實(shí)驗(yàn)十四質(zhì)粒dna的制備2012lb

實(shí)驗(yàn)十四

堿裂解法制備Bcl-2重組質(zhì)粒DNA

細(xì)菌基因組DNA與質(zhì)粒DNA的比較細(xì)菌基因組DNA質(zhì)粒DNA

pH12.6

變性不完全變性pH調(diào)至中性不完全復(fù)性復(fù)性

離心沉淀上清

結(jié)構(gòu)

大的環(huán)狀dsDNA

局部松散結(jié)構(gòu)

小型環(huán)狀dsDNA

超螺旋結(jié)構(gòu)原理堿裂解法中溶液I、II、III的作用溶液I(細(xì)胞懸浮液)

50mmol/L葡萄糖

10mmol/LEDTA-Na225mmol/LTris-HCl(pH8.0)葡萄糖:增加溶液的粘度，懸浮細(xì)胞，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力而降解EDTA:螯合Mg2+、Ca2+，抑制DNase

溶液II(裂解液)

0.2mol/LNaOH1%SDSNaOH:裂解細(xì)胞使基因組DNA、質(zhì)粒DNA和細(xì)菌蛋白質(zhì)變性(pH12.6)SDS:陰離子表面活性劑溶解細(xì)胞膜的脂類和蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞膜與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白變性（為沉淀做鋪墊）

會(huì)抑制RNase，下一步需除去(臨用時(shí)1:1配制)3mol/LKAc2mol/LHAc溶液III(中和液)KAc-HAc緩沖液(pH4.8):

把抽提液調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性，并穩(wěn)定存在；鉀取代了SDS中的鈉后形成了不溶于水的十二烷基磺酸鉀(PDS)高鹽的KAc有利于變性的基因組DNA、PDS-蛋白質(zhì)-細(xì)胞壁復(fù)合物凝聚而沉淀沉淀基因組DNA和蛋白質(zhì)操作步驟（2人/組）1.取菌液1ml

，10000r/min，離心2min，棄上清，扣干溶液。2.加入溶液I100μl，渦旋混勻*，靜置5min。3.加入新鮮配制的溶液II200μl，顛倒混勻*，冰浴5min。4.加入溶液III150μl，顛倒混勻，冰浴5min。5.12000r/min，離心5min，吸取300μl上清轉(zhuǎn)移至另一1.5mlEP管中。6.加入2倍體積(600μl)無水乙醇，顛倒混勻，冰浴5min。12000r/min，離心5min，棄乙醇。7.加500μl70%乙醇洗沉淀，12000r/min離心5min，棄乙醇。室溫靜置5min。8.加入20μlTE緩沖液，待DNA沉淀溶解后，做好標(biāo)記保存于-20℃。注意事項(xiàng)

1.第1步棄上清時(shí)盡量使所有的液體流出。

2.溶液II要新鮮配制。3.加入溶液II時(shí)禁止渦旋振蕩，冰浴時(shí)間不能太長。4.DNA沉淀不要太干燥，否則難溶思考題

1.溶液II為何要新鮮配制，加入溶液II時(shí)為何不能渦旋振蕩，冰浴時(shí)間為何不能超過10min？

2.溶液II中高濃度的NaOH可使蛋白質(zhì)