第3章蛋白質的分離

第一節(jié)蛋白質分離純化概述

一、蛋白質分離純化的一般程序二、蛋白質純化方法分類

三、蛋白質分離純化中的注意事項

回總目錄1HubeiUniversity目前一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點一、蛋白質分離純化的一般程序2HubeiUniversity目前二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點對于任何一個特定的蛋白質，純化方案細節(jié)的確定都有賴于一系列的因素，，這些因素包括：1.正確選擇原材料和定位目的蛋白（胞內(nèi)或胞外）；2.目的蛋白的表達水平；3.蛋白質的理化性質；4.純化的目的。3HubeiUniversity目前三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點一、蛋白質分離純化的一般程序0.材料選取1.破碎生物組織，用緩沖液將蛋白質抽提出來；對于外泌型蛋白，省去破碎步驟2.用離心法將亞細胞成分及細胞碎片與溶液分開。3.應用鹽析法或有機溶劑法將蛋白質沉淀下來4.應用層析法或電泳法使各種蛋白質分開5.使蛋白質結晶或制成凍干粉

回第一節(jié)4HubeiUniversity目前四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點二、蛋白質純化方法分類沉淀法：利用一種蛋白質相對于其它蛋白質溶解度的不同來進行（同一溶劑）2.

相分配法：依據(jù)蛋白質在兩相間分配作用的不同來進行（不同溶劑）3.

柱層析法：利用蛋白質對固體載體的吸附性質不同，通過柱層析方式將它們分別洗脫下來。包括：親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等。4.電泳法及離心法：依據(jù)蛋白質在電場或離心場中運動速度的不同來進行。5HubeiUniversity目前五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■

各種純化或分析方法的原理：硫酸銨

沉淀分離細胞細胞器分離細胞質勻漿大分子核酸多醣(脂類)分子大小不同分子電荷不同分子極性不同親和力不同小分子細胞碎片Celldebris蛋白質氨基酸

單糖核酸

脂肪酸凝膠過濾,SDS,超濾,離心離子交換,等電聚焦反向層析,鹽析親和層析,羥基磷灰石6HubeiUniversity目前六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■

各種純化方法的應用次序：102030405123467沉淀離子交換親和層析凝膠過濾步驟次數(shù)勻漿回第一節(jié)7HubeiUniversity目前七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點三、蛋白質分離純化中的注意事項：

1.首先要建立一個方便靈敏的分析方法。2.要選擇一種最好的含有目的蛋白質的材料3.分離步驟要盡可能少4.盡量避免蛋白質在提純過程中的變性：包括六個方面8HubeiUniversity目前八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點盡量避免蛋白質在提純過程中的變性

▼分離過程快速，保持在低溫（4℃）下進行。▼盡量避免過度暴露于空氣中▼注意重金屬離子污染▼避免極端的pH及溫度對蛋白活性的影響▼維持較高的提取液濃度▲少數(shù)蛋白質需在高離子強度的極性介質中保持活性，需要向提取液中加入KCl、NaCl、(NH4)2SO4

等回第一節(jié)9HubeiUniversity目前九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點第二節(jié)材料的選擇與處理一、材料的選擇二、材料的處理三、細胞破碎方法四、初級純化五、膜蛋白的釋放

六、胞外酶的分離回總目錄10HubeiUniversity目前十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點一、材料的選擇

先考慮以下幾點： 5W

a.

要純化那一個蛋白？

What?

b.

為何要純化此蛋白？

Why?

c.

由何種材料純化？

Where,from?

d.

由那一個生長期？

When?

e.

如何純化此蛋白？

How?11HubeiUniversity目前十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■

目標材料的選擇：

何種生物來源？

動物、植物、微生物

何種組織？

根莖葉花果實種子或動物某器官

何種細胞器？

細胞核、液泡、葉綠體

細胞內(nèi)、外？

分離方法選擇

水溶性或脂溶性？

影響抽取策略的設計12HubeiUniversity目前十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點SP蛋白質表現(xiàn)(馬鈴薯各組織)SPRNA表現(xiàn)(馬鈴薯各組織)StPierre,B.;Bertrand,C.;Camirand,A.;Cappadocia,M.;Brisson,N.(1996)PlantMolecularBiology30:1087-1098Thestarchphosphorylasegeneissubjectedtodifferentmodesofregulationinstarch-containingtissuesofpotatoL:leaf（葉）P:petiole（葉柄）S:shoot（枝條）St:stem（樹干）T:tuber（塊莖）R:root（根）SP:

starchphosphorylase13HubeiUniversity目前十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點材料的選擇原則：

（1）材料中目的蛋白質含量要高（2）材料容易獲得?；氐诙?jié)14HubeiUniversity目前十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點二、材料的處理1.動物材料2.植物材料3.微生物材料回第二節(jié)15HubeiUniversity目前十五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點1.動物材料的處理最重要的是在接近動物正常生理狀態(tài)下取出組織和器官，把死亡后的變化控制在最小限度內(nèi)（腎移植）取材料后迅速處理，或立即置入液體氮中速凍，再轉置低溫(-10℃～-50℃)下保存?zhèn)溆?。返?6HubeiUniversity目前十六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點2.植物材料的處理

使用植物材料時，除了上述的注意事項外，還要注意：（1）

植物細胞壁比較堅厚，含有大量的纖維素，要采取有效的方法充分破碎（纖維素酶、研磨）。（2）

植物組織中含有大量多酚、丹寧、類黃酮等次生物質，在提取過程中會被氧化成褐色產(chǎn)物、干擾蛋白質的進一步純化，必須防止（加保護劑防止氧化，如：Vc、Bβ-mercaptoethanol；加沉淀劑使其沉淀，如PVP聚乙烯吡咯烷酮）。（3）植物細胞的液泡內(nèi)含物有可能改變抽提液的pH值（破碎細胞時會釋放出來），因此，對植物組織常使用較高濃度的緩沖液作為提取液。

17HubeiUniversity目前十七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■

植物色素的產(chǎn)生及去除：

Phenoliccompound

→→→

褐色色素

PolyphenoloxidaseBβ-mercaptoethanol低溫抑

制降低催化adsorb吸附Polyvinylpolypyrrolidone(PVPP)聚乙烯吡咯烷酮返回18HubeiUniversity目前十八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點3.微生物材料的處理微生物可大規(guī)模培養(yǎng)，原料來源一般不受限制通過基因工程技術，將基因轉化到微生物中，可以大量表達蛋白質，對稀有珍貴蛋白質的獲得有重要的實際意義。

返回19HubeiUniversity目前十九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點三、細胞破碎方法大多數(shù)蛋白質結合于細胞器上，將細胞破碎才能釋放破碎的方法有兩種分類法：從破碎細胞的原理上可分為化學法、物理法和機械法；從破碎細胞的力量及對細胞的傷害方面，可分為溫和的方法、劇烈的方法和較劇烈的方法20HubeiUniversity目前二十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點1機械破碎

手動或馬達驅動的勻漿器韋林氏搗切器研缽21HubeiUniversity目前二十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點2物理破碎

超聲探頭壓力差破碎機(N2CO23Mpa)(20kHz100-150W0-10oC3-10min)凍融破碎法22HubeiUniversity目前二十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點3.化學破碎法

有機溶劑處理

甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等表面活性劑處理非離子型:TritonTween

離子型表面活性劑破細胞效果雖好,但容易引起蛋白失活,因此通常不用。23HubeiUniversity目前二十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點4酶學破碎法

溶菌酶(專一作用于肽多糖-1,4糖苷鍵)革蘭氏陽性細菌 +溶菌酶革蘭氏陰性細菌 +溶菌酶酵母(胞壁主要為-1,3-葡聚糖) +-葡聚糖酶、蝸牛酶霉菌(胞壁含有幾丁質) 幾丁質酶植物細胞 纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶在一定的溫度、PH、離子強度等條件下,保溫一定時間讓細胞自溶。24HubeiUniversity目前二十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■

細胞打破之后：(1)

降低溫度(2)

盡快純化(3)

避免氧化(4)

避免吸附(5)

避免污染回第二節(jié)25HubeiUniversity目前二十五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點四、初級純化26HubeiUniversity目前二十六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點1.抽提(在一定條件下,用適當?shù)娜軇┨幚泶痔嵋?讓蛋白充分溶樣到溶劑中的過程)注意事項:溫度(0-10oC) PH(偏離酶蛋白pI)

抽提液的體積(3-5倍) 添加保護劑27HubeiUniversity目前二十七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點抽提蛋白質過程中所要注意的問題

球蛋白一般用一定鹽濃度的緩沖液進行抽提脂蛋白（油性）一般用稀釋的去垢劑（如SDS）或有機溶劑來抽提抽提植物中的蛋白質（尤其是酶）要特別注意提取液的pH和緩沖能力（因為液泡內(nèi)含物的釋放）防止酚類物質的氧化，干擾蛋白質的分離提純向提取buffer中加入抗氧化劑：巰基乙醇、Vc（抗壞血酸）、DTT（二硫蘇糖醇），易與氧化酶反應，阻止酚類和Cys的氧化；加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮），可以吸附醌類物質而沉淀，被離心除掉）28HubeiUniversity目前二十八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點5.提取緩沖液的體積一般V/G=2～5之間。不宜過大，會使得以后分離、純化、濃縮的流程時間增長，又增加損失率，6.抽提的原則是“少量多次”，即對于等量的溶液，分多次抽提比一次抽提好得多7.要防止蛋白水解酶的作用?？梢韵蛉芤褐屑尤攵惐姿幔―FP）或碘乙酸或苯甲基磺酰氟化物（PMSF）

29HubeiUniversity目前二十九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點原理：懸液中的各種粒子（細胞，細胞器及分子）有不同的質量（mass）或密度（density），因此在離心場中有不同沉降速率。

不同的蛋白質分子量差別很大，密度差別很?。ú怀^15%）。蛋白質的平均密度是1.37g/cm3。

結合蛋白密度差異較大。離心力由轉子中心到蛋白質界面的距離來決定。2.離心分離（centrifugation）目前三十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點

離心（centrifugation）

沉降系數(shù)（sedimentationconstant）：每單位離心場的速度（S）。與蛋白質的密度和形狀有關，也與介質的密度和粘度有關。離心可用于兩個方面：作為分離技術：從混合物中分離一種成分；作為分析技術：測定物質的物理性質，如分子量，密度，形狀及平衡結合常數(shù)（equilibriumbindingconstants）。目前三十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點

低速離心(<8000rpm或構對離心力(RCF)<1104g)

高速離心(1104-2.5104rpm或RCF=1104-105g)差速離心:采用不同的離心速度和離心時間,使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。類型32HubeiUniversity目前三十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點Recoverpellet33HubeiUniversity目前三十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點34HubeiUniversity目前三十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點

速率區(qū)帶離心

（rate-zonalcentrifugation）

用蔗糖、甘油或氯化銫形成密度梯度；高速離心機（~40,000r/min）；離心后，被分離的物質分布在相應的密度區(qū)帶內(nèi)；注意：控制時間。太短，達不到充分分離；太長，分離物沉淀到離心管底部。目前三十五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點

不能精確測定分子量，因為蛋白質的形狀差異也影響沉降率；一次分離多種不同類型聚合物或顆粒的最有效方法平衡密度梯度離心（equilibriumdensity-gradiententrifugation）：用于分離DNA和細胞器

速率區(qū)帶離心（rate-zonalcentrifugation）目前三十六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點3.過濾分離借助各種過濾介質將不同大小、不同形狀的物質分離開來的技術。常用介質:

濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷和各種高分子膜等。常用方法:

粗濾(2m)、微濾(0.2-2m)、超濾(20?-0.2m)、反滲透(<20?)和透析等?；氐诙?jié)37HubeiUniversity目前三十七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點五、膜蛋白的釋放

膜蛋白存在于細胞膜或有關細胞器（線粒體、葉綠體、內(nèi)質網(wǎng)或核等）的膜上。按其所在位置大體可分為外周蛋白和固有蛋白（膜內(nèi)蛋白）兩種類型

38HubeiUniversity目前三十八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■

細胞膜蛋白質抽取較困難：●

抽取膜蛋白時須添加

TritonX等表面活性劑極性非極性Buchananetal(2000)BiochemistryandMolecularBiologyofPlantsp.839HubeiUniversity目前三十九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點外周蛋白通過次級鍵和外膜脂質的極性頭部螫合在一起，可以用含乙二胺四乙酸（EDTA）的適當緩沖液將其抽提出來。外周蛋白被抽提后，膜一般仍保持完整的雙層結構。固有蛋白嵌合在雙層中。抽提固有蛋白時，既要削弱它與膜脂的疏水性結合，又要仍保持疏水基暴露在外的天然狀態(tài)，這個過程稱為增溶作用

40HubeiUniversity目前四十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點理想的增溶劑（去污劑）既有親水部分也有疏水部分，當濃度較高時能形成膠團，內(nèi)部為疏水核，外部為親水層。增溶時，膜蛋白疏水部分嵌入膠團的疏水核中而與膜脫離，同時保住了膜蛋白的疏水結構。被增溶出來的膜蛋白通過透析等方法除掉去污劑，再進一步純化。41HubeiUniversity目前四十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點用于增溶過程中的去污劑按結構可分為四種：陰離子去污劑（脫氧膽酸鹽）陽離子去污劑（溴化十二烷基三甲銨）兩性離子去污劑（二甲基十二烷基甘氨酸）非離子型去污劑（TritonX－100、辛基葡萄糖苷）。近年，非離子型去污劑辛基葡萄糖苷應用廣泛，因為它的臨界膠團濃度高（達25mmol／L），同時易于透析，也有利于膜蛋白的重組。

42HubeiUniversity目前四十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點幾種去污劑去污劑包括兩類：

非離子型（nonionicdetergents）如TritonX-100、辛基葡萄糖

離子型（ionicdetergents）如脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸納目前四十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點低濃度時，去污劑以游離形式存在于溶液中。隨著濃度的增加，它們聚合在一起，形成微團（micelles）.微團很小、圓球狀聚集物。其親水部分向外，疏水部分向內(nèi)。

臨界微團濃度（criticalmicelleconcentration，CMC）：去污劑開始形成微團時的濃度，為去污劑的特征常數(shù)目前四十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點離子型去污劑除了能與膜蛋白的疏水區(qū)結合外，還能結合水溶性蛋白質的疏水核心。由于它們帶電，所以能夠破壞蛋白質中的鹽鍵和氫鍵,使蛋白質變性。非離子型去污劑在不同的濃度有不同的作用方式濃度較高（>CMC）時，與磷脂、膜蛋白一起形成微團.

濃度較低（<CMC）時，雖然不形成微團，但仍能與大部分膜蛋白的疏水區(qū)結合，起增溶作用.目前四十五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點大部分膜周邊蛋白（peripheralprotein）通過離子鍵或其他弱鍵與特定的膜蛋白結合，因此可用高濃度的鹽或能與二價陽離子（如Ca2+）結合的試劑進行分離。目前四十六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點釋放膜蛋白還有其它的方法，如：（l）用磷酸脂酶A消化；（2）在高pH和高溫下進行超聲作用；（3）在低溫（－20℃）下，用丙酮抽提，所得干粉可長期貯存。這是一種經(jīng)典的現(xiàn)在仍在使用的方法回第二節(jié)47HubeiUniversity目前四十七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點六胞外酶的分離

◆胞外酶是在微生物發(fā)酵時分泌到發(fā)酵液中的可通過離心或過濾將菌體除去、上清液經(jīng)濃縮（超濾法）再進一步純化。回第二節(jié)48HubeiUniversity目前四十八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點第三節(jié)蛋白質的初步提純（粗分級）一、去除核酸二、沉淀法去除雜蛋白三、蛋白質的脫鹽和濃縮

回總目錄49HubeiUniversity目前四十九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點一、去除核酸核酸沉淀劑法：常用的核酸沉淀劑有：MnCl2

、硫酸魚精蛋白、鏈霉素等。核糖核酸酶或脫氧核糖核酸酶的應用：

一般將酶與抽提液一起（4℃）培養(yǎng)30–60分鐘，就可以把DNA或RNA降解成足夠小的碎片，而不影響蛋白質的分離?；氐谌?jié)50HubeiUniversity目前五十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點二雜蛋白的去除

主要方法：1.鹽析法2.有機溶劑沉淀法(甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇等)

3.有機聚合物沉淀法(單寧、聚丙烯酸等)

4.選擇性變性沉淀法5.等電點沉淀法

回第三節(jié)原理：（1）破壞蛋白質分子的水合作用，降低蛋白質在水溶液中的溶解度，而使其沉淀；（2）降低蛋白質分子之間的同性相斥的作用，也能降低蛋白質的溶解度，而使其易于沉淀51HubeiUniversity目前五十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點1.鹽析法1）鹽溶與鹽析2）鹽析法沉淀蛋白質的具體操作3）改良的硫銨分級法4）鹽析法的優(yōu)缺點5）鹽析法操作過程中的注意事項回到二52HubeiUniversity目前五十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點1）鹽溶與鹽析

鹽溶就是加入中性鹽后蛋白質的溶解度增大鹽析就是加入中性鹽后蛋白質的溶解度降低，而產(chǎn)生沉淀析出鹽析法常用硫酸銨。因為：（1）硫酸銨在水中穩(wěn)定，溶解度也大，在25℃，能得到4.1M（約55%）的濃度。（2）硫酸銨是十分溫和的試劑，高濃度的硫酸銨也不會引起蛋白質變性。

53HubeiUniversity目前五十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點鹽析時蛋白質的溶解度會隨著硫酸銨的濃度從0增加而增加，即所謂的“鹽溶現(xiàn)象”當硫酸銨的濃度繼續(xù)增加，蛋白質就開始變得不溶而沉淀下來，即所謂的“鹽析效應”。

54HubeiUniversity目前五十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點Saltingin■

提高鹽濃度會增加蛋白質的溶解度：0.001M0.005M0.01M0.02M[NaCl]pIpH>5.2pH=pH0.0010.010.1NaClconcentration(M)溶解度55HubeiUniversity目前五十五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點+

=

-+

=

-■

鹽溶

Salting-in：Ionicstrength溶解度+-NaClNaClKCl-+++++------+++++-------------------------++++++++++++++++++++-+++++------+++++-----分子在其等電點時，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入鹽離子后，鹽離子吸附于蛋白分子表面，使得蛋白分子與水分子的作用增強且蛋白分子帶相同電荷而互斥，溶解度增大。56HubeiUniversity目前五十六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點Aggregate蛋白質分子表面有水化層，當加入鹽時，這些水分子被抽出，與鹽離子進行水合，破壞了蛋白分子表面的水化層，暴露出來的疏水性區(qū)域互相結合，形成沉淀?！?/p>

鹽析

Salting-out：Ionicstrength溶解度+-+++-----+AmmoniumsulfateSodiumsulfateAlittlesalting-ineffectNH4+SO42-=hydrophobic57HubeiUniversity目前五十七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點由于各種蛋白質表面的極性基團和帶電數(shù)目的不同，在蛋白質表面的分布也不同，所以溶解度小者先沉淀，溶解度大者后沉淀。利用硫酸銨分級蛋白質就是這個道理。

硫酸銨濃度與蛋白質溶解度的一般關系返回58HubeiUniversity目前五十八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點2）鹽析法沉淀蛋白質的具體操作先要取少量樣品做試驗，以確定沉淀我們所需要的蛋白質的硫酸銨的濃度范圍，實際就是繪制硫酸銨沉淀蛋白質圖。

步驟▼取少量預冷樣品，攪拌下加入固體硫酸銨粉末（或完全飽和的硫酸銨溶液），直到可以看到蛋白質沉淀為止，計算此時的硫酸銨飽和濃度▼離心分離蛋白質，分析上清液，以確定目的蛋白是否存在于上清液中▼如果它不在溶液中，我們就可以明確目的蛋白質存在于沉淀中，就可以初步得到我們所需要的目的蛋白質，如果它仍然存在于上清液中，則棄掉沉淀，繼續(xù)加硫酸銨于上清液中，直到產(chǎn)生蛋白質沉淀為止?再次計算硫酸銨飽和濃度，離心分離蛋白質，分析上清液……

59HubeiUniversity目前五十九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點硫酸銨沉淀蛋白質圖

返回60HubeiUniversity目前六十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點3）改良的硫銨分級法①首先測定提取液中蛋白質總量和目的蛋白的含量。（假定目的蛋白是一個酶，則可以通過測定它的活性作為鑒定它的標準）②分級實驗實驗分三個階段，即三次第一次實驗：尋找沉淀目的蛋白（酶蛋白）的硫銨濃度范圍。第二次實驗：進一步尋找目的蛋白（酶蛋白）得率高的鹽析濃度范圍，同時考慮去雜蛋白的濃度范圍。第三次實驗：尋找目的蛋白含量高的鹽析濃度范圍，同時考慮純化系數(shù)

③分離蛋白質61HubeiUniversity目前六十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點

第一次實驗：

尋找沉淀目的蛋白（酶蛋白）的硫銨濃度范圍結論：40-80%得率較理想硫銨百分飽和度（%）沉淀酶%(得率、回收率)沉淀蛋白（%）純化系數(shù)25-40425＜140-6062222.860-803232180%以上215＜162HubeiUniversity目前六十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點

第二次實驗：

進一步尋找目的蛋白（酶蛋白）得率高的鹽析濃度范圍，同時考慮去雜蛋白的濃度范圍。

結論：50-70%飽和度范圍，酶的回收率很高（90%），但純化系數(shù)不理想（2.4）；而第一次實驗結果表明：40-60%的純化系數(shù)是比較理想的，所以設計第三次實驗提高純化系數(shù)。

硫銨百分飽和度（%）沉淀酶%(得率、回收率)沉淀蛋白（%）純化系數(shù)25-50632＜150-7090382.470%以上424＜163HubeiUniversity目前六十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點

第三次實驗：

尋找目的蛋白含量高的鹽析濃度范圍，同時考慮純化系數(shù)

結論：選擇沉淀酶的硫銨飽和度范圍為55-65%硫銨百分飽和度（%）沉淀酶%(得率、回收率)沉淀蛋白（%）純化系數(shù)25-551035＜155-657525365%以上1534＜164HubeiUniversity目前六十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點上述的實驗▼先用50%飽和度的硫銨沉淀雜質，離心除掉▼用65%的硫銨沉淀酶，收集沉淀▼將沉淀重新懸浮于55%的硫銨溶液中，此時雜蛋白溶解，酶仍是沉淀●收集沉淀

65HubeiUniversity目前六十五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點硫酸銨沉淀法分離蛋白質改良的方法：反抽提法原理：先沉淀較多的蛋白質，然后用適當?shù)牧蜾@溶液抽提沉淀，去除雜蛋白，而目標蛋白仍是沉淀。蛋白質很容易從溶液中析出。但過程沒有特異性。從沉淀的形式溶解下來卻比較特異，在一定飽和度的硫銨溶液中，只有那些可以溶解的蛋白質才會溶解出來這也正是反抽提法的優(yōu)點。66HubeiUniversity目前六十六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點4）鹽析法的優(yōu)缺點優(yōu)點：

A.

操作簡便，中性鹽對易變性的蛋白質有一定的保護作用，使用范圍廣泛

B.

鹽析時，能除去較多的雜質，一般在70%以上，所以純化程度較高

C.

有濃縮蛋白質溶液的作用，有利于進一步的純化缺點：

A.

分辨能力差

B.純化系數(shù)低返回67HubeiUniversity目前六十七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點5）鹽析法操作過程中的注意事項▼要有一個特異的分析方法▼加入硫銨的速度很重要（太快，局部變性；太慢，時間長，也會變性）▼硫銨濃度通常用硫銨飽和溶液（25℃時為4.1M）的百分數(shù)表示▼硫銨溶液pH5.5左右，若目的蛋白質易于酸變性，不易用此法●樣品的濃度過大，必須稀釋，一般在2.5-3.0%之間比較合適返回68HubeiUniversity目前六十八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點2.有機溶劑沉淀法1）原理2）選用有機溶劑的原則3）有機溶劑沉淀法的注意事項

回到二69HubeiUniversity目前六十九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點1）原理有機溶劑會使溶液的介電常數(shù)減小，從而增強偶極離子之間的靜電引力，使蛋白分子集聚沉淀。有機溶劑如是水溶性的，本身的水合作用會破壞蛋白質表面的水合層，也促使蛋白質分子脫水而沉淀。

70HubeiUniversity目前七十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點降低水活性，使溶液的介電常數(shù)下降，增加蛋白質溶質分子之間的作用力，因而聚集在一起。Membraneprotein■

有機溶劑沉淀法：Water-solubleprotein溶解度Water-solubleprotein-+++++------+++++-----------++++++++++-+-+++++----+++++------+++++-----有機溶劑Solvent%=hydrophilic返回71HubeiUniversity目前七十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點2）選用有機溶劑的原則

（1）必須能與水完全混溶；（2）不與蛋白質發(fā)生反應；（3）要有較好的沉淀效應；（4）溶劑蒸氣無毒，且不易燃。（沉淀之后，有機溶劑需要蒸發(fā)或揮發(fā)掉）目前丙酮和乙醇是應用得最為廣泛的有機溶劑。返回72HubeiUniversity目前七十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點3）有機溶劑沉淀法的注意事項▼低溫（0℃±l℃）下進行▼0.05mol/L以下的稀鹽溶液▼按蛋白質的等電點來調(diào)節(jié)pH值，有利于它們的分離。●選擇恰當?shù)牡鞍踪|濃度

返回73HubeiUniversity目前七十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點3.有機聚合物沉淀法▼水溶性的中性高聚物▼原理與有機溶劑沉淀法類似▼應用最廣泛的是分子量6000和20000的聚乙二醇（PEG）。●最大問題是PEG很難從蛋白質分級物中除去。回到二74HubeiUniversity目前七十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點4.選擇性變性沉淀法有些蛋白質能忍受極端環(huán)境條件（如高熱或低溫、高pH或低pH等）。將混合物暴露于極端條件下，不想要的蛋白質變性沉淀出來，使目的蛋白質得到純化變性方法：熱、pH和有機溶劑變性

回到二75HubeiUniversity目前七十五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點三蛋白質的脫鹽和濃縮

1.脫鹽

1）透析法脫鹽

2）纖維過濾透析法2.濃縮回第三節(jié)76HubeiUniversity目前七十六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點1）透析法脫鹽

將蛋白質放入透析袋中將此袋放入水中，或低離子強度的buffer中無機鹽類和小分子的代謝產(chǎn)物（如ATP、輔酶等），由于擴散作用而通過半透膜被除去。77HubeiUniversity目前七十七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點每次5個小時或更長時間不停攪拌buffer或水溶液。如一次不能達到要求，可換新buffer繼續(xù)透析，達到要求為止。78HubeiUniversity目前七十八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點新透析袋常被重金屬、蛋白水解酶等污染，需處理。處理的辦法：將透析袋放入0.5mol/LEDTA溶液中煮幾次煮后要用干凈的鑷子和醫(yī)用橡膠手套來拿。返回79HubeiUniversity目前七十九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點2）纖維過濾透析法

對非常大量的樣品，可以采用纖維過濾透析法用泵使蛋白質溶液不斷流經(jīng)超濾膜制成的空心管，管置于透析緩沖液中，用另一泵讓緩沖液不斷在管外流動。這樣，由于透析的有效表面積大增，使透析時間大為縮短因中空纖維超濾膜價格昂貴，分離稀有貴重蛋白時用。

返回80HubeiUniversity目前八十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點2.濃縮1）沉淀法：用鹽析法或有機溶劑將蛋白質沉淀，再將沉淀溶解在小體積溶液中2）離子交換法：使蛋白質溶液吸附到離子交換劑上，然后用少量鹽溶液洗脫下來81HubeiUniversity目前八十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點向蛋白質溶液中加入固體SephadexG－25等吸水劑，它就會吸去水及一些小分子物質吸濾，樣品全部留在濾液中重復數(shù)次，在很短的時間里就能將蛋白質濃縮到理想的體積范圍。3）干膠吸附法82HubeiUniversity目前八十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點將蛋白質溶液放入半透膜中，置入一個密閉體系半透膜內(nèi)的溶液通過管子與大氣相通對密閉系統(tǒng)慢慢減壓，抽真空，那么水和無機鹽等小分子就會流向膜外，蛋白質即被很快濃縮，如圖

至5）4）滲透濃縮法83HubeiUniversity目前八十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點懸掛的透析袋通大氣、袋外抽空減壓回上一級

蛋白質溶液的超濾84HubeiUniversity目前八十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點向密閉容器中充入N2，加壓）方便、迅速、溫和、處理樣品量可大可小（從2～3mL到幾百升）改進的管道式超濾器（以循環(huán)管道代替密閉容器），樣品液可以在管道中循環(huán)流動

回到三5）超濾濃縮法85HubeiUniversity目前八十五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點蛋白質溶液的超濾（超濾器）回上頁將超濾膜放在一個密閉容器的底部，而樣品液放入密閉容器中，在超濾膜的上面，然后向密閉容器中充入N2，加壓，這樣，水分和一些低分子量的物質就通過超濾膜而流出來，而蛋白質則留在容器中，通常向密閉系統(tǒng)中加入的壓力大約3–5萬Pa。為防止大分子物質堵住膜的孔隙影響流速，常在超濾器的下面裝有攪拌裝置，其中攪拌子懸掛在溶液中，緊靠膜的表面，但又不能和膜接觸，防止破壞膜。86HubeiUniversity目前八十六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點第四節(jié)蛋白質的進一步提純（細分級）

回總目錄蛋白質的層析分離（一）離子交換層析（二）凝膠過濾層析（三）分配層析（四）親和層析（五）聚焦層析87HubeiUniversity目前八十七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點層析（chromatography）

原理：溶液中的分子能與固體表面進行結合及解離，但由于蛋白質在分子量、帶電性和結合特異性方面的差異，與固體表面結合與解離的難易程度不一樣，所以流動的速度也不一樣。固定相由圓球形小珠密堆積而成。這些小珠的性質決定了可以分離哪種成分流動相固定相目前八十八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點（一）離子交換層析1、基本原理2、層析條件的選擇3、技術要點4、離子交換劑的處理和再生5、管柱填裝及管柱系統(tǒng)回第四節(jié)89HubeiUniversity目前八十九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點離子交換層析（ion-exchangechromatography）

分離所帶電荷不同的物質，離子交換的支持物稱為離子交換劑。

離子交換劑：離子交換樹脂（anionexchangeresin）和離子交換纖維素（cationexchangeresin）,如DEAE-cellulose和CM-cellulose。不同的蛋白質與交換劑有不同的親和力，因而可用不同鹽濃濃度或pH值的buffer洗脫洗脫示意圖結合洗脫曲線目前九十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點1、基本原理：依據(jù)不同蛋白質所帶電荷量的不同來進行分離的A.樣品分子取代平衡離子結合于交換劑上B．洗脫液離子取代樣品分子下一91HubeiUniversity目前九十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點將解離基團引入到惰性支持物上形成離子交換層析中的固定相。如果解離基團（帶電配體）帶負電，則能結合陽離子，稱為陽離子交換劑；如果解離基團帶正電，則能結合陰離子，稱為陰離子交換劑（如上圖所示離子交換劑）。當pH>pI時，蛋白分子帶負電，可結合于陰離子交換劑上；當pH<pI時，蛋白分子帶正電，可結合于陽離子交換劑上。92HubeiUniversity目前九十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點電荷密度越大，結合越牢，在柱中移動速度越慢，從柱中被洗脫掉的速度就慢。不同的蛋白所帶電荷不同，對離子交換劑的結合力就有差異，提供了分離蛋白質混合物的可能性；混合物中的各蛋白分子差異大，易分離；差異小，難分離；沒有差異就不能分離。最根本原理就是依據(jù)不同蛋白質所帶電荷量的不同來進行的93HubeiUniversity目前九十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■陰離子交換法

AnionExchange：載體++++++++++++++++樣本分子流動相固定相陽離子基團Counterion陰離子+94HubeiUniversity目前九十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■離子取代優(yōu)先順序PeckingOrder：++++++++++++++++++>>電荷高者離子大者濃度大者>95HubeiUniversity目前九十五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點離子交換層析（ion-exchangechromatography）目前九十六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■不同膠體的吸著容量有很大差異：DEAE-SephadexA-25DEAE-SephadexA-50DEAE-SepharoseCL-6BDEAE-Sephacel乳白蛋白清蛋白鐵蛋白1911045383110211586214.38.6Buffer:0.01MTris-HCl,pH8.0mg/mLgel97HubeiUniversity目前九十七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點采用鹽梯度或pH梯度進行洗脫。鹽濃度從低到高對應洗下來的就是帶電量從少到多的蛋白質。對帶正電蛋白質的洗脫而言，pH梯度要從低到高，對帶負電蛋白質的洗脫而言，pH梯度要從高到低pH向等電點方向變化，削弱蛋白質與交換劑的結合能力。當pH達到某種分子的等電點（pI）時，該分子失去電荷，而從交換劑上被洗脫下來。洗脫98HubeiUniversity目前九十八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■離子交換的梯度溶離有濃縮效果：SaltgradientelutionbeginsSampleapplied99HubeiUniversity目前九十九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點2、層析條件的選擇

（1）交換劑顆粒大小的選擇（2）層析緩沖液的選擇返回100HubeiUniversity目前一百頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點（1）交換劑顆粒大小的選擇粒子大小主要影響分辨率和流速。粗粒子分辨率低，單位體積的交換容量小，但流速較快。細粒子分辨力高、交換容量大，但是流速慢。細粒子適于裝小柱，直徑1mm的柱也可以?；氐?101HubeiUniversity目前一百零一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點（2）層析緩沖液的選擇為避免緩沖液離子參與離子交換過程，它所帶的電荷應與離子交換劑所帶電荷相同。使用陽離子交換劑時，要用陰離子型緩沖液（磷酸、醋酸等）；使用陰離子交換劑時要用陽離子型緩沖液（Tris、胺鹽、吡啶等）。102HubeiUniversity目前一百零二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點3、技術要點★柱床體積至少要比樣品的大2～5倍★樣品應與起始緩沖液具有相同的pH和離子強度★洗脫速度太快或太慢都會降低柱的分辨率▲部分收集器每管收集樣品的量，關系到能否充分表達層析柱的分辨率

返回103HubeiUniversity目前一百零三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點4、離子交換劑的處理和再生

返回預處理:dH2O

浸泡2hrsdH2O

洗2MHCl(4V)4hrs2MNaOH(4V)4hrsdH2O

至中性再生:dH2O

洗2MNaCl(2V)

水洗2MHCl(4V)

水洗2MNaOH(4V)

水洗dH2O

至中性104HubeiUniversity目前一百零四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■膠柱的裝填方法：緩沖液平衡溫度平衡靜置膠體清洗膠體預估體積裝填膠體暫停流洗X繼續(xù)流洗加上

reservoir已堆積沉積中上清加壓流洗加上

adaptor緊密堆積檢查好管柱是否暢通12GelGel5、管柱填裝及管柱系統(tǒng)

105HubeiUniversity目前一百零五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■液相層析管柱系統(tǒng)：緩沖液梯度制造器泵記錄器監(jiān)視器管柱膠體分部收集器(1)(2)(3)(4)(5)adapter轉接器106HubeiUniversity目前一百零六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點（二）凝膠過濾層析

凝膠層析又稱凝膠滲透層析、排阻層析，分子篩層析等。它主要用于分離分子大小不同的的樣品。凝膠層析設備簡單，操作簡便，每次層析后無需再生處理，因此在生化研究中應用極其廣泛?；氐谒墓?jié)1、基本原理2、凝膠層析的介質3、凝膠過濾的操作及應用107HubeiUniversity目前一百零七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點1、基本原理凝膠層析載體是多孔凝膠。當溶質通過層析柱時，分子直徑比凝膠孔徑大的分子，不能進入凝膠顆粒的微孔里，只能隨溶劑一起移動的，最先流出柱外；分子直徑比凝膠孔徑小的分子，即進入凝膠相內(nèi)，延長了路徑，向下移動的速度落后于大分子。這種情況如下圖所示。

108HubeiUniversity目前一百零八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■裝于柱中的凝膠支持物及某些層析參數(shù)示意圖

樣本固定相流動相小分子被延滯小分子大分子依據(jù)分子大小、形狀較快流出返回109HubeiUniversity目前一百零九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點2、凝膠層析的介質

對凝膠層析支持物的要求是：第一：要有惰性，即凝膠介質與溶質不發(fā)生任何作用；第二：離子基團含量要低，即所帶電荷要盡可能低；第三：凝膠顆粒的孔度和大小要均一；第四：凝膠顆粒和孔度大小的選擇范圍要寬，能適應各種不同大小的分子的分離；第五：機械強度要高?，F(xiàn)在有3種介質在不同程度上滿足這些要求。返回110HubeiUniversity目前一百一十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點膠體的種類:

葡聚糖凝膠用1,2-環(huán)氧氯丙烷作交聯(lián)劑,將由葡萄糖經(jīng)-1,6糖苷鍵結合而成的線性葡聚糖聚合成高分子聚合物。商品名為Sephadex(G-10200共8種)

瓊脂糖凝膠

由D-半乳糖和3,6-脫水L-半乳糖相間結合形成的多糖,是將瓊脂中的瓊脂膠除去而得到的。商品名為Sepharose(2B、4B和6B)。

聚丙烯酰胺凝膠丙烯酰胺經(jīng)交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的高分子聚合物。商品名為Bio-gel(P2-300)111HubeiUniversity目前一百一十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■各種層析膠體：PharmaciaBio-RadSephadexSepharoseSephacrylSephacelBioGelPBioGelAglucose(dextrose)agaroseglucose+acrylamidecelluloseacrylamideagaroseFPLCSuperose,SuperdexMonoQ,MonoS112HubeiUniversity目前一百一十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■膠體的構成：Sephadexglucoseunit過濾空間113HubeiUniversity目前一百一十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■膠體的使用范圍：

SephadexG：●

分子量由數(shù)萬至數(shù)十萬膠體容易被壓扁1g→20mLgel1g→7.5mL(骨架較稀)Smallproteins114HubeiUniversity目前一百一十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■膠體過濾法的膠球：115HubeiUniversity目前一百一十五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■管柱內(nèi)膠體的組成區(qū)間：VtVoVt-

Vo管柱總體積膠體外體積膠體內(nèi)體積流動相固定相116HubeiUniversity目前一百一十六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點

凝膠上柱后，顆粒外的外水體積（Vo），顆粒內(nèi)體積稱內(nèi)水體積（Vi），顆粒中膠的體積（Vg），因而，總的柱床體積（Vt），Vt=Vo+Vi+Vg，Vg可忽略。Vt=Vo+Vi

。

當進行洗脫時，某一溶質的洗脫體積（Ve）就取決于Vo，Vi和在兩相中的分配系數(shù)（kd）

Ve=Vo+kd·Vi

目前一百一十七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點①當kd=0時，Ve=Vo，溶質全從Vo

出來，無分配。②當kd=1時，Ve=Vo+Vi，溶質全進篩子，各物質盡管有分配，但各物質不能分開。③當0<kd<1時,Ve=Vo+kd·Vi各溶質具不同分配，以得到分離。

若已知某一物質的kd，可據(jù)上式計算它的洗脫體積（Ve）也可用溶質洗脫峰處的洗脫體積來測量。用此法來分離介質是以下述三種形式來描述的：目前一百一十八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■凝膠過濾的溶離圖譜：XYZEEnzymeactivityNaClVo之前不應有物質溶離出來Vt之后不應有物質溶離出來目標酶

(E)最好不要落在主要蛋白質峰(Y)的范圍內(nèi)ElutionVolume(mL)AVoVeVt0119HubeiUniversity目前一百一十九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■膠體粒子的粗細會影響溶離液的流動：膠體的顆粒越小其解析力越大

但流速變慢120HubeiUniversity目前一百二十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■層析管柱的形狀：10cm230cm10cm30cm2300cm3矮胖型細長型●

矮胖型管柱不能容忍分離不佳

其流速及容量均較大121HubeiUniversity目前一百二十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點3、凝膠過濾的操作及應用Sephadex柱高度約需1m，Sephacryl柱高度可為0.7m。分離大分子時，柱床體積應為上樣體積的25～100倍，柱高與直徑之比為20：1～100：1。裝柱要在攪拌下連續(xù)操作，一氣呵成。122HubeiUniversity目前一百二十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■膠柱的裝填方法：緩沖液平衡溫度平衡靜置膠體清洗膠體預估體積裝填膠體暫停流洗X繼續(xù)流洗加上

reservoir已堆積沉積中上清加壓流洗加上

adaptor緊密堆積檢查好管柱是否暢通12GelGel123HubeiUniversity目前一百二十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■層析管柱系統(tǒng)：緩沖液梯度制造器泵記錄器監(jiān)視器管柱膠體膠體裝填分部收集器(1)(2)(3)(4)(5)adapterreservoir轉接器124HubeiUniversity目前一百二十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點

極性相似的兩分子間，其親和力較強。極性

→

極性非極性

→

非極性LikeDissolvesLike（三）分配層析法

125HubeiUniversity目前一百二十五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點3.1

分配層析法的演示過程：圓形濾紙長條濾紙薄層層析(TLC)柱狀層析容量變大容量更大加展開液Paperpartitionchromatography(PPC)126HubeiUniversity目前一百二十六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點一個

板數(shù)■分配層析法的板數(shù)概念：BBBBBBBBBBBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAABBBBBBBBBB8020109064161916498151130131873極性非極性100A+100B127HubeiUniversity目前一百二十七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■薄層層析法操作：Thin-layerchromatography薄層板點好樣本加展開液樣本展開128HubeiUniversity目前一百二十八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點（四）親和層析

回第四節(jié)★親和層析是利用生物大分子的生物學特異性，即生物分子與其配體之間所具有的專一性親和力而設計的層析技術?！镉H和層析從理論上講，能產(chǎn)生一個絕對的純化作用，因此，可達到很高的純度。★分離快速，對分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質極為有效。129HubeiUniversity目前一百二十九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■親和層析法的作用機理：固相載體(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB親和基團配體XBAA130HubeiUniversity目前一百三十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點親和層析（affinitychromatography）目前一百三十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點

競爭性洗脫改變離子強度洗脫

PH洗脫變性劑洗脫打斷配體化學鍵洗脫洗脫方法132HubeiUniversity目前一百三十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點1、載體親和層析的載體多為凝膠，可分成兩類：一是大網(wǎng)孔型，如瓊脂糖凝膠其大孔網(wǎng)狀結構容許大分子自由進出凝膠；二是微孔型，如交聯(lián)葡聚糖凝膠和聚丙烯酸胺凝膠，其小網(wǎng)孔型的立體結構使大分子排阻在凝膠顆粒之外。

基質載體:CelluloseSephadexBio-gelBio-glassSepharose133HubeiUniversity目前一百三十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點2、配體★專一性結合，且親和力越大越好；★結合后又能解離，而且，無損于生物大分子的生物活性；▲適當?shù)幕瘜W基團，把配體偶聯(lián)到載體上，且不損害配體與生物大分子的專一性結合。

配體是親和層析中最重要成分。選擇好的配體有三個標準：134HubeiUniversity目前一百三十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點用于親和層析的配體：配體:

競爭性抑制劑輔酶底物金屬離子(CuNiMnZn)

染料135HubeiUniversity目前一百三十五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點3、“手臂”的作用下圖形象地說明了載體空間位阻的影響和“手臂”對親和吸附的作用。

A.無法“吻合”；B．借助“手臂”完全“吻合”載體載體136HubeiUniversity目前一百三十六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點親和層析中使用最多的“手臂”是NH2－（CH2）n-R類化合物。R可以是羧基、氨基、也可以就是配體。要使配體和互補生物大分子的相互作用處于最佳狀態(tài)，“手臂”中亞甲基的數(shù)目至少是4～6個，常用的長度是6～10個。137HubeiUniversity目前一百三十七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點Activity■4典型的親和層析操作：ElutionvolumeProteinpH2.05*138HubeiUniversity目前一百三十八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■專一性結合力量的構成因素：I.ConformationalMatch:VanderwaalsinteractionII.InteractionForces:(1)Hydrogenbond(2)Hydrophobicinteraction(3)Electrostaticinteraction(4)Vanderwaalsinteraction+Kd兩分子間因構形互補所造成的吸引力是由范德華力所貢獻+-=O…H-N-139HubeiUniversity目前一百三十九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■構形互補所造成的吸引力：VanderWaalinteractionsbetweennon-polarsurfacesvdwvdw范德華鍵數(shù)目夠多即足以造就親和力140HubeiUniversity目前一百四十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■各種親和性介質及其專一性基團：免疫吸附劑，大多自行合成

單株抗體純化對

a-D-葡萄糖、甘露糖基有專一性

HeparinSepharoseCL-6BBlueSepharoseCL-6B5'AMP-,2',5'ADP-Sepharose4B用來純化

lectin酶的專一性結合Oligo(dT)-cellulose配體

親和性分子

說明(還有更多其它親和配體及介質)Oligo(dT)抗體

底物或抑制劑ProteinConAHeparinCibacron-BlueAMP,ADP單糖及衍生物對應的酶對應的抗原LectinNAD(P)+結合酶NAD(P)+結合酶mRNA部分IgG糖蛋白凝血蛋白等Pharmacia141HubeiUniversity目前一百四十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■金屬螯合層析法：Ni

固相載體HisHisHisProteinMetalChelateAffinityChromatographyimidazole咪唑elution-O-C-C-C-O-C-C-C-NOHC-COOHC-COOHOH142HubeiUniversity目前一百四十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■親和層析法實例的原始材料：載體Chitin配體CHOM雞蛋粘多糖蛋白胰蛋白脢的抑制劑目標分子TrypsinOOCH2OHOH

NH2OOCH2OHOH

NHO=CH3143HubeiUniversity目前一百四十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■以親和層析法純化

Trypsin：CHOMTrypsinABC&D以凝膠電泳檢測親和層析操作過程各步驟的樣本Chitin144HubeiUniversity目前一百四十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點★若只有一種待分離的物質吸附在柱上，選用一種合適的緩沖液進行洗脫即可?！锶敉瑫r有幾種物質吸附在柱上，而且彼此親和力相差較大，可用階段洗脫方式進行洗脫。

★若彼此親和力相差很小時，則必須采用梯度洗脫方式進行層析分離。非專一性洗脫通過改變緩沖液的離子強度或者pH或者介電常數(shù)或者同時改變其中的兩種因素，使吸附的大分子的構象發(fā)生改變，以降低其與配體間的親和力，從而將其從柱上洗下。145HubeiUniversity目前一百四十五頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點配制專一性洗脫劑的原則是：①洗脫液中的游離配體最好與固定化配體不同；②洗脫液中的配體應對欲分離物質有較高的親和力；③洗脫液中游離配體的濃度要視固定化配體與待分離物的親和力而定。親和力大，所用濃度大；親和力弱，所用濃度低。

專一性洗脫采用含有待分離物質配體的緩沖液進行洗脫146HubeiUniversity目前一百四十六頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點蛋白質在親和層析柱上的吸附和洗脫條件147HubeiUniversity目前一百四十七頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點（五）聚焦層析

Chromatofocusing

優(yōu)點：①pH梯度自動產(chǎn)生，省去了梯度混合裝置，因此所用儀器設備簡單；②有聚焦效應，能產(chǎn)生很窄的分離區(qū)帶，峰寬度可達0.04～0.05pH單位，因此，分辨率很高；③所用的多元緩沖液和多元緩沖交換劑有商品供應，且易于使用；④分離容量大，整個操作類似于一般的離子交換層析，非常簡單容易；⑤此法適用于任何水溶性的兩性分子，如，蛋白質、酶、多肽和核酸等。（1）方法的原理pH梯度的形成（2）聚焦機制回第四節(jié)148HubeiUniversity目前一百四十八頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點等電聚焦

Chromatofocusing其介質也是一種離子交換介質但所使用的

Polybuffer

可拉出穩(wěn)定的pH梯度149HubeiUniversity目前一百四十九頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點■等電聚焦法如何拉出pH梯度：●

Polybuffer

含有連續(xù)

pKa

的緩沖分子(ampholyte)

可拉出連續(xù)

pH梯度9876

聚焦層析的pH梯度是利用離子交換劑本身的帶電基團與洗脫緩沖液的相互作用，在洗脫過程中自動形成的。150HubeiUniversity目前一百五十頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點++++■等電聚焦法的聚焦機制：8765+++++-0+Polybuffer聚焦在等電點在低pH處帶正電被排斥151HubeiUniversity目前一百五十一頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點聚焦效應

在區(qū)帶后面的蛋白質分子不被凝膠結合，它移動的速率比走在它前面的蛋白質分子更快，如果在第一份樣品上柱后加入第二份同種樣品，它將趕上第一份樣品，并與第一份樣品同時洗出，如果第二份樣品的等電點比第一份樣品更高，它將超過第一個區(qū)帶而先被洗出

152HubeiUniversity目前一百五十二頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點●

抹香鯨肌紅蛋白(pI=8.2)追過

馬肌紅蛋白(pI=7.4)153HubeiUniversity目前一百五十三頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點第五節(jié)蛋白質的電泳分離

一、電泳的類型二、聚丙烯酰膠凝膠電泳三、凝膠免疫電泳四、高效毛細管電泳

回總目錄154HubeiUniversity目前一百五十四頁\總數(shù)一百八十頁\編于十三點概念1809年俄國物理學家Peнce首先發(fā)現(xiàn)了電泳現(xiàn)象，但直到1937年瑞典的Tiselius建立了分離蛋白質的界面電泳(boundaryelectrophoresis)之后，電泳技術