環(huán)境生物技術(shù)污染物的生物毒性效應(yīng)研究方法司演示文稿

環(huán)境生物技術(shù)污染物的生物毒性效應(yīng)研究方法司演示文稿1目前一頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)（優(yōu)選）環(huán)境生物技術(shù)污染物的生物毒性效應(yīng)研究方法司目前二頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)污染物在生物化學(xué)和分子水平上的影響污染物在細(xì)胞和器官水平上的影響污染物在個(gè)體水平上的影響污染物在種群和群落水平上的影響化學(xué)污染物對(duì)生物的聯(lián)合作用3主要內(nèi)容：目前三頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)5.6.1污染物在生物化學(xué)和分子水平上的影響4目前四頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)5污染物進(jìn)入機(jī)體后導(dǎo)致的生物化學(xué)變化包括：防護(hù)性生化反應(yīng)和非防護(hù)性生化反應(yīng)。作用類型例子后果防護(hù)性混合功能氧化酶的誘導(dǎo)加快新陳代謝，生成水溶性代謝物，從而加速排泄金屬硫蛋白的生成增加對(duì)金屬的束縛速度，從而降低金屬的生物利用率非防護(hù)性乙酰膽堿酯酶的抑制作用50％以上因抑制而產(chǎn)生可見(jiàn)的毒性效應(yīng)DNA加合物的生成若導(dǎo)致突變會(huì)發(fā)生損害作用表2－1對(duì)污染物的防護(hù)性和非防護(hù)性生化反應(yīng)目前五頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)什么是酶（enzyme）？酶是一種特殊的蛋白質(zhì)，在生物體內(nèi)對(duì)代謝活動(dòng)起催化作用，本身不發(fā)生變化。受酶作用的物質(zhì)稱為基質(zhì)（底物），在酶作用下的反應(yīng)稱為酶促反應(yīng)。酶和污染物的相互作用污染物進(jìn)入機(jī)體后，一方面在酶的催化下，進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，另一方面也導(dǎo)致體內(nèi)酶活性改變，影響酶的數(shù)量和活性。另外有些環(huán)境污染物對(duì)酶有誘導(dǎo)作用。目前已發(fā)現(xiàn)多種環(huán)境污染物能誘導(dǎo)生物體內(nèi)一些酶的活性增加，例如：有機(jī)氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、表面活性劑、增塑劑和染料中間體等，均可對(duì)酶產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。6(1)污染物對(duì)生物機(jī)體酶的影響目前六頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)污染物對(duì)酶輔助因子的影響一些污染物能與酶的輔助因子——金屬離子作用，從而使輔助因子失活，影響到酶的活性。例如：氰化物等能與細(xì)胞色素酶中的鐵離子結(jié)合，形成穩(wěn)定絡(luò)合物，而抑制細(xì)胞色素的酶活性，使其不能傳遞電子，則細(xì)胞內(nèi)的氧化代謝過(guò)程中斷，使機(jī)體不能利用氧，出現(xiàn)內(nèi)窒息性缺氧。對(duì)酶活性中心的影響污染物還能和酶的其它活性基團(tuán)結(jié)合，如汞和砷與某些酶的活性基團(tuán)結(jié)合就很牢固，從而使酶失去活性。破壞酶的結(jié)構(gòu)有些污染物能夠取代酶分子中的某些成分，從而使酶失去活性。如鈹?shù)亩咀饔脵C(jī)理就是能取代某些酶分子中的鎂和錳，破壞了酶的正常結(jié)構(gòu)，使酶失去活性。7目前七頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)與酶激活劑作用有些酶需要激活劑才能表現(xiàn)活性。酶激活劑往往是金屬離子，凡是能與激活劑作用的污染物都能抑制酶的活性。污染物與基質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)同種酶而抑制酶的作用污染物與底物有相似的結(jié)構(gòu)，也能與酶形成復(fù)合物，從而競(jìng)相和酶發(fā)生作用。酶的抑制不可逆性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制競(jìng)爭(zhēng)性抑制8目前八頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)混合功能氧化酶（MFO）MFO是污染物在體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化相I過(guò)程中的關(guān)鍵酶系，它們對(duì)人工化學(xué)品解毒發(fā)揮了重要作用。MFO引起的生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)特征相同，但底物、產(chǎn)物的化學(xué)特性差別很大，即具有多種催化功能?；旌瞎δ苎趸福∕FO）的作用MFO存在于所有的脊椎動(dòng)物和大部分的無(wú)脊椎動(dòng)物中，其作用是代謝非極性的親脂性有機(jī)化合物，包括內(nèi)源性化合物和外源性化合物。從解毒作用來(lái)看，許多外源性化合物進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)MFO作用后發(fā)生各種變化，大多數(shù)被轉(zhuǎn)化成低毒易溶的代謝產(chǎn)物排出體外。但有的則變成高毒甚至致癌物。9①

混合功能氧化酶（MFO）目前九頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)活性氧（ActivatedOxygen）帶有2~3個(gè)電子的分子氧還原產(chǎn)物，主要有：·OH、O2-、H2O2活性氧的控制和消除由體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧可為抗氧化防御系統(tǒng)控制，消除活性氧對(duì)機(jī)體的傷害作用。某些污染物如多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯在生物體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)產(chǎn)生大量活性氧。在一定范圍內(nèi)，這些活性氧可被體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)清除，但當(dāng)體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)不能消除這些活性氧時(shí)，它們可使DNA鏈斷裂、脂質(zhì)過(guò)氧化、酶蛋白失活等，從而引起機(jī)體氧化應(yīng)激或氧毒性?？寡趸烙到y(tǒng)酶超氧化物歧化酶（SOD）谷胱甘肽氧化酶（GPx）過(guò)氧化氫酶（Ct）10②抗氧化防御系統(tǒng)酶目前十頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)污染物對(duì)生物大分子的影響主要表現(xiàn)在以下方面：干擾正常的受體——配體的相互作用受體（receptor）是許多組織細(xì)胞膜上的大分子成分，配體（ligand）是生物體內(nèi)的一些具有生物活性的化學(xué)物。正常情況下，受體與配體結(jié)合形成受體－配體復(fù)合物，產(chǎn)生一定的生物學(xué)效應(yīng)。生物膜損傷不少環(huán)境化學(xué)物通過(guò)改變膜脂流動(dòng)性，影響膜的通透性和鑲嵌蛋白質(zhì)的活性，改變其結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，從而產(chǎn)生生物效應(yīng)干擾細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)正常情況下細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度較低（10－7～10－8mol/L），細(xì)胞外濃度較高（103mol/L

）。各種細(xì)胞毒物，如硝基酚、過(guò)氧化物、汞、鉛等重金屬離子均能干擾細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，引起細(xì)胞損傷和死亡。11（2）

污染物對(duì)生物大分子的影響目前十一頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)干擾細(xì)胞能量的合成一些環(huán)境污染物可干擾糖類的氧化，使細(xì)胞不能合成能被生物利用的ATP，ATP使細(xì)胞生命活動(dòng)得不到充足的能量供給脂質(zhì)過(guò)氧化(lipidperoxidation)與自由基

脂質(zhì)過(guò)氧化是細(xì)胞損傷的一種特殊方式,是由于產(chǎn)生了自由基而引起的,正常情況下,生物體內(nèi)氧化、還原和酶促反應(yīng)過(guò)程中，均可產(chǎn)生少量自由基，一般可被體內(nèi)存在的抗氧化物質(zhì)（如維生素C、維生素E）所對(duì)抗，對(duì)生物危害不大。當(dāng)大量污染物（自由基）進(jìn)入機(jī)體，造成機(jī)體抗氧化作用失衡，即可發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)生物體造成危害。與生物大分子共價(jià)結(jié)合共價(jià)結(jié)合可改變生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，引起一系列生物學(xué)改變，特別是與酶蛋白、脂肪、核酸等重要生物大分子共價(jià)結(jié)合，能改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)，影響其生理功能，甚至導(dǎo)致變性和細(xì)胞死亡。12目前十二頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)污染物對(duì)蛋白質(zhì)的影響主要表現(xiàn)在以下方面：導(dǎo)致蛋白質(zhì)化學(xué)損傷：細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及通透性改變；影響酶的催化功能等誘導(dǎo)生物機(jī)體內(nèi)一些功能蛋白的產(chǎn)生：如應(yīng)激蛋白（StressProteins）和金屬硫蛋白（Metallothionein）的產(chǎn)生，這些蛋白質(zhì)的產(chǎn)生可保護(hù)生物機(jī)體抵抗污染物的損害。注：金屬硫蛋白對(duì)二價(jià)金屬離子具有極高的親和力，在細(xì)胞內(nèi)起貯存必需的微量金屬如Zn、Cu和結(jié)合有毒金屬如Cd、Hg的作用，它與必需金屬的結(jié)合起調(diào)節(jié)這些金屬在細(xì)胞內(nèi)濃度的作用，而與有毒金屬結(jié)合則可以保護(hù)細(xì)胞免受金屬毒性影響。13例：污染物對(duì)蛋白質(zhì)的影響目前十三頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)外源性化合物及其代謝產(chǎn)物能引起DNA損傷，它們與DNA的相互作用過(guò)程有以下四個(gè)階段：形成DNA加合物（DNAAddcuts）發(fā)生DNA的二次修飾DNA結(jié)構(gòu)的破壞被固定當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，外源性化合物造成的危害可導(dǎo)致DNA突變及其基因功能的改變DNA加合物的形成是產(chǎn)生DNA損傷最早期的作用，隨后產(chǎn)生的最重要影響是DNA結(jié)構(gòu)的改變，如堿基置換、堿基丟失、鏈斷裂等。DNA加合物作為一項(xiàng)生物指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)環(huán)境中化學(xué)污染物的遺傳毒性的研究日益受到重視。14污染物對(duì)DNA的影響目前十四頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)對(duì)細(xì)胞膜的影響主要表現(xiàn)在以下方面：污染物引起的脂質(zhì)過(guò)氧化作用導(dǎo)致的損傷污染物可影響膜的離子通透性污染物與膜上的受體結(jié)合，干擾正常的生理功能155.6.2污染物在細(xì)胞和器官水平上的影響

（1）對(duì)細(xì)胞膜的影響目前十五頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)在逆境脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基。活性氧很容易使植物細(xì)胞內(nèi)膜發(fā)生過(guò)氧化作用或脫脂作用，而丙二醛則是細(xì)胞內(nèi)膜脂過(guò)氧化或脫脂的產(chǎn)物，會(huì)嚴(yán)重地?fù)p傷細(xì)胞的生物膜，降低膜中不飽和脂肪酸的含量，使膜的流動(dòng)性降低，作為間接衡量植物體內(nèi)氧化損傷程度的指標(biāo)。16鎘-鋅-砷單一及復(fù)合污染對(duì)浮萍的毒性效應(yīng)

目前十六頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)同一濃度處理水平下，單一重金屬污染對(duì)浮萍丙二醛含量影響的大小依次為Cd>Zn>As。與單一污染相比，復(fù)合污染對(duì)浮萍丙二醛的生態(tài)毒性效應(yīng)情況則較復(fù)雜，As+Cd對(duì)浮萍丙二醛含量的影響是因?yàn)閮烧叱尸F(xiàn)拮抗作用的結(jié)果，對(duì)浮萍細(xì)胞膜增透作用較弱。而其他3種復(fù)合污染在低濃度時(shí)對(duì)浮萍丙二醛含量影響較大，在高濃度時(shí)影響作用下降。同一濃度處理水平下，單一重金屬污染對(duì)浮萍的生態(tài)毒性效應(yīng)表現(xiàn)在對(duì)葉綠素的損傷程度為Cd>Zn>As，與單一污染相比，As+Cd和Zn+Cd復(fù)合污染對(duì)浮萍毒性增強(qiáng)，表現(xiàn)為協(xié)同作用，加強(qiáng)了對(duì)浮萍葉細(xì)胞的傷害；而As+Zn和As+Zn+Cd復(fù)合污染對(duì)浮萍的聯(lián)合毒性作用趨向于毒性減少的拮抗作用。17目前十七頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)線粒體線粒體是細(xì)胞供能的場(chǎng)所。污染物可引起其結(jié)構(gòu)改變，從而影響線粒體的氧化磷酸化和電子傳遞功能光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是進(jìn)行激素和外源性化合物的代謝場(chǎng)所。糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：通過(guò)附著或解離核糖體控制蛋白質(zhì)的合成例：多種化學(xué)致癌物如黃曲霉毒素能引起核糖體脫落，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成控制的改變。18（2）對(duì)細(xì)胞器的影響目前十八頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)三個(gè)概念：靶器官、效應(yīng)器官和蓄積器官注1：靶器官不同于效應(yīng)器官，污染物的毒作用可以通過(guò)靶器官表現(xiàn)處來(lái)，也可由另外的效應(yīng)器官表現(xiàn)出來(lái)。注2：靶器官不同于蓄積器官，污染物在蓄積器官內(nèi)的濃度高于其他器官，但對(duì)蓄積器官并不一定顯示毒作用。對(duì)組織器官的影響對(duì)植物，表現(xiàn)為葉面出現(xiàn)點(diǎn)、片傷害斑，造成葉、蕾、花、果實(shí)等的脫落對(duì)動(dòng)物，以重金屬污染為例：鉛可損害造血器官和神經(jīng)系統(tǒng)，鎘可損害肝臟、腎臟，導(dǎo)致骨痛病。19（3）

污染物對(duì)組織器官的影響目前十九頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)污染物對(duì)植物在個(gè)體水平上的影響：主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)減慢、發(fā)育受阻、失綠黃化、早衰等污染物對(duì)動(dòng)物在個(gè)體水平上的影響：主要表現(xiàn)為死亡、行為改變、繁殖下降、生長(zhǎng)和發(fā)育抑制、疾病敏感性增加、代謝率變化205.6.3污染物在個(gè)體水平上的影響目前二十頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)衡量致死效應(yīng)的指標(biāo)死亡率：死亡比例的大小，為評(píng)價(jià)污染物毒性大小的生物學(xué)指標(biāo)。致死劑量（LethalDose）或致死濃度（LethalConcentration）：能引起動(dòng)物死亡的污染物的劑量或濃度。半數(shù)致死劑量（LD50）或半數(shù)致死濃度（LC50）：能引起50％的動(dòng)物死亡的污染物的劑量或濃度。影響致死效應(yīng)的主要因素：污染物的種類及其物理化學(xué)性質(zhì)生物的種類作用時(shí)間、水質(zhì)條件，如溫度、硬度、溶解氧等多種污染物的綜合作用21（1）致死效應(yīng)目前二十一頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)行為毒性（BehavioralToxicity）的概念指一種污染物或其他因素（如溫度、光照、輻射）使得動(dòng)物一種行為超過(guò)正常變化的范圍。水環(huán)境污染可影響的生物行為：回避行為捕食行為學(xué)習(xí)行為警惕行為社會(huì)行為對(duì)鳥類行為的影響有機(jī)磷農(nóng)藥可影響鳥的神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致鳥的平衡和協(xié)調(diào)性的損害。受污染的鳥類還可表現(xiàn)出對(duì)領(lǐng)地的失控和不能照顧后代。22（2）對(duì)行為的影響目前二十二頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)污染物對(duì)繁殖的影響主要表現(xiàn)為：產(chǎn)卵數(shù)、孵化率、幼體存活率下降以及繁殖行為下降等。概念：環(huán)境激素（EnvironmentalEndocrineDisrupters）指具有動(dòng)物和人體激素的活性，能干擾和破壞野生動(dòng)物繁殖障礙、誘發(fā)人類重大疾病的天然物質(zhì)或人工合成物質(zhì)。也叫做外源性雌激素或環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。環(huán)境激素的種類包括：天然雌激素、合成雌激素、植物雌激素、具有雌激素活性的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)。注：具有雌激素活性的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)：如殺蟲劑、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、洗滌劑、塑料添加劑、食品添加劑等，工業(yè)廢水和生活污水往往含有上述物質(zhì)。23（3）對(duì)繁殖的影響目前二十三頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)污染物對(duì)生長(zhǎng)和發(fā)育的影響可通過(guò)生長(zhǎng)指示器來(lái)測(cè)定生長(zhǎng)指示器（ScopeforGrowth）是反映生物機(jī)體能量獲取利用和代謝的綜合指標(biāo)。

P=A-(R+U)注：P——SFG；A——從食物獲得的能量；R——呼吸作用的能量損失；U——排泄作用的能量損失24（4）對(duì)生長(zhǎng)和發(fā)育的影響目前二十四頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)概念：種群（Population）是指在一定時(shí)空中同種個(gè)體的組合。污染物對(duì)種群的影響表現(xiàn)為：種群數(shù)量的密度改變結(jié)構(gòu)和性別比例的變化：年齡結(jié)構(gòu)、種群大小、性逆轉(zhuǎn)遺傳結(jié)構(gòu)的改變：在進(jìn)化過(guò)程中通過(guò)改變基因頻率以適應(yīng)環(huán)境的改變。競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的改變255.6.4污染物在種群和群落水平上的影響

（1）

對(duì)生物種群的影響目前二十五頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)基本概念群落（Community）優(yōu)勢(shì)種（DominantSpecies）優(yōu)勢(shì)度？？耐污種敏感種污染物對(duì)群落的影響表現(xiàn)在：群落組成和結(jié)構(gòu)改變對(duì)物種多樣性（SpeciesDiversity）的影響注：物種多樣性指群落中物種的數(shù)目（豐富度）和各個(gè)物種的相對(duì)密度（群落的異質(zhì)性）。26（2）對(duì)生物群落的影響目前二十六頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)聯(lián)合作用(CombinedEffect)的概念指兩種或兩種以上化學(xué)污染物共同作用所產(chǎn)生的綜合生物學(xué)效應(yīng)。聯(lián)合作用的類型：相加作用（AdditiveEffect）：污染物的總作用強(qiáng)度等于其各個(gè)成分單獨(dú)作用強(qiáng)度的總和。協(xié)同作用（SynergisticEffect）：污染物的總作用強(qiáng)度大于其各個(gè)成分單獨(dú)作用強(qiáng)度的總和。獨(dú)立作用（IndependentEffect）各污染物對(duì)機(jī)體的侵入途徑、方式、作用部位、產(chǎn)生毒作用的機(jī)理各不相同，因此產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)彼此無(wú)關(guān)。拮抗作用（AntagonisticEffect）：污染物的總作用強(qiáng)度小于其中任何一種成分的單獨(dú)作用強(qiáng)度。275.6.5化學(xué)污染物對(duì)生物的聯(lián)合作用目前二十七頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)細(xì)胞色素P450的研究進(jìn)展DNA加合物的形成與診斷研究進(jìn)展28（1）研究進(jìn)展細(xì)胞色素P450（cytochromeP450或CYP450,簡(jiǎn)稱CYP450）：一類以還原態(tài)與CO結(jié)合后在波長(zhǎng)450nm處有吸收峰的含血紅素的單鏈蛋白質(zhì)。目前二十八頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)固醇類生物合成、脂肪酸和類固醇激素等內(nèi)源性底物的氧化代謝；大部分藥物和外源物的生物氧化等；它使進(jìn)入機(jī)體的外源物經(jīng)代謝后向兩個(gè)方向發(fā)展：代謝解毒和代謝活化；代謝活化后的產(chǎn)物有較強(qiáng)的毒性,甚至產(chǎn)生致畸、致癌效應(yīng)。29（2）細(xì)胞色素P450參與的生化反應(yīng)與作用目前二十九頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)30（3）細(xì)胞色素P450的生化背景目前三十頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)31（4）細(xì)胞色素P450作用原理目前三十一頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)32反應(yīng)式目前三十二頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)據(jù)統(tǒng)計(jì),人類每年合成數(shù)以千計(jì)的新化合物并排放到環(huán)境之中,這些化合物許多具有遺傳毒性。如何對(duì)這些化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)是一項(xiàng)十分艱難而重要的工作。檢測(cè)周圍媒體(大氣、水、土壤等)中化合物含量水平來(lái)評(píng)價(jià)有毒物和人體健康之間的關(guān)系是不夠的,因?yàn)檫@種外劑量的評(píng)價(jià)方法只能給出生物體可能接受的大概劑量,而不能給出一定的信息來(lái)說(shuō)明生物體對(duì)毒物的吸收、代謝、生物效應(yīng)等的差異。隨著研究的深入,人們提出應(yīng)用大分子(蛋白質(zhì)、RNA、DNA)加合物來(lái)研究和評(píng)價(jià)具有遺傳毒性的化學(xué)物質(zhì)致癌風(fēng)險(xiǎn)性。它們不僅能反映化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物在組織或體液中的劑量,而且能夠提供實(shí)際到達(dá)的作用部位或與關(guān)鍵的細(xì)胞大分子反應(yīng)的確切劑量。其中DNA加合物由于意義重大而成為多學(xué)科如環(huán)境科學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域當(dāng)前的國(guó)際研究熱點(diǎn)。33（5）加合物的研究意義目前三十三頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)

DNA加合物的形成毒性機(jī)理形成過(guò)程

DNA加合物的診斷色譜-質(zhì)譜法

32P-后標(biāo)記法免疫學(xué)法34（6）DNA加合物的形成與診斷研究進(jìn)展目前三十四頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)DNA加合物就是親電性的化合物或其代謝產(chǎn)物和生物體內(nèi)大分子形成共價(jià)相連的化合物,是DNA化學(xué)損傷的最重要和最普遍的形式。這種加合物一旦逃避自身的修復(fù),就可能成為致突、致畸、致癌的最小因子,因此DNA加合物的形成被認(rèn)為是致腫瘤過(guò)程的一個(gè)重要起始階段。研究表明DNA加合物的形成與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展之間存在著因果聯(lián)系和劑量——反應(yīng)關(guān)系。35（7）DNA加合物與腫瘤目前三十五頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)DNA加合物的形成是遺傳毒性物質(zhì)導(dǎo)致生物體遺傳毒性的前提,含DNA加合物的DNA分子未能被修復(fù)或被細(xì)胞錯(cuò)誤地復(fù)制,將會(huì)導(dǎo)致一系列基因突變而產(chǎn)生遺傳毒性。大多數(shù)遺傳毒性化學(xué)物質(zhì)如PAHs在生物體內(nèi)一般首先經(jīng)過(guò)存在于許多生物組織中的混合功能細(xì)胞色素氧化酶P450的代謝。它們形成DNA加合物的途徑有2種：1)通過(guò)單電子氧化途徑;2)通過(guò)混合功能細(xì)胞色素氧化酶P450的激活?；衔镅趸緩交罨⑶疑舌堰始雍衔?大多數(shù)通過(guò)單電子氧化途徑形成的DNA加合物具有不穩(wěn)定的糖苷結(jié)構(gòu),能自動(dòng)地使嘌呤脫落而形成一無(wú)嘌呤位點(diǎn),這個(gè)位點(diǎn)被認(rèn)為DNA分子上的一個(gè)致突變損傷,同時(shí)這些無(wú)嘌呤位點(diǎn)也有可能是一些化合物致癌的主要原因。36（8）毒性機(jī)理目前三十六頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)

許多污染物是親電化合物,它們具有低電子密度中心,因此可以與具有高電子密度的分子(如具有親核中心的DNA分子或蛋白質(zhì)分子Y)反應(yīng),形成生物大分子加合物.大多數(shù)親電子劑(RX)的加合物形成機(jī)理是親核替代,親電子基團(tuán)通過(guò)親核原子(O、N、S等)的一對(duì)不共享的電子(∶或-與之形成一個(gè)新的共價(jià)鍵.如式(1)所示被替代基團(tuán)(X)。根據(jù)反應(yīng)物性質(zhì)的不同或被親核基團(tuán)(Y)中和或帶上了負(fù)電：37（9）形成過(guò)程目前三十七頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)（10）DNA加合物與致癌關(guān)系DNA加合物是化學(xué)致癌過(guò)程的一個(gè)早期、可檢測(cè)的重要步驟，通過(guò)DNA加合物與突變和致癌關(guān)系的研究，人們認(rèn)識(shí)到DNA加合物可能是化學(xué)致癌物與癌癥之間的一個(gè)分子橋梁。有可能用于腫瘤防治的早期生物監(jiān)測(cè)，對(duì)化學(xué)致癌機(jī)理的探討及腫瘤病因的研究具有重要意義，并可最終為腫瘤的預(yù)防和治療服務(wù)。38目前三十八頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)（11）DNA加合物的形成機(jī)制DNA呈雙鏈超螺旋結(jié)構(gòu)存在于細(xì)胞中,嘌呤和嘧啶堿基重于螺旋內(nèi)側(cè)。在DNA的4個(gè)堿基中,存在著N、O、P、等原子,這些原子都含有孤對(duì)電子,容易受到親電試劑的攻擊。研究表明,在DNA分子至少有12個(gè)位點(diǎn)易受到化學(xué)致癌劑的攻擊。對(duì)于大多數(shù)致癌物都是經(jīng)過(guò)代謝活化后變成親電的代謝物后,再與DNA發(fā)生共價(jià)結(jié)合的,但也有直接結(jié)合的化合物。39目前三十九頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)

目前最常用的診斷、檢測(cè)及定量分析加合物的方法,原理是根據(jù)復(fù)雜樣品中的各組分在流動(dòng)相和固相間具有不同的分配系數(shù),當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),各組分便在兩相中進(jìn)行溶解、吸附、脫附的多次反復(fù)分配,達(dá)到彼此分離的結(jié)果.這種色譜分離技術(shù)與適當(dāng)?shù)臋z測(cè)手段(如電化學(xué)檢測(cè)器等)相結(jié)合時(shí),就構(gòu)成了色譜分析法.當(dāng)前最成熟的聯(lián)用儀是色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀。該法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、用于檢測(cè)極微量加合物的存在及研究其形成機(jī)理。GC-MC和LC-MC在分析蛋白質(zhì)加合物中有重要作用.毛細(xì)管氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合分析是目前靈敏度最高的技術(shù)之一,目前已研制出毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),并被應(yīng)用于加合物的診斷、分離和檢測(cè)。40（12）色譜-質(zhì)譜法DNA加合物的診斷目前四十頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)聯(lián)合其它敏感的檢測(cè)法檢測(cè)DNA損傷已成為一種趨勢(shì)。如HPLC-32P后標(biāo)記方法是非常敏感的方法。氣/質(zhì)聯(lián)用法(GC/MS)雖然靈敏度稍低，但可以提供加合物準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)信息，這一點(diǎn)是其它方法不能比擬的。目前該方法多用于尿中排泄的DNA加合物的檢測(cè)，需水解DNA才能測(cè)定。其敏感性與熒光法相似。41（13）高效液相色譜法及氣/質(zhì)譜法目前四十一頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)Gupta于1982年就建立32P后標(biāo)記法(32P-PostlabelingAssay)來(lái)診斷、檢測(cè)生物體中形成的DNA加合物.一種非常靈敏的診斷方法,靈敏度為1個(gè)DNA加合物/1×109～1×1010核苷酸.該法的基本原理是,與外源性物質(zhì)形成加合物的單核甘酸,可抵制酸酶的降解,并被標(biāo)記上32P,從而通過(guò)放射性的定量分析診斷、檢測(cè)所形成的DNA加合物.此法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)能力強(qiáng)所需DNA的樣品量少,非常適合只能提供少量DNA的人體樣本(幾個(gè)微克)的檢測(cè),不需要事先制備加合物標(biāo)樣,用空白對(duì)照可以定量計(jì)算加合物含量,既可用于單一加合物的檢測(cè),也可用于復(fù)雜混合物的測(cè)定,及未知的內(nèi)源性親電性物質(zhì)所形成的加合物的測(cè)定,應(yīng)用范圍廣,可適用于檢測(cè)不同類型的化學(xué)污染物,如PAH、芳香胺、烷基化物、不飽和醛類以及活性氧、紫外線輻射等所引發(fā)的DNA加合物,尤其是可用于生態(tài)毒理學(xué)研究中生物樣品的加合物測(cè)定以及判斷化合物的生態(tài)毒性.其缺點(diǎn)是特異性較差,步驟比較多,穩(wěn)定性不易掌握,不同的實(shí)驗(yàn)室所測(cè)定的結(jié)果差別很大。在定量水平上存在局限性,因此有必要同其它檢測(cè)方法結(jié)合起來(lái)進(jìn)行應(yīng)用.42（14）32P-后標(biāo)記法

--為國(guó)際公認(rèn)的最有發(fā)展前途的方法DNA加合物的診斷目前四十二頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)Sabtella等于1988年創(chuàng)建了酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA),該方法用生物大分子加合物抗體(單克隆體或多克隆體)來(lái)診斷、檢測(cè)靶組織中的相應(yīng)加合物及其含量,可以在特異的組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位研究。其測(cè)定DNA加合物的靈敏度為1個(gè)DNA加合物/1×107～1×108核苷酸。該方法的基本原理為抗原抗體反應(yīng),通常需要結(jié)合其它的富集、分離及檢測(cè)加合物的方法來(lái)得出最佳測(cè)定效果。其優(yōu)點(diǎn)是費(fèi)用低,簡(jiǎn)便易行,無(wú)須接觸高水平的暴露量,適用于大量人群流行病學(xué)調(diào)查的研究。其缺點(diǎn)為所需樣本量大,抗體間存在交叉反應(yīng),對(duì)于非抗原性加合物和未知抗原的加合物不能進(jìn)行檢測(cè)。43（15）免疫學(xué)法DNA加合物的診斷目前四十三頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)基本原理是抗原與抗體的反應(yīng)。已發(fā)展的方法有競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫測(cè)定(RIA)；固相競(jìng)爭(zhēng)或非競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)；超敏酶促放射免疫測(cè)定(USERIA)等。其檢測(cè)限一般為1個(gè)加合物/1×107～1×108核苷酸,目前已有20多種單克隆多克隆抗體可供使用。免疫法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行,價(jià)廉,不需要酶解DNA鏈,用免疫沉淀技術(shù)可以將有加合物的DNA鏈和無(wú)加合物的DNA鏈分離，適用于大量人群流行病學(xué)調(diào)查的研究。其缺為點(diǎn)是抗體存在交叉反應(yīng),所需DNA量較大(25～60Lg)。另外對(duì)于非抗原性加合物和未知抗原加合物的檢測(cè)無(wú)能為力。44免疫學(xué)法目前四十四頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)熒光測(cè)定法的原理是通過(guò)某些化合物的加合物具有熒光特性而進(jìn)行定量,其靈敏度為1個(gè)加合物/106～108核苷酸,所需樣品量為100μg左右.

熒光法的優(yōu)點(diǎn)是不破壞生物大分子鏈,并可區(qū)分出加合物的不同立體異構(gòu)體及大分子鏈不同位點(diǎn)上的加合物.熒光法還可用于研究DNA加合物的形成或修復(fù)與時(shí)間之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系,但不適用于檢測(cè)發(fā)光的化合物.45（16）熒光測(cè)定法DNA加合物的診斷目前四十五頁(yè)\總數(shù)五十二頁(yè)\編于十六點(diǎn)原理是通過(guò)某些化合物(特別是多環(huán)芳烴)的DNA加合物具有熒光的特性來(lái)測(cè)定,其檢測(cè)限為1個(gè)加合物/106-8核苷酸,目前發(fā)展的技術(shù)有同步熒光色譜法,激發(fā)-發(fā)射熒光法,低溫激光法。熒光法的優(yōu)點(diǎn)是不破壞DNA鏈就可以測(cè)定,另外可以確定加合物的不同立體異構(gòu)體及DNA鏈上的不同位點(diǎn)上的加合物,也可以研究DNA加合物形成和切除與時(shí)間之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系。其缺點(diǎn)是所需D