研究生分子生物學(xué)2

研究生分子生物學(xué)演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)研究生分子生物學(xué)目前二頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)中心法則：遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再由RNA決定蛋白質(zhì)的合成，以及遺傳信息從DNA復(fù)制傳遞給DNA的規(guī)律。復(fù)制DNARNA蛋白質(zhì)（性狀）轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄表觀遺傳目前三頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)復(fù)制DNARNA蛋白質(zhì)（性狀）轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄主要的分子生物學(xué)調(diào)控水平：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控翻譯水平調(diào)控翻譯后水平調(diào)控表觀遺傳水平調(diào)控主要是針對(duì)核酸進(jìn)行操作主要是針對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行操作表觀遺傳目前四頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)一、核酸研究方法1.基因克隆方法cis-elementuntranslationalregion(UTR)exonintron5’UTR3’UTR真核生物mRNA3’非翻譯區(qū)(UTR)可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和翻譯水平，決定某一特定mRNA的命運(yùn)，是許多基因表達(dá)所必需的一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)。翻譯水平的調(diào)控是真核基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。近年來(lái)的研究表明，許多真核基因的翻譯依賴于RNA5’端非翻譯區(qū)(UTR)的結(jié)構(gòu)元件。目前五頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)134562gDNA134562134562ab134562134562cDNAcda,mutantcomplementation,overexpressionb,seldomlyusedc,overexpression,mutantcomplementation,especiallyindifferentspeciesd,proteinbiosynthesisinprokaryotesoreukaryotes,overexpression目前六頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)PrimerPremier5和Oligo6可以在下載，primer3的主頁(yè)位置在。引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)1.

引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，最好在18~24bp，太短或太長(zhǎng)會(huì)降低特異性，并且降低產(chǎn)量；2.引物的特異性，避免非特異擴(kuò)增；3.一對(duì)引物的Tm值不能相差太大；4.避免形成穩(wěn)定的引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。利用PCR方法克隆序列已知的基因是最簡(jiǎn)易的方法。設(shè)計(jì)引物的區(qū)段選擇；GC含量的確定；自由能的控制等模板？目前七頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)1.1.1脫氧核糖核酸（DNA）的提取1.1核酸的提取I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或胞膜－內(nèi)容物釋放

III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中目前八頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)

SDS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；

CTAB法組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）

NaClSDS終濃度10mM20mM0.4M2%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入目前九頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；（TE溶解的好處）NaCl

提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。目前十頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，加入1/10體積的5MNaAc，高鹽可溶解多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA。多酚的去除：加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌。目前十一頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)目前十二頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)主要方法有：CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法，SDS(十二烷基磺酸鈉)法，異硫氰酸胍法，LiCl沉淀法，TRIzol試劑法等。TRIzol的主要成分是苯酚，主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了異硫氰酸胍、8-羥基喹啉、β-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase。1.1.2核糖核酸（RNA）的提取目前十三頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)目前十四頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)chloroformRNAsolutionpellet目前十五頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)RNA質(zhì)量評(píng)價(jià)鹽離子殘留重要嗎？基因組的問(wèn)題？？目前十六頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)qRCR中：反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中：將影響逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，最后影響逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果目前十七頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)2.電泳檢測(cè)：應(yīng)該至少觀察到28S和18S兩條清晰的電泳條帶。且28S條帶的亮度約為18S亮度的兩倍。目前十八頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)改善RNA提取質(zhì)量的十大要點(diǎn)1.液氮瞬間冷凍樣品，減少內(nèi)源RNase對(duì)RNA的降解。2.使用正確的細(xì)胞或組織儲(chǔ)存條件

在樣品用液氮瞬間凍結(jié)之后，應(yīng)該儲(chǔ)存在-80度，千萬(wàn)不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍，也會(huì)導(dǎo)致RNA的降解和損失。3.徹底勻漿樣品

細(xì)胞或組織的徹底勻漿對(duì)RNA提取來(lái)說(shuō)，是一個(gè)很關(guān)鍵的步驟，它能夠防止RNA的損失和降解。4.在RNA提取之前預(yù)處理樣品裂解液

對(duì)于某些樣品（腦、脂肪、植物酚類和多糖等）來(lái)說(shuō)，在勻漿之后，RNA提取之前，還需要一些額外的處理步驟。目前十九頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)5.選擇合適的RNA提取方法。6.DNase處理

如果提取的RNA將用于RT-PCR，一定要用RNase-free的DNase處理RNA樣品以去除殘留的DNA污染。

7.減少環(huán)境RNase的污染

為了得到完整的、高品質(zhì)RNA，在整個(gè)RNA制備過(guò)程中，當(dāng)RNA離開(kāi)強(qiáng)蛋白變性劑（如裂解液或酚）的保護(hù)時(shí)，避免引入新的RNase污染就非常關(guān)鍵。由于RNase幾乎是無(wú)所不在，所以必須確保與RNA接觸的每一試劑或容器都是無(wú)RNase污染的。必須保證一直使用無(wú)RNase的吸頭、離心管和溶液，手套也應(yīng)經(jīng)常更換，提取RNA的環(huán)境應(yīng)干凈整潔，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)避免說(shuō)笑打鬧。目前二十頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)8.正確的沉淀：異丙醇：室溫；乙醇：-20度。若是低濃度的RNA，沉淀時(shí)加入共沉劑。9.重懸

許多RNA提取步驟的最后一步是溶解純化的RNA沉淀。理想的重懸溶液應(yīng)該滿足3點(diǎn)要求：無(wú)RNase污染、較低的pH值（pH6-7）、含有螯合劑，以保護(hù)RNA不受帶入的RNase的降解。

10.儲(chǔ)存

如果只是短期儲(chǔ)存，重懸的RNA應(yīng)放置于-20度；如果是長(zhǎng)期儲(chǔ)存的話，就應(yīng)該放置于-80度。盡管重懸于水或緩沖液中的RNA也可以儲(chǔ)存在-80度，但保存于醋酸銨/乙醇溶液中的RNA沉淀則更加穩(wěn)定。我們推薦將RNA溶液分裝在幾支管中。這會(huì)避免反復(fù)凍融損傷RNA，并預(yù)防偶然的RNase污染。

目前二十一頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)0.3mlabsoluteethanolRT,3min4℃,2000g,5min1.5mlisopropylalcoholRT,10min4℃,12000g,10minDNApelletproteinpelletPowerfulTRizol目前二十二頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)gDNA134562134562ab134562134562cDNAcdSequenceunknowngene?RACEandmap-basedclonning目前二十三頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)

核酸的定向改造重疊PCR（Overlap-PCR）的重要應(yīng)用解決問(wèn)題：定點(diǎn)突變片段的缺失或者添加片段連接PCR所獲得的片段的5’和3’端的序列完全取決于引物的性質(zhì)！e.g.引物中的酶切位點(diǎn)問(wèn)題；菌液PCR過(guò)程中的退火溫度；目前二十四頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)體外的定點(diǎn)突變（突變位點(diǎn)以星號(hào)表示）1.Tm值2.引物設(shè)計(jì)3.聚合酶的選擇目前二十五頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)基因的體外定點(diǎn)缺失目前二十六頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)基因的體外定點(diǎn)添加目前二十七頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)4.啟動(dòng)子的獲得與活性分析啟動(dòng)子：一段能被RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合，能正確有效的起始轉(zhuǎn)錄的一段DNA調(diào)控序列，一般位于基因5端上游區(qū)域。真核生物具有三種RNA聚合酶，而RNA聚合酶Ⅱ型啟動(dòng)子在真核生物中最為常見(jiàn)，也最為復(fù)雜。目前二十八頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)A.物種全基因組測(cè)序成功或者啟動(dòng)子被分離的基因

PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子（長(zhǎng)度？位置？）B.啟動(dòng)子未被分離的基因

a.Tail-PCRb.反向PCR4.1啟動(dòng)子的分離：目前二十九頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)a.TAIL-PCR:ThermalasymmetricinterlacedPCR熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授發(fā)明目前三十頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)目前三十一頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)簡(jiǎn)并引物，退火溫度低，結(jié)合能力強(qiáng)巢式引物，退火溫度高，配合使用富集靶片段能力強(qiáng)PCR過(guò)程退火溫度高低交錯(cuò)出現(xiàn)，形成超循環(huán)：既保證了簡(jiǎn)并引物的結(jié)合，又照顧了巢式引物的特異性。目前三十二頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)目前三十三頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)目前三十四頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)目前三十五頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)Tail-PCR電泳結(jié)果分析：由于巢式引物設(shè)計(jì)的原則是逐漸內(nèi)縮的，故第三輪PCR產(chǎn)物大小比第二輪產(chǎn)物大小稍小。測(cè)序第三輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，比對(duì)分析即可獲得部分啟動(dòng)子。目前三十六頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶反向PCR示意圖

用反向的引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。b.反向PCR關(guān)鍵：1.限制酶的選擇；2.連接酶的利用（強(qiáng)化自連接）目前三十七頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)4.2啟動(dòng)子的分析：4.2.1Reportergenemethod(報(bào)告基因法)promoterreporter作為報(bào)告基因的要求：1.表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中不存在，即無(wú)背景；2.其表達(dá)產(chǎn)物易于進(jìn)行定性定量測(cè)定。GUS

、GFP、LUC目前三十八頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)GUS(glucuronidase，β-葡萄糖苷酸酶)：

GUS基因由大腸桿菌E．coli菌株K12中uidA基因座編碼。該酶是一種外切水解酶，能催化多種β，D葡萄糖苷酸類物質(zhì)水解為D-葡萄糖醛酸和糖苷配基。由于在絕大多數(shù)動(dòng)植物的細(xì)胞內(nèi)不存在內(nèi)源的GUS活性，而且GUS基因表達(dá)產(chǎn)物具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、易于定量及定位分析、可以與其他蛋白質(zhì)基因融合等優(yōu)點(diǎn)，使得GUS基因成為近年來(lái)在動(dòng)植物基因工程研究中應(yīng)用最為廣泛的報(bào)道基因之一。用不同的β-葡萄糖苷類物質(zhì)作底物，發(fā)展了不同的分析GUS活性方法，如組織化學(xué)定位法、分光光度法、熒光法、聚丙烯酰胺凝膠原位分析法等。目前三十九頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)組織化學(xué)定位法GUS組織化學(xué)定位的酶作用底物是5-溴4-氯-3-吲哚葡萄糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolylglucuronide，簡(jiǎn)稱X-Gluc)。這一底物能夠在酶活性位點(diǎn)形成藍(lán)色沉淀物。GUS作用于X-Gluc的初始產(chǎn)物為無(wú)色的吲哚衍生物，經(jīng)過(guò)氧化二聚化作用形成不溶解的5，5’-二溴-4，4’-二氯的靛藍(lán)色物質(zhì)，使得具有GUS活性的部位呈現(xiàn)藍(lán)色。X-Gluc目前四十頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)GUS染色方法GUS染色液：0.1MPBS0.5mMK3[Fe(CN)6]0.5mMK4[Fe(CN)6]10mMEDTA0.1%(v/v)TritonX-10010%(v/v)MeOH0.1%(w/v)X-Gluc(v/v)(溶于DMSO中)1.材料90%丙酮中，冰浴15-20min；2.在不含X-gluc的染色液中漂洗3次，每次5min；3.加入GUS染色液，抽真空5-10min4.37℃，染色12-16h；5.70%EtOH脫色30min，absoluteEtOH脫色；6.觀察，拍照。169a目前四十一頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)

組織化學(xué)定位法能夠一目了然地觀察到GUS在植物具體的細(xì)胞和組織部位中的活性，這就為GUS基因用于研究基因在植物中表達(dá)的具體部位提供了很好的研究手段。由于GUS酶和產(chǎn)物非常穩(wěn)定，在植物中可以積累，而且通常GUS在翻譯后不會(huì)被修飾，因而不能真實(shí)地反映出GUS替代的那個(gè)蛋白質(zhì)在穩(wěn)定狀態(tài)下的豐度。組織化學(xué)定位方法是基因表達(dá)的定性檢測(cè)，不能夠定量檢測(cè)。目前四十二頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)GUS活性測(cè)定GUS熒光分析法分析時(shí)以4-甲基傘形酮酰-β-D-葡萄糖苷酸(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，簡(jiǎn)稱4-MUG)為底物，GUS酶催化其水解為4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone,簡(jiǎn)稱4-MU)及β-D-葡萄糖醛酸。4-MU分子中的羥基解離后在365nm的光激發(fā)下產(chǎn)生455nm的熒光。熒光分光光度計(jì)需依據(jù)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物4-MU繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。4-MUG4-MUGUS目前四十三頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)步驟：1.蛋白質(zhì)提?。?/p>

0.1-0.5g材料，液氮研磨，加入3X體積的提取液，研成勻漿；勻漿轉(zhuǎn)移入離心管中，4000g，離心10min，取上清。2.酶反應(yīng)：

100ul蛋白提取液加入900ul37℃預(yù)熱的GUS反應(yīng)液中，混勻立即取出100ul，加入到含有900ul反應(yīng)終止液(0.2M/LNaCO3)的離心管中，作為空白對(duì)照，反應(yīng)管37℃反應(yīng)15min后，取出100ul加入終止管中(900ul)，進(jìn)行熒光測(cè)定。蛋白質(zhì)提取液：50mMPBS10mMEDTA10mMβ-ME(BME)0.1%TritonX-1000.1%sarcosyl(肌氨酸)1mM/L4-MUGGUS反應(yīng)液目前四十四頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)3.蛋白質(zhì)含量測(cè)定：考馬斯亮藍(lán)G-250法或者利用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定。4.酶活力計(jì)算：

利用樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出15min內(nèi)生成的4-MU的量(nM或者uM)，從而計(jì)算出單位蛋白質(zhì)溶液中(mg)GUS活性。反應(yīng)時(shí)間生成的4-MU的量×GUS活性=蛋白質(zhì)含量×稀釋倍數(shù)目前四十五頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)1962年Shimomura等首先從多管水母中分離出一種分子量為20kD的蛋白。由于水母整體熒光及提取的蛋白質(zhì)顆粒熒光都呈綠色，因此，人們將這種蛋白命名綠色熒光蛋白。

GFP的發(fā)光中心是由Ser65-Tyr66-Gly67三個(gè)氨基酸殘基經(jīng)過(guò)環(huán)化、脫氫后形成的咪唑環(huán)。GFP這種堅(jiān)實(shí)的結(jié)構(gòu)保證了其穩(wěn)定和抗熱、抗變性的特點(diǎn)。GFP的真正的發(fā)光部位為咪唑環(huán)上的陰離子酚,Tyr66的脫質(zhì)子(酚鹽)和質(zhì)子化狀態(tài)(羥酚基)的轉(zhuǎn)換決定熒光發(fā)射。目前四十六頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)GFP在分子生物學(xué)上的應(yīng)用1

基因表達(dá)水平差異

GFP基因連接到目的基因的啟動(dòng)子之后，通過(guò)測(cè)定GFP的熒光強(qiáng)度就可以對(duì)該基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。目前，此方法無(wú)論在農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化中還是在活細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因胚胎和動(dòng)物中都已得到非常廣泛的應(yīng)用，特別是在活細(xì)胞基因表達(dá)的時(shí)空成像方面。

CK8℃，12h8℃，24hGhDREB1pro::GFP目前四十七頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)

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GFP作為融合標(biāo)簽

GFP最成功的一類應(yīng)用就是把GFP作為標(biāo)簽融合到主體蛋白中來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的定位、遷移以及分子間的相互作用;其表達(dá)產(chǎn)物既保持了外源蛋白的生物活性，又表現(xiàn)出與天然GFP相似的熒光特性。目前四十八頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)Luciferase(熒光素酶)熒光素酶是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，目前研究得最透徹的熒光素酶是來(lái)自Photinini族螢火蟲(chóng)中的北美螢火蟲(chóng)(Photinuspyralis)，其分子量為62KD，由551個(gè)氨基酸組成的單鏈特異蛋白質(zhì)(clonedin1985)。

luciferin目前四十九頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)熒光素+ATP熒光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+PPi

熒光素化腺苷酸+O2

氧熒光素+AMP+熒光

luciferin

自1986-1987年首次被當(dāng)作報(bào)告基因使用以來(lái)，熒光素酶基因已成為目前運(yùn)用最廣泛的報(bào)告基因之一。目前五十頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)LUC用途:1.組織表達(dá)模式研究Promoter::LUC2.誘導(dǎo)表達(dá)模式研究在正向遺傳學(xué)篩選突變體的過(guò)程中常用到LUC作為篩選的報(bào)告基因。目前五十一頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)1.熒光素酶易被蛋白酶降解，半衰期約為3h;2.發(fā)光反應(yīng)衰減迅速，將細(xì)胞裂解液加入反應(yīng)液后5S內(nèi)必須讀取吸光值；3.熒光素見(jiàn)光易氧化，已稀釋未用的熒光素應(yīng)丟棄。LUC檢測(cè)注意事項(xiàng)目前五十二頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)4.2.2啟動(dòng)子中的順式作用元件分析：

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)在啟動(dòng)子順式作用元件分析中有重要作用；但是并不是所用的預(yù)測(cè)都是準(zhǔn)確的，相應(yīng)順式作用元件的作用還應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前五十三頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)目前五十四頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)如何驗(yàn)證預(yù)測(cè)得到的順式作用元件真正的發(fā)揮作用？

缺失分析：對(duì)啟動(dòng)子中的關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行缺失，并進(jìn)行組合，從而分析不同組合之間的啟動(dòng)子活性的關(guān)系，以此來(lái)確定真正發(fā)揮作用的順式作用元件的方法。目前五十五頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）：Invitro這些順式作用元件是如何發(fā)揮作用的？

通過(guò)特定反式作用因子與對(duì)應(yīng)的順式作用元件相結(jié)合，調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的活性。怎樣驗(yàn)證反式作用因子與順式作用元件的結(jié)合？

酵母單雜交（Y1H）：Invitro染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）：Invivo目前五十六頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)酵母單雜交（Y1H）：Invitro1993年，由Wang和Reed等創(chuàng)立發(fā)展出的一種研究蛋白質(zhì)和DNA互相作用的實(shí)驗(yàn)體系。該體系也可用來(lái)釣取反式作用因子的目標(biāo)靶序列。目前五十七頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)靶序列整合到酵母基因組中目前五十八頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)FalsePositive目前五十九頁(yè)\總數(shù)六十五頁(yè)\編于二十二點(diǎn)ElectroMobilityShiftAssay

凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（gel-shiftexperiment）又叫凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（gelretardationassay）或DNA遷移率變動(dòng)分析（DNAmobilityshiftassay），它是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)，它具有簡(jiǎn)單、快捷等特點(diǎn)，也是當(dāng)前被選作檢