基因組學(xué)總結(jié)

Roche454(GSFLXTitaniumSystem)超高通量測(cè)序技術(shù)原理2005年底,454公司推出了革命性的基于焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)GenomeSequencer20System,被《Nature》雜志以里程碑事件報(bào)道，開創(chuàng)了邊合成邊測(cè)序的先河。2007年又推出了性能更優(yōu)的第二代基因組測(cè)序系統(tǒng)一—GenomeSequencerFLXSystem。2008年10月，454推出了全新的GSFLXTitanium系列試劑和軟件，讓GSFLX的通量一下子提高了5倍，準(zhǔn)確性和讀長也進(jìn)一步提升。GSFLX測(cè)序原理：GSFLX系統(tǒng)的測(cè)序原理和GS20一樣，也是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來（圖1）。通過檢測(cè)熒光信號(hào)釋放的有無和強(qiáng)度，就可以達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳；具有分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和自動(dòng)化的特點(diǎn)。RocheGSFLXSystem是一種基于焦磷酸測(cè)序原理而建立起來的高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)。在測(cè)序時(shí)，使用了一種叫做“PicoTiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多萬個(gè)由光纖組成的孔，孔中載有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所需的各種酶和底物。測(cè)序開始時(shí)，放置在四個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對(duì)，就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在各種酶的作用下，經(jīng)過一個(gè)合成反應(yīng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最終將熒光素氧化成氧化熒光素，同時(shí)釋放出光信號(hào)。此反應(yīng)釋放出的光信號(hào)實(shí)時(shí)被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個(gè)堿基和測(cè)序模板進(jìn)行配對(duì)，就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào)；由此一一對(duì)應(yīng)，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測(cè)模板的堿基序列。測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：1、文庫制備：根據(jù)樣品的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，將基因組DNA/cDNA片段化處理至400-800bp間，經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA（sstDNA）；2、EmulsionPCR：特定比例的單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上，使大部分磁珠磁珠攜帶了一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA片斷。磁珠結(jié)合的文庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，每個(gè)獨(dú)特的片斷在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而不受其他的競(jìng)爭(zhēng)性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行。擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個(gè)相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增后仍結(jié)合在磁珠上的片段既可被回收純化用于后續(xù)的測(cè)序?qū)嶒?yàn)；3、測(cè)序反應(yīng)：攜帶DNA的珠子與其他反應(yīng)物混合物，隨后放入PTP板中進(jìn)行后繼的測(cè)序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個(gè)珠子（20um）。然后將PTP板放置在GSFLX中，測(cè)序開始。每一個(gè)與模板鏈互補(bǔ)的核苷酸的添加都會(huì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的信號(hào)，并被CCD照相機(jī)所捕獲；4、數(shù)據(jù)分析：GSFLX系統(tǒng)在10小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100多萬個(gè)讀長，讀取超過4-6億個(gè)堿基信息，通過GSFLX系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。技術(shù)特點(diǎn)：？速度快，一個(gè)測(cè)序反應(yīng)耗時(shí)10個(gè)小時(shí)，獲得4-6億個(gè)堿基對(duì)。比傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序的方法快100倍；？讀長長，單個(gè)序列的讀長更長，平均可達(dá)到450個(gè)堿基左右；？通量高，每個(gè)反應(yīng)可以得到超過100萬個(gè)序列讀長，成本大大降低；？準(zhǔn)確度高，讀長超過400bp時(shí)，單一讀長的準(zhǔn)確性可以超過99%；?一致性好，測(cè)序結(jié)果一致性超過99.99%；?可以進(jìn)行Pair-End測(cè)序研究；？簡(jiǎn)便高效，不需要進(jìn)行建庫、克隆挑取、質(zhì)粒提取等工作，一個(gè)人可以在一天內(nèi)完成一個(gè)微生物物種的測(cè)序工作。GSFLX系統(tǒng)的應(yīng)用：自從2005年底GS超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)問世以來，已經(jīng)相繼在世界上各大測(cè)序?qū)嶒?yàn)室成功落戶。這項(xiàng)技術(shù)的第一個(gè)“試驗(yàn)品”就是來自有“DNA之父”之稱的JamesDWaston，他向454公司提供了自己的血液樣本。目前GS系統(tǒng)的用戶在Nature，Science，PNAS等世界頂級(jí)的期刊雜志上已經(jīng)發(fā)表了五十多篇的學(xué)術(shù)論文。（詳細(xì)列表請(qǐng)查詢/sis/sequencing/genome/index.jsp）o與GS20系統(tǒng)相比較，硬件配置和軟件系統(tǒng)方面的革新改進(jìn)，使得GSFLX系統(tǒng)具有了廣泛的應(yīng)用：全基因組測(cè)序；多達(dá)120Mb的未知基因組的測(cè)序；一生成基因組結(jié)構(gòu)概圖；一研究DNA序列的組織，分布和信息；一基因篩查：尋找新基因，定位和功能；一和其他基因組進(jìn)行比較研究；全基因組進(jìn)行從頭鳥槍法測(cè)序，例如微生物基因，BAC和YAC克隆測(cè)序。比較基因組研究；一識(shí)別單堿基突變；一識(shí)別突變熱點(diǎn)和保守區(qū)域；一識(shí)別插入或者缺失的基因；一斷定基因型和表型之間的相關(guān)關(guān)系（比如，研究藥物抗性的遺傳基礎(chǔ)）；一基于基因測(cè)序變化進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)；一進(jìn)行流行病學(xué)分析；一了解工業(yè)生產(chǎn)菌株和它們的親代菌株序列上的差異作為進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)菌株開發(fā)的遺傳基礎(chǔ)；一進(jìn)行宏基因組（metagenomics）研究；一古代化石DNA測(cè)序研究；利用配對(duì)末端方法（Pair-EndTag）將Contigs拼接成Scaffoldso轉(zhuǎn)錄組和基因調(diào)節(jié)研究；基于短Tags，ESTs,ChIP，或者GIS-PET序列的高通量轉(zhuǎn)錄組分析，或者miRNA序列的基因組范圍識(shí)別，小分子和非編碼RNA的測(cè)序。研究DNA的甲基化模式來進(jìn)行基因調(diào)節(jié)的研究。擴(kuò)增產(chǎn)物分析；PCR產(chǎn)物的超精細(xì)測(cè)序（應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究的重測(cè)序）；一在混合的腫瘤樣本中識(shí)別體細(xì)胞突變；一在群體水平上發(fā)現(xiàn)高可信度的SNP位點(diǎn)。SOLiD測(cè)序原理及實(shí)驗(yàn)流程SOLiD使用連接法測(cè)序獲得基于“雙堿基編碼原理”的SOLiD顏色編碼序列，隨后的數(shù)據(jù)分析比較原始顏色序列與轉(zhuǎn)換成顏色編碼的reference序列，把SOLiD顏色序列定位到reference上，同時(shí)校正測(cè)序錯(cuò)誤，并可結(jié)合原始顏色序列的質(zhì)量信息發(fā)現(xiàn)潛在SNP位點(diǎn)。1.SOLiD文庫構(gòu)建使用SOLiD測(cè)序時(shí)，可根據(jù)實(shí)際需要，制備片段文庫（fragmentlibrary）或末端配對(duì)文庫（mate-pairedlibrary）。簡(jiǎn)單地說，制備片段文庫就是在短DNA片段（60?110bp）兩端加上SOLiD接頭（P1、P2adapter）。而制備末端配對(duì)文庫，先通過DNA環(huán)化、Ecop15I酶切等步驟截取長DNA片段（600bp到10kb）兩末端各25bp進(jìn)行連接，然后在該連接產(chǎn)物兩端加上SOLiD接頭。兩種文庫的最終產(chǎn)物都是兩端分別帶有P1、P2adapter的DNA雙鏈，插入片段及測(cè)序接頭總長為120?180bp。2油包水PCR我們知道，文庫制備得到大量末端帶P1、P2adapter但內(nèi)部插入序列不同的DNA雙鏈模板。和普通PCR一樣，油包水PCR也是在水溶液進(jìn)行反應(yīng)，該水相含PCR所需試劑，DNA模板及可分別與P1、P2adapter結(jié)合的P1、P2PCR引物。但與普通PCR不同的是，P1引物固定在P1磁珠球形表面（SOLiD將這種表面固定著大量P1引物的磁珠稱為P1磁珠）。PCR反應(yīng)過程中磁珠表面的P1引物可以和變性模板的P1adapter負(fù)鏈結(jié)合，引導(dǎo)模板合成，這樣一來，P1引物引導(dǎo)合成的DNA鏈也就被固定到P1磁珠表面了。油包水PCR最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”，基本過程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個(gè)被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個(gè)小水滴只含一個(gè)DNA模板和一個(gè)P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介導(dǎo)的PCR反應(yīng)，這個(gè)DNA模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增加，PCR反應(yīng)結(jié)束后，P1磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同來源DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物。ABI公司提供的SOLiD實(shí)驗(yàn)手冊(cè)已經(jīng)把小水滴體積及水相中DNA模板和磁珠的個(gè)數(shù)比等重要參數(shù)進(jìn)行了技術(shù)優(yōu)化和流程固定，盡可能提高“優(yōu)質(zhì)小水滴”（水滴中只含一個(gè)DNA模板一個(gè)P1磁珠）的數(shù)量，為后續(xù)SOLiD測(cè)序提供只含有一種DNA模板擴(kuò)增產(chǎn)物的高質(zhì)量P1磁珠。含DNA模板P1磁珠的固定SOLiD測(cè)序反應(yīng)在SOLiD玻片表面進(jìn)行。含有DNA模板的P1磁珠共價(jià)結(jié)合在SOLiD玻片表面。磁珠是SOLiD測(cè)序的最小單元。每個(gè)磁珠SOLiD測(cè)序后形成一條序列。SOLiD雙堿基編碼原理及測(cè)序流程SOLiD"雙堿基編碼原理”實(shí)質(zhì)上是闡明了熒光探針的顏色類型與探針編碼區(qū)堿基對(duì)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。SOLiD連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對(duì)。如圖1“底物探針”所示，探針5’末端可分別標(biāo)記“CY5,TexasRed,CY3,6-FAMTM”4種顏色的熒光染料，并且這四種顏色用數(shù)字“3，2，1，0”示意；探針3’端1?5位為隨機(jī)堿基，可以是“A，T，C，G”四種堿基中的任何一種堿基，其中第1、2位構(gòu)成的堿基對(duì)是表征探針染料類型的編碼區(qū)，“雙堿基編碼矩陣”規(guī)定了該編碼區(qū)16種堿基對(duì)和4種探針顏色的對(duì)應(yīng)關(guān)系，而3?5位的“n”表示隨機(jī)堿基，6?8位的“z”指的是可以和任何堿基配對(duì)的特殊堿基，由上可知，SOLiD連接反應(yīng)底物中共有45種底物探針。單向SOLiD測(cè)序包括五輪測(cè)序反應(yīng)。每輪測(cè)序反應(yīng)含有多次連接反應(yīng)（一般情況下，片段文庫是7次，mate-paired文庫是5次，所以片段文庫共有35個(gè)連接反應(yīng)，而末端配對(duì)文庫共有25次連接反應(yīng)）。每輪測(cè)序反應(yīng)的第一次連接反應(yīng)由與P1引物區(qū)域互補(bǔ)的“連接引物”介導(dǎo)。這五種連接引物長度相同，但在P1引物區(qū)域的位置相差一個(gè)堿基（分別用n，n-1，n-2,n-3,n-4表示），都含有5’端磷酸，所以可以介導(dǎo)連接反應(yīng)的進(jìn)行?，F(xiàn)以圖5所示一個(gè)磁珠上發(fā)生的SOLiD測(cè)序反應(yīng)為例進(jìn)行說明。第一輪測(cè)序的第一次連接反應(yīng)由連接引物“n”介導(dǎo)，由于每個(gè)磁珠只含有均質(zhì)單鏈DNA模板（也就是每個(gè)磁珠表面的單鏈DNA模板序列都是一樣的），所以這次連接反應(yīng)摻入一種8堿基熒光探針，SOLiD測(cè)序儀記錄反應(yīng)模板序列第1、2位堿基序列的探針第1、2位編碼區(qū)顏色信息，隨后的化學(xué)處理斷裂探針3’端第5、6位堿基間的化學(xué)鍵，并除去6~8位堿基及5’末端熒光基團(tuán)，暴露探針第5位堿基5’磷酸，為下一次連接反應(yīng)作準(zhǔn)備。由此我們知道第一次連接反應(yīng)使合成鏈多了5個(gè)堿基，所以第二次連接反應(yīng)得到反應(yīng)模板序列第6、7位堿基序列的顏色信息，而第三次連接反應(yīng)得到的是第11、12位堿基序列的顏色信息……以此類推，第一輪測(cè)序反應(yīng)獲取了模板鏈7個(gè)堿基對(duì)的顏色信息。如圖5所示，由于第二輪連接引物n-1比第一輪錯(cuò)開一位，所以第二輪得到是以0，1位起始的7個(gè)堿基對(duì)的顏色信息。五輪測(cè)序反應(yīng)反應(yīng)后，按照第0、1位，第1、2位...…的順序把對(duì)應(yīng)于模板序列的顏色信息連起來，就得到由“0，1，2,3”組成的SOLiD原始顏色序列。5,數(shù)據(jù)分析原理SOLiD測(cè)序完成后，獲得了由顏色編碼組成的SOLiD原始序列（圖6.a）。理論上來說，按照“雙堿基編碼矩陣”（圖4），只要知道所測(cè)DNA序列中任何一個(gè)位置的堿基類型，就可以將SOLiD原始顏色序列“解碼”成堿基序列。但由于雙堿基編碼規(guī)則中雙堿基與顏色信息的兼并特性（一種顏色對(duì)應(yīng)4種堿基對(duì)），前面堿基的顏色編碼直接影響緊跟其后堿基的解碼，所以一個(gè)錯(cuò)誤顏色編碼就會(huì)引起“連鎖解碼錯(cuò)誤”，改變錯(cuò)誤顏色編碼之后的所有堿基（圖6.1）。和所有其它測(cè)序儀一樣，測(cè)序錯(cuò)誤在所難免，關(guān)鍵是對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤的評(píng)價(jià)和后續(xù)處理。為避免“連鎖解碼錯(cuò)誤”的發(fā)生，SOLiD數(shù)據(jù)分析軟件不直接將SOLiD原始顏色序列解碼成堿基序列，而是依靠reference序列進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。SOLiD序列分析軟件首先根據(jù)“雙堿基編碼矩陣”把reference堿基序列轉(zhuǎn)換成顏色編碼序列，然后與SOLiD原始顏色序列進(jìn)行比較，來獲得SOLiD原始顏色序列在reference的位置，及兩者的匹配性信息。Reference轉(zhuǎn)換而成的顏色編碼序列和SOLiD原始序列的不完全匹配主要有兩種情況：“單顏色不匹配”和“兩連續(xù)顏色不匹配”（圖6）。由于每個(gè)堿基都被獨(dú)立地檢測(cè)兩次（圖5），且SNP位點(diǎn)將改變連續(xù)的兩個(gè)顏色編碼（圖6.2），所以一般情況下SOLiD將單顏色不匹配處理成測(cè)序錯(cuò)誤，這樣一來，SOLiD分析軟件就完成了該測(cè)序錯(cuò)誤的自動(dòng)校正；而連續(xù)兩顏色不匹配也可能是連續(xù)的兩次測(cè)序錯(cuò)誤，SOLiD分析軟件將綜合考慮該位置顏色序列的一致性及質(zhì)量值來判斷該位點(diǎn)是否為SNP。Solexa高通量測(cè)序原理Solexa方法是利用單分子陣列測(cè)試genotyping，此種測(cè)序法首先是將DNA從細(xì)胞中提取，然后將其打斷到約100一200bp大小，再將接頭連接到片段上，經(jīng)PCR擴(kuò)增后制成Library。隨后在含有接頭的芯片（flowcell）上將已加入接頭的DNA片段綁定在flowcell上，經(jīng)反應(yīng)，將不同片段擴(kuò)增。在下一步反應(yīng)中，四種熒光標(biāo)記的染料應(yīng)用邊合成邊測(cè)序的原理，在每個(gè)循環(huán)過程里，熒光標(biāo)記的核苷和聚合酶被加入到單分子陣列中。互補(bǔ)的核苷和核苷酸片斷的第一個(gè)堿基配對(duì)，通過酶加入到引物上。多余的核苷被移走。這樣每個(gè)單鏈DNA分子通過互補(bǔ)堿基的配對(duì)被延伸，利用生物發(fā)光蛋白，比如螢火蟲的熒光素酶，可通過堿基加到引物后端時(shí)所釋放出的焦磷酸鹽來提供檢測(cè)信號(hào)。針對(duì)每種堿基的特定波長的激光激發(fā)結(jié)合上的核苷的標(biāo)記，這個(gè)標(biāo)記會(huì)釋放出熒光。熒光信號(hào)被CCD采集，CCD快速掃描整個(gè)陣列檢測(cè)特定的結(jié)合到每個(gè)片斷上的堿基。通過上述的結(jié)合，檢測(cè)可以重復(fù)幾十個(gè)循環(huán)，這樣就有可能決定核苷酸片斷中的幾十個(gè)堿基。Solexa的這種方法，可在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)加入4種核苷的標(biāo)簽，采用邊合成邊測(cè)序（SBS—sequencingbysynthesis），可減少因二級(jí)結(jié)構(gòu)造成的一段區(qū)域的缺失。并具有所需樣品量少，高通量，高精確性，擁有簡(jiǎn)單易操作的自動(dòng)化平臺(tái)和功能強(qiáng)大等特點(diǎn)，此反應(yīng)可以同時(shí)檢測(cè)上億個(gè)核苷酸片斷，因此在同一個(gè)芯片或幾個(gè)芯片上花費(fèi)很少（只需常規(guī)方法的1%）的成本就可測(cè)試全基因組。實(shí)驗(yàn)流程：1.文庫制備。將基因組DNA打成幾百個(gè)堿基（或更短）的小片段，在片段的兩個(gè)末端加上接頭（adapter）。2.產(chǎn)生DNA簇。利用專利的芯片，其表面連接有一層單鏈引物，DNA片段變成單鏈后通過與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)被一端“固定”在芯片上。另外一端5’或3’）隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被“固定”住，形成“橋（bridge）“。反復(fù)30輪擴(kuò)增，每個(gè)單分子得到了1000倍擴(kuò)增，成為單克隆DNA簇。DNA簇產(chǎn)生之后，擴(kuò)增子被線性化，測(cè)序引物隨后雜交在目標(biāo)區(qū)域一側(cè)的通用序列上。3.測(cè)序。GenomeAnalyzer系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測(cè)序（SequencingBySynthesis）的原理。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。這些核苷酸是“可逆終止子”，因?yàn)?’羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個(gè)循環(huán)摻入單個(gè)堿基。此時(shí)，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3’端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，就可以得知每個(gè)模板DNA片段的序列。目前的配對(duì)末端讀長可達(dá)到2X50bp，更長的讀長也能實(shí)現(xiàn)，但錯(cuò)誤率會(huì)增高。讀長會(huì)受到多個(gè)引起信號(hào)衰減的因素所影響，如熒光標(biāo)記的不完全切割。4.數(shù)據(jù)分析。自動(dòng)讀取堿基，數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)移到自動(dòng)分析通道進(jìn)行二次分析。Solexa測(cè)序技術(shù)屬于新一代測(cè)序技術(shù)（第二代），其的核心思想感是邊合成邊測(cè)序（sequencingbysynthesisorligation,SBS&SbL）。即生成新DNA互補(bǔ)鏈時(shí)，要么加入的dNTP通過酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)崔化底物激發(fā)出熒光，要么直接加入被熒光標(biāo)記的dNTP或半簡(jiǎn)并引物，在合成或連接生成互補(bǔ)鏈時(shí)，釋放出熒光信號(hào)。通過捕獲光信號(hào)并轉(zhuǎn)化為一個(gè)測(cè)序峰值，獲得互補(bǔ)鏈序列信息。Solexa公司在2006年被Illumina公司以6.15億美元的高價(jià)收購，并將Solexa測(cè)序儀命名為Illuminagenomeanalyzer。其測(cè)序原理民是“邊合成邊測(cè)序”，同時(shí)可以在DNA擴(kuò)增表面讀取數(shù)千萬個(gè)32-40bp長的片段。Solexa測(cè)序具體流程下圖所示：1.添加接頭。利用物理方法將待測(cè)樣品DNA打碎，在單鏈DNA碎片兩端加上接頭(1)。2.表面結(jié)合。Solexa的測(cè)序時(shí)利用微注射系統(tǒng)將已經(jīng)加過接頭和待測(cè)片斷隨機(jī)添加到玻璃FlowCell內(nèi)，每一個(gè)FlowCell又補(bǔ)分成8條Lane(FIGURE1)，每條Lane的內(nèi)表面上能與共價(jià)鍵的形式隨機(jī)固定單鏈接頭序列和帶接頭的單鏈待測(cè)DNA片斷(2)。3.橋型擴(kuò)增循環(huán)獲得多拷貝待測(cè)DNA片斷。在Flowcell內(nèi)加入未被標(biāo)記的dNTP和酶起始固相橋型擴(kuò)增(3)。所有單鏈橋型待測(cè)片段被擴(kuò)增成雙鏈橋片斷，通過變性，釋放出互補(bǔ)的單鏈，錨定到附近的固相表面(4,5)。通過不斷循環(huán)，將會(huì)在Flowcell的固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測(cè)片斷(6)。4.測(cè)序。加入DNA聚合酶和被熒光標(biāo)記的dNTP和接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，在每一個(gè)測(cè)序列簇延伸互補(bǔ)鏈時(shí)，每加入一個(gè)被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相應(yīng)的熒光，測(cè)序儀通過捕獲熒光信號(hào)，并通過計(jì)算機(jī)軟件將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序峰，從獲得待測(cè)片段的序列信息(7,8,9,10,11,12)?；蚪M學(xué)(英文genomics)，研究生物基因組和如何利用基因的一門學(xué)問。用于概括涉及基因作圖、測(cè)序和整個(gè)基因組功能分析的遺傳學(xué)分支。該學(xué)科提供基因組信息以及相關(guān)數(shù)據(jù)系統(tǒng)利用，試圖解決生物，醫(yī)學(xué)，和工業(yè)領(lǐng)域的重大問題?；蚪M研究應(yīng)該包括兩方面的內(nèi)容：以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structuralgenomics)和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)(functionalgenomics)，又被稱為后基因組(postgenome)研究，成為系統(tǒng)生物學(xué)的重要方法。基因組學(xué)能為一些疾病提供新的診斷，治療方法。例如，對(duì)剛診斷為乳腺癌的女性，一個(gè)名為“OncotypeDX”的基因組測(cè)試，能用來評(píng)估病人乳腺癌復(fù)發(fā)的個(gè)體危險(xiǎn)率以及化療效果，這有助于醫(yī)生獲得更多的治療信息并進(jìn)行個(gè)性化醫(yī)療?；蚪M學(xué)還被用于食品與農(nóng)業(yè)部門。基因組學(xué)與遺傳學(xué)發(fā)展里程碑基因組學(xué)的主要工具和方法包括：生物信息學(xué)，遺傳分析，基因表達(dá)測(cè)量和基因功能鑒定?；蚪M學(xué)出現(xiàn)于1980年代，1990年代隨著幾個(gè)物種基因組計(jì)劃的啟動(dòng)，基因組學(xué)取得長足發(fā)展。相關(guān)領(lǐng)域是遺傳學(xué)，其研究基因以及在遺傳中的功能。1980年，噬菌體①-X174;(5,368堿基對(duì))完全測(cè)序，成為第一個(gè)測(cè)定的基因組。1995年，嗜血流感菌(Haemophilusinfluenzae，1.8Mb)測(cè)序完成，是第一個(gè)測(cè)定的自由生活物種。從這時(shí)起，基因組測(cè)序工作迅速展開。2001年，人類基因組計(jì)劃公布了人類基因組草圖，為基因組學(xué)研究揭開新的一頁。基因組學(xué)是研究生物基因組的組成，組內(nèi)各基因的精確結(jié)構(gòu)、相互關(guān)系及表達(dá)調(diào)控的科學(xué)。基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)等一同構(gòu)成系統(tǒng)生物學(xué)的組學(xué)(omics)生物技術(shù)基礎(chǔ)?；蚪M研究應(yīng)該包括兩方面的內(nèi)容：以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structuralgenomics)和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)(functionalgenomics)，又被稱為后基因組(postgenome)研究，成為系統(tǒng)生物學(xué)的重要方法。功能基因組學(xué)基因組DNA測(cè)序是人類對(duì)自身基因組認(rèn)識(shí)的第一步。隨著測(cè)序的完成，功能基因組學(xué)研究成為研究的主流，它從基因組信息與外界環(huán)境相互作用的高度，闡明基因組的功能。功能基因組學(xué)的研究內(nèi)容：人類基因組DNA序列變異性研究、基因組表達(dá)調(diào)控的研究、模式生物體的研究和生物信息學(xué)的研究等。⑴基因組表達(dá)及調(diào)控的研究。在全細(xì)胞的水平，識(shí)別所有基因組表達(dá)產(chǎn)物mRNA和蛋白質(zhì)，以及兩者的相互作用，闡明基因組表達(dá)在發(fā)育過程和不同環(huán)境壓力下的時(shí)、空的整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。(2)人類基因信息的識(shí)別和鑒定。要提取基因組功能信息，識(shí)別和鑒定基因序列是必不可少的基礎(chǔ)工作?；蜃R(shí)別需采用生物信息學(xué)、計(jì)算生物學(xué)技術(shù)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段，并將理論方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)合起來?；诶碚摰姆椒ㄖ饕獜囊呀?jīng)掌握的大量核酸序列數(shù)據(jù)入手，發(fā)展序列比較、基因組比較及基因預(yù)測(cè)理論方法。識(shí)別基因的生物學(xué)手段主要基于以下的原理和思路：根據(jù)可表達(dá)序列標(biāo)簽(STS)；對(duì)染色體特異性cosmid進(jìn)行直接的cDNA選擇；根據(jù)CpG島；差異顯示及相關(guān)原理；外顯子捕獲及相關(guān)原理；基因芯片技術(shù)；基因組掃描；突變檢測(cè)體系，等等。(3)基因功能信息的提取和鑒定。包括：人類基因突變體的系統(tǒng)鑒定；基因表達(dá)譜的繪制；“基因改變-功能改變”的鑒定；蛋白質(zhì)水平、修飾狀態(tài)和相互作用的檢測(cè)。(4)在測(cè)序和基因多樣性分析。人類基因組計(jì)劃得到的基因組序列雖然具有代表性，但是每個(gè)人的基因組并非完全一樣，基因組序列存在著差異?；蚪M的差異反映在表型上就形成個(gè)體的差異，如黑人與白人的差異，高個(gè)與矮個(gè)的差異，健康人與遺傳病人的差異，等等。出現(xiàn)最多基因多態(tài)性就是單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。(5)比較基因組學(xué)。將人類基因組與模式生物基因組進(jìn)行比較，這一方面有助于根據(jù)同源性方法分析人類基因的功能，另一方面有助于發(fā)現(xiàn)人類和其他生物的本質(zhì)差異，探索遺傳語言的奧秘。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)是繼人類基因組之后又一個(gè)國際性大科學(xué)熱點(diǎn)，主要目的是試圖在生物體的整體水平上(如全基因組、全細(xì)胞或完整的生物體)測(cè)定出(以實(shí)驗(yàn)為主、包括理論預(yù)測(cè))全部蛋白質(zhì)分子、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)與蛋白折疊。蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)一核酸、蛋白質(zhì)一多糖、蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)一核酸一多糖、蛋白質(zhì)與其他生物分子復(fù)合體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)，以獲得一幅完整的、能夠在細(xì)胞中定位以及在各種生物學(xué)代謝途徑、生理途徑、信號(hào)傳導(dǎo)途徑中全部蛋白質(zhì)在原子水平的三維結(jié)構(gòu)全息圖。在此基礎(chǔ)上，使人們有可能在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)以致生物體整體水平上理解生命的原理。對(duì)疾病機(jī)理的闡明、對(duì)疾病的防治有重要應(yīng)用意義。發(fā)展回顧1998年4月，由美國國家醫(yī)學(xué)科學(xué)院（NIGMS）和WellcomeTrust發(fā)起在英國召開了第一次國際結(jié)構(gòu)基因組會(huì)議，美國、法國、英國、德國、加拿大、日本、荷蘭、意大利以及以色列的9國科學(xué)家參加了會(huì)議。2000年9月，美國NIGMS決定首批投入1.5億美元，在美國建設(shè)7個(gè)研究中心（目前已經(jīng)發(fā)展成為10個(gè)），爭(zhēng)取在未來10年內(nèi)解出1萬個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，建立蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列、三維結(jié)構(gòu)和生物功能之間的有機(jī)聯(lián)系，同時(shí)也支持結(jié)構(gòu)基因組方法學(xué)的研究。2002年，10家大型國際制藥公司宣布啟動(dòng)結(jié)構(gòu)基因組研究。2000年11月，日本組織召開國際會(huì)議討論結(jié)構(gòu)基因組計(jì)劃的有關(guān)問題，確定了完成測(cè)定3000個(gè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的“Protein3000計(jì)劃”。2001年4月，在美國召開了第二次國際結(jié)構(gòu)基因組會(huì)議，表明新一輪大規(guī)模的國際合作研究已經(jīng)開始。主要進(jìn)展我國在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方面具有較好的基礎(chǔ)。60年代，我國科學(xué)家在世界上首次人工合成了胰島素；70年代初又測(cè)定出1.8埃；分辨率的豬胰島素三維結(jié)構(gòu)，成為世界上為數(shù)不多的能夠測(cè)定生物大分子三維結(jié)構(gòu)的國家，這些研究工作處于當(dāng)時(shí)的世界先進(jìn)水平。在國際結(jié)構(gòu)基因組研究剛露端倪之時(shí)，我國科學(xué)家就敏感地抓住了這一新動(dòng)向，2000年我國開展了結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的研究。近來，國家863計(jì)劃、973計(jì)劃、中國科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程、國家重大攻關(guān)項(xiàng)目、自然科學(xué)基金先后重點(diǎn)資助了結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的研究工作和相關(guān)技術(shù)平臺(tái)的建設(shè)。相關(guān)研究工作既有分工、又有交叉合作，并充分地考慮到了我國基因組水平研究的特點(diǎn)和我國在結(jié)構(gòu)解析方法研究在國際上的地位。并計(jì)劃在參加國際合作的基礎(chǔ)上，在逐步建立基因組研究技術(shù)平臺(tái)的同時(shí)，相關(guān)圖書《藥物基因組學(xué)》。五年之中完成200—300個(gè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的測(cè)定。我國的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究隊(duì)伍近年來不斷發(fā)展壯大，中國科學(xué)院生物物理所、中國科技大學(xué)、北京大學(xué)、清華大學(xué)以及中國科學(xué)院物理所、高能所、上海生命科學(xué)院、福州物質(zhì)結(jié)構(gòu)所、上海復(fù)旦大學(xué)等單位均是我國開展結(jié)構(gòu)基因組研究的重要基地。我國結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究雖然啟動(dòng)時(shí)間較短，但已經(jīng)獲得了不少重要進(jìn)展。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，已經(jīng)完成了近千個(gè)克隆，已表達(dá)出210個(gè)蛋白質(zhì)，其中有100多個(gè)可溶或部分可溶；獲得近30個(gè)結(jié)晶和NMR樣品，已經(jīng)測(cè)定出5個(gè)結(jié)構(gòu)。甲基化（DNAmethylation）DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。DNA甲基化含義在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5—甲基胞嘧啶，這常見于基因的5'-CG-3'序列。大多數(shù)脊椎動(dòng)物基因組DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5'端的非編碼區(qū)，并成簇存在。甲基化位點(diǎn)可隨DNA的復(fù)制而遺傳，因?yàn)镈NA復(fù)制后，甲基化酶可將新合成的未甲基化的位點(diǎn)進(jìn)行甲基化°DNA的甲基化可引起基因的失活。DNA甲基化主要形成5—甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基嘌吟（N6-mA）及7一甲基鳥嘌吟（7-mG）結(jié)構(gòu)基因含有很多CpG結(jié)構(gòu)，2CpG和2GPC中兩個(gè)胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化，且兩個(gè)甲基集團(tuán)在DNA雙鏈大溝中呈特定三維結(jié)構(gòu)?；蚪M中60%?90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地組成CpG島，位于結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。有實(shí)驗(yàn)證明超甲基化阻遏轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。DNA甲基化可引起基因組中相應(yīng)區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，使DNA失去核酶ö限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)，以及DNA酶的敏感位點(diǎn)，使染色質(zhì)高度螺旋化，凝縮成團(tuán)，失去轉(zhuǎn)錄活性。5位C甲基化的胞嘧啶脫氨基生成胸腺嘧啶，由此可能導(dǎo)致基因置換突變，發(fā)生堿基錯(cuò)配:T2G,如果在細(xì)胞分裂過程中不被糾正，就會(huì)誘發(fā)遺傳病或癌癥，而且，生物體甲基化的方式是穩(wěn)定的，可遺傳的。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶分類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有兩種：1）DNMT1,持續(xù)性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶一一作用于僅有一條鏈甲基化的DNA雙鏈，使其完全甲基化，可參與DNA復(fù)制雙鏈中的新合成鏈的甲基化,DNMT1可能直接與HDAC（組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶）聯(lián)合作用阻斷轉(zhuǎn)錄;2）DNMT3a、DNMT3b從頭甲基轉(zhuǎn)移酶，它們可甲基化CpG,使其半甲基化，繼而全甲基化。從頭甲基轉(zhuǎn)移酶可能參與細(xì)胞生長分化調(diào)控，其中DNMT3b在腫瘤基因甲基化中起重要作用。DNA去甲基化有兩種方式:1）被動(dòng)途徑：由于核因子NF粘附甲基化的DNA，使粘附點(diǎn)附近的DNA不能被完全甲基化，從而阻斷DNMT1的作用；2）主動(dòng)途徑：是由去甲基酶的作用，將甲基基團(tuán)移去的過程。在DNA甲基化阻遏基因表達(dá)的過程中，甲基化CpG粘附蛋白起著重要作用。雖然甲基化DNA可直接作用于甲基化敏感轉(zhuǎn)錄因子E2F、CREB、AP2、CMycöMyn、NF2KB、Cmyb、Ets,使它們失去結(jié)合DNA的功能從而阻斷轉(zhuǎn)錄，但是，甲基化CpG粘附分子可作用于甲基化非敏感轉(zhuǎn)錄因子（SP1、CTF、YY1），使它們失活，從而阻斷轉(zhuǎn)錄。人們已發(fā)現(xiàn)5種帶有恒定的甲基化DNA結(jié)合域（MBD）的甲基化CpG粘附蛋白。其中MECP2、MBD1、MBD2、MBD3參與甲基化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄阻遏；MBD1有糖基轉(zhuǎn)移酶活性,可將T從錯(cuò)配堿基對(duì)TöG中移去,MBD4基因的突變還與線粒體不穩(wěn)定的腫瘤發(fā)生有關(guān)。在MBD2缺陷的小鼠細(xì)胞中，不含MECP1復(fù)合物，不能有效阻止甲基化基因的表達(dá)。這表明甲基化CpG粘附蛋白在DNA甲基化方式的選擇，以及DNA甲基化與組蛋白去乙酰化、染色質(zhì)重組相互聯(lián)系中的有重要作用。轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)，是一門在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。簡(jiǎn)而言之，轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達(dá)的情況。轉(zhuǎn)錄組即一個(gè)活細(xì)胞所能轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA。研究轉(zhuǎn)錄組的一個(gè)重要方法就是利用DNA芯片技術(shù)檢測(cè)有機(jī)體基因組中基因的表達(dá)。從基因組DNA轉(zhuǎn)錄的基因總和，即轉(zhuǎn)錄組，也稱為表達(dá)譜，是研究細(xì)胞表型和功能的一個(gè)重要手段。而研究生物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組的發(fā)生和變化規(guī)律的科學(xué)就稱為轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)。以DNA為模板合成RNA的轉(zhuǎn)錄過程是基因表達(dá)的第一步，也是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。所謂基因表達(dá)，是指基因攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)變?yōu)榭杀鎰e的表型的整個(gè)過程。轉(zhuǎn)錄組就是轉(zhuǎn)錄后的所有mRNA的總稱。與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時(shí)間和空間的限定。同一細(xì)胞在不同的生長