生物醫(yī)學(xué)電鏡技術(shù)與細(xì)胞及組織超微結(jié)構(gòu)總論

電子顯微鏡（ElectronMicroscope,EM)簡(jiǎn)稱(chēng)電鏡，它是用電子束代替可見(jiàn)光的顯微裝置，一種高放大、高分辨的大型精密儀器。目前電鏡已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、軍事等多個(gè)領(lǐng)域。EM在光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上使細(xì)胞學(xué)的概念更加完善，對(duì)疾病的認(rèn)識(shí),特別是對(duì)發(fā)病機(jī)理的研究做出了巨大貢獻(xiàn)。緒論目前一頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/20231（一）、電鏡技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史⑴、RobertHooke(1665)&Leeuwenhoek(1674)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞；⑵、19世紀(jì)30年代,Schleiden(1938)&Schwann（1839）提出細(xì)胞學(xué)說(shuō)(celltheory)；⑶、1932年，德國(guó)Knoll&Ruska建造第一臺(tái)電鏡(ElectronMicroscope,EM,×12);1933～1934年,電鏡的性能已達(dá)光鏡的分辨率0.2um,×10,000；1938-1939，第一批商品電鏡問(wèn)世，分辨率達(dá)100A；由于受到樣品制備技術(shù)的限制，20世紀(jì)50年代初，電鏡技術(shù)才開(kāi)始運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)方面的研究。⑷、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的分子細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)。目前二頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/20232(二)、分辨率與形態(tài)研究的關(guān)系1、分辨率（Resolution）

又稱(chēng)分辯本領(lǐng)（Resolvingpower），是將鄰近兩點(diǎn)清晰區(qū)分、辯認(rèn)的能力，用能被辨認(rèn)的鄰近兩點(diǎn)的距離表示。肉眼：在明視距離（25cm）時(shí)，為0.25mm；LM：可見(jiàn)光的平均波長(zhǎng)為500nm，r=λ/2，LM的極限分辨率為0.25um;EM：電子波波長(zhǎng)短,且波長(zhǎng)隨加速電壓的增高而更短，目前較好的電鏡分辨率為0.2nm左右,比LM提高1000倍,比人眼提高100萬(wàn)倍.(注)：①由于電鏡存在各種像差（包括球差、像散等）,限制了分辨率,不能真正達(dá)到其波長(zhǎng)的一半;②分辨率還受到許多因素的影響,如切片的厚度等，超薄切片較薄時(shí),分辨率可達(dá)1～2.5nm,切片較厚時(shí),實(shí)際分辨率為5～10nm.目前三頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202332、反差：

被觀(guān)察物與其背景在亮度（黑白對(duì)比度）上有所不同，這種差別稱(chēng)為反差；透射電鏡的反差主要由樣品對(duì)電子的散射產(chǎn)生。3、空放大

不能提供更為清晰的圖像放大，稱(chēng)為無(wú)效放大，也稱(chēng)無(wú)效放大。4、不同分辨率的形態(tài)研究目前四頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202345、亞微結(jié)構(gòu)與超微結(jié)構(gòu)的概念及關(guān)系亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopicstructure）：介于細(xì)胞水平和大分子水平之間的結(jié)構(gòu)；簡(jiǎn)稱(chēng)為“亞微結(jié)構(gòu)”或“亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（subcellullarstructure）”，也稱(chēng)“細(xì)微結(jié)構(gòu)（finestructure）”超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure）：嚴(yán)格的講，是指分子水平的結(jié)構(gòu)，目前一般書(shū)刊對(duì)亞顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)無(wú)嚴(yán)格的界限，往往將普通光鏡分辯界限以下的結(jié)構(gòu)籠統(tǒng)稱(chēng)為超微結(jié)構(gòu)。目前五頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/20235(三)、基本原理、構(gòu)造及電鏡的類(lèi)型電鏡的基本構(gòu)造及原理①、電子束主要特點(diǎn)：a、由電子組成，真空中直線(xiàn)前進(jìn)，具波動(dòng)特性；b、電子束受電力和磁力作用；c、電子束照射樣品時(shí)，能透過(guò)極薄樣品，得到透射電子，或產(chǎn)生二次電子，特征X射線(xiàn)，背散射電子等。目前六頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/20236②、電鏡的基本構(gòu)造：以透射電鏡為例目前七頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/20237電鏡的類(lèi)型①、透射式電子顯微鏡(TransmissionElectronMicroscope,TEM)；最常用、最典型，主要用于觀(guān)察超薄切片和負(fù)染樣品，點(diǎn)分辨率的理論值可達(dá)1.4～2A。②、掃描式電子顯微鏡（ScanningElectronMicroscope，SEM）；具有景深長(zhǎng)，視野廣，觀(guān)察樣品表面立體圖像的特點(diǎn)，其分辨率和放大倍數(shù)都遠(yuǎn)低于TEM，一般分辨率為60A左右。上述兩種電鏡可綜合，兼有功能，是現(xiàn)代電鏡發(fā)展的代表（STEM）。目前八頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/20238③、超高壓電鏡（HighVoltageElectronMicroscope,HVEM）；常規(guī)電鏡加速電壓一般在200KV以下，如果加速電壓在500KV以上，則稱(chēng)為HVEM。特點(diǎn):觀(guān)察厚切片(0.5-3um)，提高分辨率。觀(guān)察到原子水平，期望觀(guān)察生活標(biāo)本（含水份）④、分析電鏡（ElectronMicroscopeMicroanalyser，EMMA）；I、波譜儀（wavelength-dispersivespectrometer，WDS）II、能譜儀（energy-dispersivespectrometer，EDS）⑤、掃描探針顯微鏡(Scanningprobemicroscope,SPM):原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope,AFM)；掃描隧道顯微鏡(scanningtunnelingmicroscope,STM)。目前九頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/20239目前十頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202310目前十一頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202311目前十二頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202312目前十三頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202313目前十四頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202314目前十五頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202315③、掃描電鏡的二次成像原理掃描電鏡一般可分為四個(gè)重要的組成部分：a、形成電子探針的電子光學(xué)系統(tǒng)；b、探針的電子束打擊樣品表面形成信息信號(hào)；c、檢測(cè)系統(tǒng)；d、電子偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)（是電子探針在樣品表面按一定順序掃描，并且使這一掃描過(guò)程與陰極射線(xiàn)管的電子束在熒光屏上移動(dòng)同步）。目前十六頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202316目前十七頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202317掃描電鏡的結(jié)構(gòu)示意圖：目前十八頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202318目前十九頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202319目前二十頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202320目前二十一頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202321目前二十二頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202322目前二十三頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202323目前二十四頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202324目前二十五頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202325(四)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)研究的展望①、二維三維，如三維重建技術(shù)；②、從單純的形態(tài)觀(guān)察,深入到對(duì)其功能、代謝、化學(xué)組成、分子結(jié)構(gòu)及元素分布的研究。如X線(xiàn)顯微分析(electronprobex-raymicroanalysis)；③、定性描述定量測(cè)定方向發(fā)展，如電鏡形態(tài)測(cè)量技術(shù)（morphometry）；④、從經(jīng)化學(xué)固定的結(jié)構(gòu)向活細(xì)胞整體方向發(fā)展，如超高壓電鏡技術(shù)的應(yīng)用；⑤、儀器設(shè)備向小型化方向發(fā)展。目前二十六頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202326本課程的重點(diǎn)內(nèi)容①電鏡生物樣品制備常規(guī)技術(shù)及應(yīng)用范圍;②電鏡圖片的分析要領(lǐng);③正常細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)理論和超微病理內(nèi)容的基本掌握。學(xué)習(xí)要點(diǎn)①重視圖像的分析和識(shí)別；②注意LM和EM結(jié)合；③形態(tài)與功能的聯(lián)系；④正常超微結(jié)構(gòu)與超微病理的聯(lián)系；⑤建立整體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能概念。主要參考文獻(xiàn)①電子顯微鏡術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用,杭振鑣蔡文琴主編,重慶出版社,1988年8月,第一版；②醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué),宋今丹主編,人民衛(wèi)生出版社,1997年5月,第一版；③醫(yī)用電子顯微學(xué)，薄愛(ài)華主編,人民衛(wèi)生出版社,2000年11月,第一版；④超微病理學(xué)基礎(chǔ),武忠弼主編,人民衛(wèi)生出版社,1990年9月,第一版；⑤UltrastructuralPathologyoftheCellandMatrix.ThirdEditionVol.1FeroceN,GhadiallyButterworths1988目前二十七頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202327電鏡生物樣品制備技術(shù)

樣品制備是電鏡技術(shù)中一個(gè)很重要的組成部分，是電鏡工作中最繁重的環(huán)節(jié)。要學(xué)習(xí)掌握好細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)知識(shí)及應(yīng)用電鏡技術(shù)進(jìn)行研究工作，都必須首先了解電鏡的標(biāo)本制備技術(shù)，故屬于本課程的重點(diǎn)內(nèi)容。目前二十八頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202328（一）、超薄切片及其染色技術(shù)超薄切片（ultrathin-section）制備過(guò)程示意圖：目前二十九頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/2023291、取材的基本原則：快：1min?。?mm3利：靜：冷：4℃取材部位要準(zhǔn)確；成批取材，部位一致、；標(biāo)本的編號(hào)和標(biāo)簽。目前三十頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/2023302、固定：①、幾種常用的固定劑的理化特性和使用原則：a、四氧化鋨（Osmiumtetroxide，OsO4）；又稱(chēng)鋨酸，是電鏡生物樣品使用最廣泛的固定劑，兼有電子染色作用，可作單固定，一般不用于電鏡細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)的固定。對(duì)糖原和核酸的保護(hù)作用差。多用于后固定。b、戊二醛（glutaraldehyde，C5H8O2）；不能單獨(dú)作為電鏡樣品固定液，對(duì)脂肪的保護(hù)作用差。沒(méi)有“電子染色”的作用，通常用于前固定。c、甲醛（formaldehyde）。電鏡多用多聚甲醛，對(duì)酶活性保存好，可與戊二醛混合或單獨(dú)用于細(xì)胞化學(xué)灌流固定或作為前固定液。②、固定方法：

a、雙重固定法；b、體內(nèi)原位固定法；c、灌流固定法。

目前三十一頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/2023313、脫水：應(yīng)遞增濃度進(jìn)行4、浸透：半浸透純浸透5、包埋、聚合：環(huán)氧樹(shù)脂（epoxyresin）618#，Epon8126、切片：修塊光切（半薄切片，0.5-1um）定位超切(超薄切片,50-70nm)超薄切片機(jī)(ultramicrotome)，玻璃刀，鉆石刀，復(fù)有支持膜的載網(wǎng)（grid）（銅、鎳、金網(wǎng)）。目前三十二頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/2023327、電子染色：利用重金屬離子對(duì)不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)的結(jié)合能力不同，使各細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)電子產(chǎn)生不同散射程度，以增強(qiáng)明暗之比（反差）。①常用的電子染色劑有以下幾種

a、醋酸鈾（Uranylacetate），即醋酸雙氧鈾，多用于塊染；b、枸櫞酸鉛（Leadcitrate），用于片染，易被空氣中的CO2污染。

②電子密度（electrondensity）的概念：目前三十三頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202333（二）、負(fù)染技術(shù)利用高密度無(wú)結(jié)構(gòu)的重金屬物質(zhì)把生物標(biāo)本包繞起來(lái)。這種反差是負(fù)像（與正染色的超薄切片相比較）。最常用的染色劑是磷鎢酸鈉（phosphotungsticacid，PTA），此法常用于病毒、蛋白分子或細(xì)胞亞單位的分子結(jié)構(gòu)研究，制樣簡(jiǎn)單，可作快速診斷。目前三十四頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202334（三）、電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

（electronmicroscopiccytochemistry）在保持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)完整的條件下，借助細(xì)胞中的化學(xué)反應(yīng)，研究細(xì)胞乃至細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，是與化學(xué)、生物化學(xué)及免疫學(xué)有密切聯(lián)系的一門(mén)學(xué)科。廣義的電鏡細(xì)胞化學(xué)研究方法主要有細(xì)胞超微標(biāo)記示蹤技術(shù)、電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（簡(jiǎn)稱(chēng)免疫電鏡技術(shù)）等幾種。目前三十五頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/2023351、電鏡酶細(xì)胞化學(xué)術(shù)(electronmicroscopiccytochemistryofenzymeorultracytochemistryofenzyme)基本原理及內(nèi)容:酶細(xì)胞化學(xué)術(shù)（enzymecytochemistry）是利用酶催化反應(yīng)特點(diǎn)，從亞微結(jié)構(gòu)上研究酶的分布和活性。按其催化反應(yīng)的性質(zhì)可分為水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶、合成酶和異構(gòu)酶六大類(lèi)，應(yīng)用較多的有水解酶和氧化還原酶?，F(xiàn)以水解酶為例，介紹此技術(shù)的主要過(guò)程和基本原理。初級(jí)反應(yīng)：底物被磷酸水解酶作用后分解產(chǎn)生磷酸。底物磷酸水解酶H3PO4

最終反應(yīng)：磷酸與金屬捕捉劑結(jié)合形成反應(yīng)產(chǎn)物。H3PO4捕捉劑（如Pb2+）Pb3(PO4)2↓反應(yīng)產(chǎn)物為電子致密的沉淀物，電鏡下易于觀(guān)察并顯示出酶的定位。近年來(lái)常用鈰（Ce3+）作為捕捉劑。目前三十六頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202336目前三十七頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202337應(yīng)用一般說(shuō)透射電鏡已能分辨出超微結(jié)構(gòu)和某些化學(xué)成份，如糖原顆粒、核糖體、染色質(zhì)和脂類(lèi)等。電鏡酶細(xì)胞化學(xué)則著重顯示各超微結(jié)構(gòu)的酶特別是標(biāo)志酶，研究細(xì)胞器的化學(xué)、功能及其動(dòng)態(tài)變化，由于電鏡方法的限制，迄今所能顯示的酶為數(shù)尚少。酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)主要用于：（1）酶在超微結(jié)構(gòu)上的定位，（2）標(biāo)記和鑒定某些細(xì)胞和細(xì)胞器，（3）通過(guò)顯示過(guò)氧化物酶，定位示蹤HRP,（4）利用免疫酶技術(shù)，電鏡下顯示特異性標(biāo)記物的定位。目前應(yīng)用電鏡技術(shù)常顯示的標(biāo)志酶有：各種細(xì)胞器的標(biāo)志酶細(xì)胞器標(biāo)志酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核苷二磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸酶高爾基體焦磷酸硫胺素酶（Trans膜囊）、煙酸胺腺嘌呤二核苷磷酸酶（中間膜囊）溶酶體酸性磷酸酶微體過(guò)氧化氫酶線(xiàn)粒體細(xì)胞色素氧化酶、琥珀酸脫氨酶細(xì)胞膜核糖核苷磷酸酶（如ATP酶）、堿性磷酸酶目前三十八頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202338Figure10G-6-PasereactionproductswererichinLeydigcellofthecontrolgrouprats.×20000Figure11G-6-Pasereactionproductsdecreasedmarkedlyafter3dofcadiumtreatment.×20000Figure12ShowingintenseG-6-PasereactionproductsofLeydigcellafter3dofcadiumaddzinctreatment.×20000目前三十九頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202339目前四十頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202340RER,G-6-PasePlasmalemma,AlPMito.,SDH目前四十一頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/2023412、免疫電鏡技術(shù)(immunoelectronmicroscopy)

免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)（immunocytochemistry）是用標(biāo)記特異性抗體對(duì)組織內(nèi)抗原分布進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究的一門(mén)分支學(xué)科。60年代，Nakane建立了酶標(biāo)記抗體技術(shù)，70年代，Sternberger在此基礎(chǔ)上改良并建立了非標(biāo)記過(guò)氧化物酶--抗過(guò)氧化物酶（PAP）技術(shù)，80年代Hsu建立了抗生物素--生物素（ABC）法之后，膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫金銀染色和親和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)等相繼問(wèn)世，使免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能、代謝綜合研究的一項(xiàng)有力工具。目前免疫細(xì)胞化學(xué)正在向定量和分子水平發(fā)展。目前四十二頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202342

常用免疫電鏡方法的原理及步驟

PAP法

基本原理：PAP（peroxidase-antiperoxidase）法，又稱(chēng)可溶性酶--抗酶法。特點(diǎn)為參加反應(yīng)的抗體都不被酶直接標(biāo)記。包括以下步驟：①用第一抗體（Ab1）與組織中特異性抗原（Ag）相結(jié)合形成抗原抗體（Ag－Ab1）復(fù)合物；②用第二抗體（Ab2）的一個(gè)Fab段與第一抗體結(jié)合，另一個(gè)Fab段游離，形成抗原--第一抗體--第二抗體（Ag-Ab1-Ab2）復(fù)合物；③用過(guò)氧化物酶--抗過(guò)氧化物酶復(fù)合物（PAP，與Ab1同種動(dòng)物的血清）與第二抗體的游離Fab段結(jié)合，形成Ag-Ab1-Ab2－PAP復(fù)合物；④用過(guò)氧化氫和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）使PAP的過(guò)氧化物酶形成不溶的、暗棕色的嗜鋨化合物。

優(yōu)點(diǎn)：①保存抗體活性好；②PAP復(fù)合物穩(wěn)定；③敏感性高，比間接免疫熒光抗體法敏感性高100～1000倍；④由于敏感性高,節(jié)約了抗體用量,也減少了非特異性背景染色。

缺點(diǎn)：①反應(yīng)產(chǎn)物顆粒較大，遮蓋背景；②DAB有致癌作用，操作中需格外小心；③內(nèi)源性氧化酶對(duì)此法有干擾。目前四十三頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202343目前四十四頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202344

ABC法

基本原理：抗生物素--生物素--過(guò)氧化物酶復(fù)合物技術(shù)（Avidin-Biotin-PeroxidaseComplexTechnique）簡(jiǎn)稱(chēng)ABC技術(shù)，是目前常用的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)之一。1979年Guessdon首先把生物素--卵白素技術(shù)用于免疫組織化學(xué)，先后設(shè)計(jì)出橋式卵白素--生物素（BAB）技術(shù)和標(biāo)記式卵白素一生物素（LAB）技術(shù)，1981年Hsu和許世明在BAB法和LAB法基礎(chǔ)上改良而建立了ABC法，其基本原理與PAP法相似，特點(diǎn)是利用抗生物素分別連接生物素標(biāo)記的第二抗體和生物素標(biāo)記的過(guò)氧化物酶，形成抗原--第一抗體--生物素標(biāo)記的第二抗體--抗生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合體（Ag－Ab1－Ab2－ABC）?？股锼赜址Q(chēng)卵白素（Avidin），它有四個(gè)活動(dòng)結(jié)合點(diǎn)，并與生物素有特別高的親和力，一旦和生物素結(jié)合就極為穩(wěn)定。當(dāng)生物素和第二抗體共價(jià)偶聯(lián)后，就使第二抗體獲得與抗生物素相結(jié)合的能力。目前四十五頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202345目前四十六頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202346膠體金標(biāo)記技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：（l）膠體金可標(biāo)記各種不同的生物大分子(如免疫球蛋白、葡萄球菌A蛋白、植物凝集素、刀豆球蛋白A等)，并使其保持原有的生物學(xué)活性。（2）膠體金標(biāo)記技術(shù)可適用于光鏡、透射及掃描電鏡、X射線(xiàn)能譜分析、熒光顯微鏡等。（3）膠體金非特異性吸附作用小、特異性強(qiáng)。（4）金顆粒電子密度大，電鏡下檢出率遠(yuǎn)比DAB反應(yīng)產(chǎn)物高，敏感性比PAP法高20～200倍、比ABC法亦高數(shù)倍。（5）膠體金標(biāo)記物是顆粒狀物，電鏡下易于計(jì)數(shù)，可直接定量檢測(cè)抗原。（6）膠體金標(biāo)記不受內(nèi)源性物質(zhì)影響。（7）膠體金顆粒直徑可根據(jù)需要控制，將不同直徑的肢體金分別標(biāo)記不同抗體或抗原，可在同一張切片上同時(shí)區(qū)分兩種或兩種以上的抗原或抗體，特別適合于電鏡水平的雙標(biāo)記或多標(biāo)記。（8）膠體金標(biāo)記和IGSS特別有利于回顧性研究,如過(guò)去病理外檢的石蠟切片和電鏡包埋塊,需要時(shí)可進(jìn)行膠體金標(biāo)記研究。膠體金的顆粒較大,穿透性弱,是它的主要缺點(diǎn)。電鏡水平的免疫金技術(shù)，同PAP和ABC法免疫電鏡一樣，關(guān)鍵在于抗原的保存。用L.R.White和LowicrylK4M包埋，其保存抗原優(yōu)于Epon812，用冷凍超薄切片作IGS，由于抗原性保存很好，更易成功。目前多采用包埋后染色。包埋前染色，免疫金試劑對(duì)細(xì)胞膜的穿透性差,一般只用于細(xì)胞表面抗原的標(biāo)記。目前四十七頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202347目前四十八頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202348（四）、真空噴鍍和離子濺射技術(shù)真空噴鍍：

真空條件下金屬加熱至一定溫度后，將以細(xì)顆粒向四周發(fā)射，在樣品面對(duì)噴鍍?cè)吹囊幻嫘纬梢粚又亟饘俦∧ぁＳ址Q(chēng)金屬投影法（metalshadowing）。離子濺射：

與真空噴鍍的區(qū)別在于：真空度不同，重金屬離子運(yùn)動(dòng)的方向不同，鍍膜效果較前者好，金屬用量可少10倍，鍍膜更為均勻。目前四十九頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202349（五）、冷凍蝕刻技術(shù)（freezeetching）及冷凍割斷技術(shù)（freezefracture）冷凍蝕刻技術(shù)又稱(chēng)冷凍蝕刻復(fù)型法（freezeetchingreplica），該技術(shù)主要用于生物膜內(nèi)部及細(xì)胞內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)的研究，如核孔復(fù)合體、細(xì)胞連接等。目前五十頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202350目前五十一頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202351目前五十二頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202352（六）、掃描電鏡樣品制備技術(shù)

目前五十三頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202353（七）、電鏡X線(xiàn)顯微分析術(shù)（electronmicroscopicX-raymicroanalysis）

又稱(chēng)電子探針X線(xiàn)顯微分析（electronprobeX-raymicroanalysis）或簡(jiǎn)稱(chēng)X線(xiàn)微區(qū)分析（X-rayMA），是電鏡技術(shù)與X線(xiàn)分析技術(shù)相結(jié)合的一種方法。基本原理：當(dāng)高速電子束轟擊固體標(biāo)本表面的微小區(qū)域，使該區(qū)域所含的元素發(fā)射X線(xiàn)，各種元素都能發(fā)射自己的特征X線(xiàn)，通過(guò)檢測(cè)發(fā)射的X線(xiàn)的波長(zhǎng)和強(qiáng)度，便可了解該微小區(qū)域所含元素的種類(lèi)及含量。分析儀器包括：a、電子探針顯微分析儀；b、掃描電境與X線(xiàn)檢測(cè)器的結(jié)合；c、掃描透射電境與X線(xiàn)檢測(cè)器的結(jié)合；d、專(zhuān)用分析電鏡（electronmicroscopemicroanlyser，EMMA）；e、透射電鏡與X線(xiàn)檢測(cè)器的結(jié)合。目前五十四頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202354優(yōu)點(diǎn)：①、分析過(guò)程不破壞樣品結(jié)構(gòu)，在保持各元素原有分布情況下對(duì)生物細(xì)胞內(nèi)各種元素同時(shí)進(jìn)行分析；②、結(jié)合拍攝透射或掃描電鏡圖像，可在形態(tài)觀(guān)察的同時(shí)對(duì)一定結(jié)構(gòu)內(nèi)的元素進(jìn)行測(cè)量，從而獲知超微結(jié)構(gòu)變化與其組成元素變化的關(guān)系。③、靈敏度高，可辨別＜1um3區(qū)域內(nèi)質(zhì)量小于10-14g的元素。應(yīng)用：中藥研究，鈣庫(kù)研究，重金屬中毒（如鎘）研究等。目前五十五頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202355(八)、電鏡細(xì)胞立體形態(tài)計(jì)量技術(shù)用立體學(xué)方法來(lái)分析形態(tài)結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為形態(tài)計(jì)量學(xué)（morphometry）或體視學(xué)，形態(tài)定量分析目的是從二維圖像推導(dǎo)出三維結(jié)構(gòu)參數(shù)。①人工法；②生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（九）、掃描血管鑄型（casting）技術(shù)

觀(guān)察和研究腔隙性器官，特別是器官內(nèi)的血管立體構(gòu)筑和分布情況。鑄型劑----甲基丙烯酸酯樣品經(jīng)腐蝕，清洗，鍍膜后在SEM下觀(guān)察。（十）、特殊樣品制備①甲醛固定石蠟包埋樣品；②培養(yǎng)細(xì)胞及游離細(xì)胞；③血液（白細(xì)胞、血小板），精液等液體標(biāo)本；④骨組織。目前五十六頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202356目前五十七頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202357電鏡技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用基礎(chǔ)研究方面：

在病毒學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)及分子病理學(xué)上均做出了卓有成效的貢獻(xiàn)。如核蛋白體超微結(jié)構(gòu)的研究；核蛋白體與mRNA關(guān)系的闡明；核小體的發(fā)現(xiàn)；DNA復(fù)制及RNA轉(zhuǎn)錄的分子形態(tài)觀(guān)察；線(xiàn)粒體內(nèi)膜的ATP合成酶顆粒的發(fā)現(xiàn)；電鏡是直接觀(guān)察病毒的唯一工具。臨床醫(yī)學(xué)方面：電鏡在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用近10多年來(lái)已從醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)性理論研究逐漸擴(kuò)大到臨床醫(yī)學(xué)的實(shí)際應(yīng)用方面。對(duì)疾病的病情、病因的鑒定，對(duì)腫瘤、血液病及腎臟病等的分型診斷上都取得顯著成效。由于內(nèi)窺鏡的應(yīng)用和穿刺技術(shù)的發(fā)展，使得臨床上獲得如心臟、肝、腎、胃等臟器的標(biāo)本變得較容易。目前五十八頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202358目前五十九頁(yè)\總數(shù)六十四頁(yè)\編于二十點(diǎn)4/29/202359正確評(píng)價(jià)電鏡的使用：