含有多克隆酶切位點(diǎn)4.攜帶標(biāo)記基因、便于篩選5.除保留必要序列外，載體應(yīng)盡可能小6.生物安全性好載體的類(lèi)型質(zhì)粒噬菌體病毒質(zhì)粒

存在于細(xì)菌染色體外的小的共價(jià)、閉環(huán)雙鏈DNA分子。質(zhì)粒DNA的提取方法：堿裂解法原理：質(zhì)粒DNA與染色體DNA變性與復(fù)性的差異將菌液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中(盡量倒?jié)M)

↓12000rpm/30s（重復(fù)一次）棄上清扣干，加入SolutionⅠ100μL,劇烈振蕩打散菌體，室溫3min

↓（以下操作要輕柔）加入新配制的SolutionⅡ200μL,溫和顛倒離心管4～5次混勻，室溫放置3min

↓（此時(shí)出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象）加入預(yù)冷的SolutionⅢ150μL,溫和顛倒離心管2～3次混勻，室溫3min

↓離心12000rpm/5min具體步驟質(zhì)粒DNA的上清400μL移至另一離心管中↓加等體積氯仿,輕微振蕩↓離心12000rpm/2min

轉(zhuǎn)移上清液350μL至另一離心管↓加入2倍體積無(wú)水乙醇,輕輕混勻室溫放置2min↓離心12000rpm/5min

棄上清,加入70%乙醇洗滌沉淀↓離心12000rpm/2min（重復(fù)一次）

棄上清，液體盡量倒凈并在吸水紙上扣干↓室溫放置15min干燥加入TER40μL溶解質(zhì)粒具體步驟SolutionII1.SDS：破壞細(xì)胞膜；解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性2.NaOH：破壞氫鍵，使DNA分子變性SDS+NaOHSolutionIII1.中和溶液II的堿性，使DNA復(fù)性。2.K+離子會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去。溶液中的染色體DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS形成相互纏繞的大分子物質(zhì)，很容易與小分子的質(zhì)粒DNA分離。KAc與HAc質(zhì)粒的鑒定——瓊脂糖凝膠電泳電泳：帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。作用：用于生物物質(zhì)的分離分析用于分析物質(zhì)的純度和分子量的測(cè)定等影響電泳的因素溶液的pH值電場(chǎng)強(qiáng)度緩沖液的離子強(qiáng)度電滲作用瓊脂糖凝膠分離范圍凝膠濃度（%）線性DNA長(zhǎng)度（bp）0.51000～300000.7800～120001.0500～100001.2400～70001.5200～30002.050～2000實(shí)驗(yàn)流程注意事項(xiàng)1、制膠槽一定要放平2、倒