流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用專家講座

流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)及應(yīng)用王萬(wàn)黨.08.15中山市小欖人民醫(yī)院檢驗(yàn)科流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第1頁(yè)流式細(xì)胞術(shù)：Flowcytometry流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第2頁(yè)1930年，Caspersson和Thorell開(kāi)始致力于細(xì)胞計(jì)數(shù)1934年，Moldaven試圖用光電儀統(tǒng)計(jì)流過(guò)一根毛細(xì)管細(xì)胞1949年WallaceCoulter提出在懸液中計(jì)數(shù)粒子方法專利流式細(xì)胞發(fā)展史1953年，Croslannd-Taylor

應(yīng)用分層鞘流原理，成功設(shè)計(jì)紅細(xì)胞光學(xué)自動(dòng)計(jì)數(shù)器流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第3頁(yè)2-4colorcytometer10-20colorcytometersorter–high-endres1953，Parker和Horst描述一個(gè)全血細(xì)胞計(jì)數(shù)器裝置，成為流式細(xì)胞儀雛形

1967，發(fā)展了一個(gè)液流束、照明光軸、檢測(cè)系統(tǒng)三者垂直流式細(xì)胞儀1969，VanDillaFulwyler創(chuàng)造第一臺(tái)熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì)1975，Kohler和Milstein提出單克隆抗體技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第4頁(yè)流式細(xì)胞儀(FlowCytometer):是集光電子物理，光電測(cè)量，計(jì)算機(jī)，細(xì)胞熒光化學(xué)，單克隆抗體技術(shù)為一體高科技細(xì)胞分析儀。流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry):利用流式細(xì)胞儀對(duì)處于快速流動(dòng)單個(gè)細(xì)胞/生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速（每秒可達(dá)1000-10000個(gè)）定量分析和分選（純度可達(dá)99%以上）技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第5頁(yè)流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第6頁(yè)流式細(xì)胞儀工作原理液流系統(tǒng) 流動(dòng)室液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)激光光源 光搜集系統(tǒng)電子系統(tǒng) 光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第7頁(yè)液流系統(tǒng)：流動(dòng)室、液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，慣用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定材料制作，是液流系統(tǒng)心臟。樣品管貯放樣品，單個(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四面流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。進(jìn)樣孔鞘液激光束熒光信號(hào)流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第8頁(yè)FCM液流系統(tǒng)（怎樣形成單個(gè)細(xì)胞流）樣本管鞘液管流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第9頁(yè)液流中心由單列勻速運(yùn)動(dòng)顆粒組成液柱為了確保液流是穩(wěn)液，普通限制液流速度υ<10m/s。因?yàn)榍室鹤饔?，被檢測(cè)細(xì)胞被限制在液流軸線上。流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第10頁(yè)激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長(zhǎng)/短波長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)短/長(zhǎng)波長(zhǎng)光束成形器：兩十字交叉放置透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），

FL1,FL2,FL3,FL4（熒光）光學(xué)系統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第11頁(yè)Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BP

FL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流式細(xì)胞儀光路圖流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第12頁(yè)氬離子激光器發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍(lán)光488nm譜線最強(qiáng)，約占總光強(qiáng)80%；氪離子激光器光譜多集中在可見(jiàn)光部分，以633nm較強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第13頁(yè)前向散射光信號(hào)細(xì)胞大小

側(cè)向散射光信號(hào)細(xì)胞內(nèi)顆粒

散射光信號(hào)流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第14頁(yè)外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第15頁(yè)用熒光標(biāo)識(shí)抗體抗體特異性地結(jié)合細(xì)

胞上對(duì)應(yīng)抗原表示該抗原細(xì)胞被標(biāo)識(shí)上熒光；抗原表示多細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞百分比或濃度靶蛋白濃度熒光信號(hào)

FL1–FITC

FL2–PEFL3-PC7流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第16頁(yè)熒光產(chǎn)生流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第17頁(yè)熒光素種類(lèi)FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色530nmGFP(綠色熒光蛋白)：綠色

PE（藻紅蛋白）：橙黃色575nmPerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：深紅色 675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm APC(別藻蘭蛋白）：紅色660nm流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第18頁(yè)熒光產(chǎn)生過(guò)程流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第19頁(yè)流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第20頁(yè)濾光片：OpticalFilters460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50 長(zhǎng)通

短通

帶通流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第21頁(yè)

光搜集系統(tǒng)：光電倍增管（PMT）熒光染色細(xì)胞受適當(dāng)光激發(fā)后所產(chǎn)生熒光普通由光電倍增管（PMT）檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第22頁(yè)細(xì)胞分選系統(tǒng)激發(fā)光+-電極板單細(xì)胞搜集管數(shù)據(jù)顯示熒光檢測(cè)器流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第23頁(yè)流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選器經(jīng)過(guò)噴嘴射出液柱被分割成一連串小水滴，然后由充電電路對(duì)選定細(xì)胞液滴充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞經(jīng)過(guò)靜電場(chǎng)而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入搜集器中。

流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第24頁(yè)數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第25頁(yè)P(yáng)ositivecellNegativeCellCD4PECD4PE流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第26頁(yè)AbsoluteCounts--CellspermLPositiveCellAbsoluteCountBeadsNegativeCellCD4PECD4PE流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第27頁(yè)流式細(xì)胞儀臨床應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第28頁(yè)免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞亞群/樹(shù)突狀細(xì)胞及其它免疫細(xì)胞檢測(cè)血液病

白血病及淋巴瘤免疫分型及微小殘留（MRD）檢測(cè)血小板檢測(cè)及網(wǎng)織紅細(xì)胞和網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)/PNH檢測(cè)本身免疫病

HLA-B27檢測(cè)感染性疾病

CD64檢測(cè)移植免疫腫瘤細(xì)胞因子檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第29頁(yè)免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞亞群活化T淋巴細(xì)胞抗原特異性免疫細(xì)胞調(diào)控性T細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞先天免疫細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第30頁(yè)淋巴細(xì)胞亞群分析

依據(jù)功效，淋巴細(xì)胞主要分為B淋巴細(xì)胞（CD19+），與體液免疫相關(guān)T淋巴細(xì)胞（CD3+），與細(xì)胞免疫相關(guān)總T和總B能夠用來(lái)判斷一些免疫缺點(diǎn)和本身免疫性疾病

NK細(xì)胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功效，

能夠介導(dǎo)對(duì)一些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞細(xì)胞毒性作用。流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第31頁(yè)淋巴細(xì)胞亞群分析依據(jù)CD4、CD8表示，T淋巴細(xì)胞又分為T(mén)輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+）T抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞（CD3+CD8+）Th/Ts評(píng)價(jià)那些本身免疫失調(diào)或被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺點(diǎn)病人免疫狀態(tài)，另外，這一比值還可用來(lái)監(jiān)測(cè)骨髓移植病人以免受到急性GVHD攻擊

Th/Ts升高：本身免疫性疾病（類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLE）Th/Ts降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第32頁(yè)淋巴細(xì)胞亞群T淋巴細(xì)胞(CD3+)名稱功能CD3+CD4+輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-輔助性T細(xì)胞(Th)誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)輔助細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細(xì)胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細(xì)胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T細(xì)胞(Ts)殺傷性T細(xì)胞(Tc)抑制細(xì)胞和體液免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD3+CD4+CD8+活化T細(xì)胞在T細(xì)胞惡性增生時(shí)升高

CD3+CD4-CD8-有調(diào)整功效T細(xì)胞,其表示/T細(xì)胞受體(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚/靜止T淋巴細(xì)胞當(dāng)免疫系統(tǒng)沒(méi)有能力更新輔助性或抑制性/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞祖細(xì)胞時(shí)此細(xì)胞亞群較低CD45RA-CD45RO+記憶性T淋巴細(xì)胞

病菌感染時(shí)升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化T細(xì)胞,感染時(shí)升高感染時(shí)升高流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第33頁(yè)淋巴細(xì)胞亞群活化T淋巴細(xì)胞名稱功能CD3+HLA-DR+活化T細(xì)胞CD4+HLA-DR+活化輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+HLA-DR+活化抑制性/殺傷性T細(xì)胞CD4+CD25+活化輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化抑制性/殺傷性T細(xì)胞在病毒感染患者中增加;其增加意味著HIV患者預(yù)后較差B淋巴細(xì)胞(19+)CD19+CD23+活化B細(xì)胞過(guò)敏患者中升高

CD19+CD5+在本身免疫性疾病中升高CD19+CD5+CD23+慢性B細(xì)胞白血病及單克隆B淋巴細(xì)胞

NK細(xì)胞CD3+CD(16+56)+本身免疫性疾病時(shí)降低,而病毒感染時(shí)升高CD3+CD57+CMV(巨細(xì)胞病毒)感染強(qiáng)烈征兆流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第34頁(yè)淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量檢驗(yàn)意義疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK本身免疫病降低增高降低降低AIDS降低嚴(yán)重降低增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化降低正?；蛟龈呓档徒档湍[瘤降低降低增高降低降低流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第35頁(yè)流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第36頁(yè)非特異性先天免疫細(xì)胞γδＴ細(xì)胞:占外周血T細(xì)胞10％以下，非抗原依賴型免疫細(xì)胞，在傳染病、腫瘤病人外周血數(shù)量增加，表示CD3量較普通T細(xì)胞多NK細(xì)胞：占外周血淋巴細(xì)胞8－25％，傳染病和腫瘤病人數(shù)量偏低。NK細(xì)胞能夠依據(jù)NKR不一樣而分類(lèi)，丙型肝炎發(fā)生和預(yù)后可能與NK細(xì)胞表型相關(guān)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）：分布在淋巴組織和外周血，機(jī)體主要抗原提呈細(xì)胞Treg細(xì)胞：調(diào)整性T細(xì)胞，本身免疫性疾病發(fā)生關(guān)系親密流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第37頁(yè)流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第38頁(yè)血液學(xué)中應(yīng)用1）白血病和淋巴瘤免疫分型2）微小殘留（MRD）檢測(cè)3）CD34+造血干/祖細(xì)胞檢測(cè)4）活化血小板及網(wǎng)織血小板檢測(cè)5）陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）6）網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第39頁(yè)流式細(xì)胞免疫分型是白血病分型主要指標(biāo)

FAB標(biāo)準(zhǔn)，形態(tài)學(xué)和免疫表型結(jié)合適合于白血病分型診療，但不適適用于確診是不是白血病。Minimalresidualdiseases(MRD)流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第40頁(yè)診療白血病主要標(biāo)志：B-ALL:CD34,HLA-DR,CD19,CD10+/-,cCD79aT-ALL:CD34,CD38,CD7,CD2+/-,CD5+/-,cCD3AML:CD34,CD117,CD33,CD13,cMPO M3:CD34-,HLA-DR- M2:CD19+:t(8,21) M4/M5:CD14+ M6:GlyA+,CD71+ M7:IIb/IIIa(CD41,CD61)+流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第41頁(yè)M4M5M6M7T-ALLB-ALLM2M3流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第42頁(yè)微小殘留（MRD）檢測(cè)白血病微小殘留是指患者經(jīng)過(guò)治療取得完全緩解（CR）后體內(nèi)殘留微量白血病細(xì)胞。白血病微小殘留病是白血病復(fù)發(fā)主要根源。檢測(cè)MRD可早期預(yù)測(cè)白血病復(fù)發(fā)可能性、判斷療效、研究白血病發(fā)生發(fā)展特征。流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第43頁(yè)2）CD34+造血干/祖細(xì)胞檢測(cè)。主要用于干細(xì)胞移植及基因治療方面檢測(cè)。3）活化血小板及網(wǎng)織血小板檢測(cè)，在栓塞性疾病，如腦血管和心肌梗塞患者，可出現(xiàn)活化血小板增多。而血小板降低患者，假如出現(xiàn)網(wǎng)織血小板增多，則說(shuō)明血小板降低原因?yàn)檠“迤茐倪^(guò)多所致。流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第44頁(yè)CD41a是特異血小板表面標(biāo)識(shí)CD61是特異泛血小板表面標(biāo)識(shí)PAC-1為早期血小板活化指標(biāo)CD62p為血小板活化后期指標(biāo)CD41-CD61復(fù)合物檢測(cè)可提醒血小板無(wú)力癥CD41a-CD42b復(fù)合物檢測(cè)可提醒巨大血小板血癥流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第45頁(yè)臨床意義：1、評(píng)定患者血小板活化能力2、檢測(cè)血小板活化相關(guān)疾病過(guò)程，抗血小板藥品療效或治療藥品影響，預(yù)測(cè)血栓形成3、輔助診療血小板活化相關(guān)疾病:血小板無(wú)力癥、巨大血小板綜合癥、肝素誘導(dǎo)血小板降低癥、血栓4、判別細(xì)菌感染和病毒感染性疾病流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第46頁(yè)4）陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）

發(fā)病機(jī)制為X染色體上PIG-A基因發(fā)生突變，引發(fā)糖化肌醇脂（GPI）錨合成障礙，使GPI錨連蛋白缺乏，已證實(shí)GPI錨連蛋白有10余種，用于PNH診療主要為CD55和CD59兩種，假如在紅細(xì)胞或WBC上出現(xiàn)CD55或/和CD59表示下降，且患者體內(nèi)紅細(xì)胞展現(xiàn)不均一性，可診療為PNH。5）網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第47頁(yè)A：正常人，B-D均為PNH患者流式細(xì)胞術(shù)分析技術(shù)和應(yīng)用第48頁(yè)HLA-B27檢測(cè)HLA-B27是在有核細(xì)胞上表示I型MHC分子，在淋巴細(xì)胞表面尤為豐富