第五章分子生物學基本研究法(上)

第五章分子生物學基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白質操作技術目前一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點現(xiàn)代分子生物學的快速發(fā)展，得益于上個世紀中葉以來研究方法、特別是基因操作和基因工程技術的進步?；虿僮髦饕―NA分子的切割與連接、雜交、電泳、細胞轉化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學研究的核心技術。目前二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質?；蚱渌d體分子，構成遺傳物質的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達?；蚬こ碳夹g是核酸操作技術的一部分，只不過它強調了外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達。事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細胞之中的能力，是基因工程技術區(qū)別于其它技術的根本特征。目前三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點重組DNA技術發(fā)展史上的重大事件三大成就：在20世紀40年代確定了遺傳信息的攜帶者、即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題；50年代提出了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題；50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與表達機制。目前四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.1基因操作的基本工具（一）限制性核酸內切酶能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點切開DNA分子。第一個核酸內切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個位點切開并產生具有粘性末端的小片段。目前五頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點內切酶酶切位點內切酶酶切位點BamHⅠGGATCCCCTAGGEcoRⅠGAATTCCTTAAGBanⅡHgiJⅡG(A/G)GC(TC)CC(T/C)CG(A/G)GEcoRⅤEco32ⅠGATATCCTATAGBglⅡAGATCTTCTAGAHindⅢAAGCTTTTCGAAAsuⅡBstBⅠTTCGAAAAGCTTPstⅠCTGCAGGACGTCBstPⅠEco91ⅠGGTNACCCCANTGGFbaⅠBclⅠTGATCAACTAGTDraⅠAhaⅢTTTAAAAAATTTMspⅠHpaⅡCCGGGGCCEco72ⅠCACGTGGTGCACKpnⅠGGTACCCCATGG圖5-1幾種主要DNA內切酶所識別的序列及其酶切末端。目前六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點PvuIIEcoRI目前七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點（二）基因克隆的載體載體三要素：自我復制能力；攜帶外源基因片段大?。徊迦胛稽c多少；易于鑒定識別程度。目前八頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點僅僅能在體外利用限制性核酸內切酶和DNA連接酶進行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上，才能在寄主細胞中進行繁殖。具備自主復制能力的DNA分子就是分子克隆的載體（vector）。病毒、噬菌體和質粒等小分子量復制子都可以作為基因導入的載體。目前九頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點pBR322質粒載體由三個不同來源的部分組成的：第一部分來源于pSF2124質粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分來源于pSC101質粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分則來源于ColE1的派生質粒pMB1的DNA復制起點（ori）。目前十頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點AmpR目前十一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點重組DNA操作過程示意圖目前十二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-2DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體

目前十三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點獲得了用外源DNA片段和載體分子重組而成的雜種DNA分子后，還必須通過一個被稱為細菌轉化的過程將其重新導入到寄主細胞中，才能保證重組DNA分子的增殖（圖5-3）。目前十四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-3重組DNA操作過程示意圖

目前十五頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.2DNA操作技術5.2.1核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術，已經發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段。目前十六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。目前十七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點生理條件下，核酸分子中的磷酸基團呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離子（polyanions），在電場中向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。目前十八頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個堿基對之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。目前十九頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點表5-2瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力凝膠類型及濃度分離DNA的大小范圍（bp）

0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1目前二十頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-4溴化乙錠染料的化學結構及其對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。目前二十一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-4DNA脈沖電場凝膠電泳示意圖目前二十二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.2.2細菌轉化與目標DNA分子的增殖通過細菌轉化方法將體外構建好的雜種DNA分子導入宿主細胞中。外源DNA通過自身載體上的復制起始點進行復制增殖，能在宿主細胞中長期保存下來，并能以完整的形式從細胞中被分離純化出來。細菌轉化（transformation），是指一種細菌菌株由于捕獲了來自供體菌株的DNA而導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的過程。提供轉化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉化DNA的細菌菌株則被稱為受體菌株。目前二十三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-5細菌轉化及藍白斑篩選

目前二十四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點為提高效率，可對受體菌進行物理或化學處理，增加其獲取DNA的能力。經過這種處理的細胞被稱作感受態(tài)細胞（competentcells）。目前二十五頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點CaCl2法將快速生長期大腸桿菌置于經0℃預處理的低滲CaCl2溶液中，細胞膨脹，膜通透性改變，易與外源DNA相粘附。將該體系轉移到42℃下做短暫的熱刺激，外源DNA就可能被細胞吸收。將經過轉化后的細胞置于選擇性培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆。轉化效率可達到5×106~2×107個轉化子/μg超螺旋質粒DNA。目前二十六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點DNA目前二十七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點電擊法電脈沖可以在細胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。隨著跨膜電壓增加，大疏水性孔洞會轉變?yōu)橛H水性孔洞，介質中的DNA進入細胞質。將生長至對數(shù)中期的E.coli菌液冷卻至4℃后離心，洗菌后用10%的甘油懸浮，將高密度菌液（~2×1010/ml）置于特制的電極杯中進行電擊。目前二十八頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點獲得最大轉化效率時場強一般為12.5~15kV/cm，時間跨度一般為4.5~5.5毫秒。電擊轉化與溫度有關，一般在0~4℃進行。由于轉化載體上常帶有LacZ基因，多用帶有不同抗生素（常用的抗生素包括氨芐青霉素、卡那霉素和四環(huán)素等）的選擇性培養(yǎng)基結合α-互補藍白斑篩選法鑒定轉化細胞。目前二十九頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.2.3聚合酶鏈式反應（PCR）技術聚合酶鏈式反應是快速擴增DNA序列最常用的方法。PCR反應的模板DNA若是基因組上的某個片段，就稱為genomicPCR，若是mRNA反轉錄產生的cDNA，就稱為RT-PCR。目前三十頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點PCR技術的原理首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新生的DNA互補鏈。目前三十一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點

PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C目前三十二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5Primer15Primer255TemplateDNAPCR技術原理目前三十三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點Cycle325～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目前三十四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點DNA解鏈（變性）引物與模板DNA相結合（退火）DNA合成（鏈的延伸）三步。經不斷重復循環(huán)之后，反應混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結合位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應是2n,實得1.8n.目前三十五頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-7聚合酶鏈式反應（PCR）技術目前三十六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-8PCR指數(shù)擴增時循環(huán)次數(shù)與DNA產物數(shù)量的比較目前三十七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點1、將含有待擴增DNA樣品的反應混合物放置在高溫（>94℃）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA。94℃加熱，變性目前三十八頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點2、降低反應溫度（退火，約50℃），約1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA結合在靶DNA區(qū)段兩端的互補序列位置上。50℃~60℃，退火引物與模板DNA相結合目前三十九頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點3、將反應混合物的溫度上升到72℃左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互補鏈。PCR擴增，72℃左右,按每分鐘1000個堿基對設計循環(huán)往復目前四十頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點PCR反應體系：

常用30μl，各種成分的實際用量應根據實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的儲備液濃度進行核算。10×buffer：1×30/10=3μlMgCl2:1.5×30/25=1.8μldNTPs:0.2×30/10=0.6μl引物P：0.4×30×2/10=2.4μlTaq酶(5U/μl)：1/5=0.2μl

模板：1μl

水：30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl目前四十一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點

操作：

5份標本總體積30μl×6=180μl1.取一0.5mlEp管，依次加入下列試劑：

10×buffer：3μl×6=18μlMgCl2:1.8μl×6=10.8μldNTPs:0.6μl×6=3.6μl

引物P：2.4μl×6=14.4μlTaq酶(5U/μl)：0.2μl×6=1.2μl

水：21μl×6=126μl

共174μl，先用移液器/指彈混勻，后用離心機瞬時混勻（管壁上液體沉至管底）。目前四十二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點2.另取5支0.2mlEp管，分別加入上述液體29μl。3.分別取標本模板各1μl，加入上述5支Ep管中，混勻，分別加入2滴液體石蠟（防止加溫過程中液體蒸發(fā)影響反應體積），離心機瞬時離心，備用。4.反應條件：PCR擴增儀

94℃30″，55℃30″，72℃1′，

35個循環(huán)，72℃延伸5′。

目前四十三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點PCR反應條件優(yōu)化：1、溫度、循環(huán)參數(shù)：⑴變性溫度和時間：保證模板DNA解鏈完全是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90～95℃，30～60s，再復雜的DNA分子也可變性為單鏈。根據模板DNA復雜程度，可以調整變性溫度和時間。一般情況下選擇94℃30″，可使各種復雜的DNA分子完全變性。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。目前四十四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點⑵復性溫度和時間：PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度的選擇，可根據引物的長度和G+C含量確定，長度在15～25bp之間時，復性溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)計算得到，一般位于40～60℃，30～60s。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。一般情況下選擇55℃30″，足以使引物與模板之間完全結合。目前四十五頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點⑶延伸溫度和時間：一般位于Taq酶最適作用溫度70～75℃之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70～75℃。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，<1Kb，1分鐘足夠；>1Kb需加長延伸時間，10Kb片段延伸時間可達15分鐘。延伸時間過長可出現(xiàn)非特異擴增，常用72℃1′。

目前四十六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點⑷循環(huán)數(shù)：其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20～25次循環(huán)后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20～30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。目前四十七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點2、MgCl2濃度：可顯著影響PCR的產量及產物特異性

1.5～2.0mM

過高：增加非特異擴增并影響產率過低：酶活性顯著下降。

目前四十八頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點3、引物：

0.2～1μM

偏高：非特異產物擴增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產量降低。偏低：產量降低。

引物設計原則：總原則是提高擴增的效率和特異性目前四十九頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點引物設計原則⑴長度15～30b，過短特異性降低，過長則成本增加，產量也下降。⑵引物堿基盡可能隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C含量宜在45～55%左右。⑶引物內部不能含有自身互補序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結構，兩個引物之間尤其在3’末端不應有互補鏈存在，不然會形成引物二聚體。⑷引物的堿基順序不應與非擴增區(qū)域有同源性(<70%)或少于連續(xù)8個的互補堿基。要求在引物設計時采用計算機進行輔助檢索分析。目前五十頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點⑸引物的5′

末端堿基：并沒有嚴格的限制，只要與模板DNA結合的引物長度足夠，其5′末端堿基可以不與模板DNA匹配呈游離狀態(tài)。最多可游離10個堿基并不影響PCR反應進行。⑹引物的3′

末端堿基：原則上要求引物的3′末端與模板DNA一定要配對，另外3′末端的末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。引物3′末端堿基在錯誤配對時不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異，最好選T、G、C，而不選A。目前五十一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點PCR擴增產物的分析

1、凝膠電泳分析法：聚丙烯酰胺凝膠電泳靈敏度遠高于瓊脂糖電泳，用于探討PCR擴增的靈敏度效果好，但配制復雜，

常用瓊脂糖凝膠電泳。

2、點雜交

3、微孔板雜交法目前五十二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點目前五十三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點PCR技術的主要用途

1、目的基因的克?。?/p>

PCR技術為在重組DNA過程中獲得目的基因片段提供了簡便快速的方法。

2、基因的體外突變：可以隨意設計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。

目前五十四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點3、DNA和RNA的微量分析：

PCR技術高度敏感，對模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。實際工作中，一滴血液、一根毛發(fā)或一個細胞已足以滿足PCR的檢測需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應用前景。4、DNA序列測定：

PCR技術的引入使DNA測序工作大大簡化，也提高了測序的速度。5、基因突變分析：利用PCR與一些技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。目前五十五頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點三、PCR技術的應用（一）反轉錄PCR（RT-PCR）RT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。目前五十六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點（二）錨定PCR（anchoredPCR）用于在體外擴增未知序列的DNA片段的方法，而一般的PCR必須預先知道欲擴增DNA片段兩側的序列，但人們經常需要分析一端序列未知的基因片段，可利用錨定PCR。該法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人為賦予未知基因末端序列信息，再用人工合成的多聚尾互補的引物作為錨定引物，在與基因另一側配對的特異引物參與下，擴增帶有同聚物尾的序列。目前五十七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點（3）反向PCR（iversePCR）

常規(guī)PCR可擴增位于二個引物之間的DNA片段，但不能擴增引物外側的DNA序列，反向PCR則可擴增引物外側的DNA片段，對已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增和研究。目前五十八頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點（四）巢式PCR（nestedPCR）

是指利用兩套PCR引物（巢式引物）對進行兩輪PCR擴增反應。在第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物在在內引物的存在下進行第二輪擴增。由于巢式PCR反應有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性（因為與兩套引物都互補的引物很少）增加了檢測的敏感性；又有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。目前五十九頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點目前六十頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點（五）原位PCR(InsituPCR)原位PCR是指在組織或細胞標本片上直接進行PCR，對細胞中的靶DNA進行擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測的方法?？煞譃橹苯臃ê烷g接法。基本步驟：組織切片或細胞固定→蛋白酶消化→原位PCR擴增→沖洗→產物檢測

優(yōu)點：靈敏度高，可進行細胞內定位。目前六十一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點（六）多重PCR（multiplexPCR）多重PCR是在同一反應中采用多對引物同時擴增幾個不同的DNA片段，如果基因某一區(qū)段缺失，則相應的電泳圖譜上此區(qū)段PCR擴增產物長度減少或消失，從而發(fā)現(xiàn)基因異常。多重PCR具有靈敏快速特點，特別適用檢測單拷貝基因缺失、重排、插入等異常改變，其結果與Southernblotting一樣可靠，但多重PCR會檢測小片段缺失目前六十二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點（七）不對稱PCR（asymmetricPCR）

目的：擴增產生特異長度的單鏈DNA

在擴增循環(huán)中引入不同引物濃度，一般用二種不同濃度的引物，50－100：1比例的引物濃度，在最初10－15個循環(huán)中主要產物還是雙鏈DNA，但當?shù)蜐舛纫锉幌谋M后，高濃度引物介導的PCR反應就會產生大量單鏈DNA。單鏈DNA可用作雜交探針或DNA測序。目前六十三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點（八）免疫PCR(ImmunoPCR,Im-PCR)免疫PCR結合了抗原抗體反應的特異性和PCR的高敏感性，是一種極為敏感的抗原檢測技術，適合于各種微量抗原的檢測。免疫PCR的關鍵在于形成抗體—標記DNA耦聯(lián)物，作為橋梁連接免疫反應的特異性和PCR的高擴增能力。免疫PCR主要由兩個部分組成，第1部分是類似于普通ELISA的抗原抗體反應，第2部分即常規(guī)的PCR擴增和電泳檢測。

目前六十四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.2.4實時定量PCR（realtimequantitativePCR，Q-PCR）由于PCR敏感性高，擴增產物總量變異系數(shù)大，定量不準確。90年代末期出現(xiàn)了Q-PCR，利用熒光檢測PCR儀繪制DNA擴增過程中的累積速率動態(tài)變化圖，基本消除在測定終端產物豐度時變異系數(shù)較大的問題。目前六十五頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點混合在PCR反應液中的熒光探針只有與大片段DNA結合后，才能夠被激發(fā)出熒光。隨著新合成DNA片段的增加，由于結合到DNA上的熒光探針增加，被激發(fā)產生的熒光相應增加。非序列特異性熒光染料SYBRGreenI,激發(fā)光波長520nm。目前六十六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點SYBRGreenI作探針的實時定量PCR實驗過程圖示目前六十七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點HanP.,LiQ.,andZhuY.X.(2008)ThePlantCell20:1482-1493.

熒光強度目前六十八頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點為確保熒光檢測的確實是靶DNA，又設計了僅能與目的DNA特異結合的熒光探針。TaqMan探針是一段與靶DNA序列中間部位結合的單鏈DNA，長50bp-150bp，該DNA的5’和3’端帶有短波長和長波長兩個不同熒光基團，由于彼此距離靠近，在熒光共振能量轉移（FRET）作用下發(fā)生熒光淬滅，因而檢測不到熒光。目前六十九頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點隨著PCR反應的進行，TaqMan探針結合到目的DNA序列上，并且會被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐個切除而降解。切下來的熒光基團解除了熒光淬滅的束縛，會在激發(fā)光下發(fā)出熒光，因此，產生的熒光強度直接反映了所擴增靶DNA的總量。目前七十頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點TaqMan探針實時定量PCR技術目前七十一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點Ct值是產物熒光強度首次超過設定閾值時，PCR反應所需的循環(huán)數(shù)。利用標準曲線，可以確定樣品中待檢測靶DNA的絕對含量。圖5-11用實時定量PCR法分析未知樣品靶基因的絕對表達量。目前七十二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.2.5基因組DNA文庫構建把某種生物的基因組DNA切成適當大小，分別與載體組合，導入微生物細胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克?。ɡ碚撋厦總€序列至少有一個代表），這樣的克隆片段的總匯，稱為基因組DNA文庫。目前七十三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-13用Sau3A限制性核酸內切酶消化真核生物基因組DNA并利用噬菌體載體構建基因組文庫的過程圖示。目前七十四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點目前七十五頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點DNA文庫的完備性Clark和Carbon于1975年提出公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)式中：N表示一個基因組文庫所應該包含的重組克隆數(shù)目；p表示所期望的靶基因在文庫中出現(xiàn)的概率；f表示重組克隆平均插入片段的長度與基因組DNA總長的比值。為獲得整個基因簇或一個基因及其兩翼延伸序列，基因組文庫中的DNA片段常大于20kb。以人為例，其基因組大小為3×109bp若p=99%，平均插入片段大小為20kb，則N=6.7×105。目前七十六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點構建基因組文庫最常用的是λ噬菌體載體（克隆能力約15—20kb）和限制性內切酶部分消化法。例如用識別4個核苷酸的核酸限制性內切酶Sau3A，與BamHI是一對同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切產生的DNA片段可插入到經BamHI消化的λ噬菌體載體上。目前七十七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點λ噬菌體作為克隆載體目前七十八頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點此外，還有很多大容量克隆載體，如柯斯質粒、細菌人工染色體（BAC）、P1源人工染色體（PAC）、酵母人工染色體（YAC）等都可用于基因組文庫的構建。它們的優(yōu)點是可以插入更大片段DNA，但是穩(wěn)定性一般較差，在大量復制的過程中容易出現(xiàn)缺失現(xiàn)象。操作也相對較困難。目前七十九頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.3RNA基本操作技術真核生物基因組DNA龐大，有大量重復序列，很難直接分離得到靶基因片段。而cDNA來自反轉錄的mRNA，無冗余序列，通過篩選cDNA文庫，可較快地分離到相關基因。目前八十頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點細胞中的總RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一個典型的動物細胞約含10-5μgRNA，其中：80%-85%為rRNA15%-20%為tRNA及sRNAmRNA約占總RNA的1%-5%目前八十一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點rRNA分子具有確定的大小和核苷酸序列，特別是28S和18S特征性條帶是電泳鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)。目前八十二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點LiQetal.(2006)J.Integr.PlantBiol.48:114-120.目前八十三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點RNA提取的基本原理與方法（一）總RNA提取的基本原理與方法1、原理通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。提取步驟：破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA。目前八十四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點所有RNA的提取過程中都有五個關鍵點，即：樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復合體變性；對內源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。但其中最關鍵的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑:1、提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；2、直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質進入有機相而RNA留在水相。目前八十五頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點2、總RNA提取的方法（1）（異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質。目前八十六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點（二）mRNA的提取mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA3’末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。目前八十七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-14PolyATtractmRNA的分離純化過程簡圖。目前八十八頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點三、DNA或RNA濃度、純度和相對分子質量的測定（一）分光廣度法DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結構在紫光區(qū)具有較強吸收，其吸收峰在260nm處。波長為260nm時，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關，也隨構型而有差異。對標準樣品來說，濃度為1μg/ml時，DNA鈉鹽的OD260＝0.02當OD260＝1時，dsDNA濃度約為50μg/mlssDNA濃度約為37μg/mlRNA濃度約為40μg/ml

核苷酸濃度約為30μg/ml（由于底物不同有差異）目前八十九頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點DNA樣品的濃度（μg/μl）:OD260×稀釋倍數(shù)×50/1000RNA樣品的濃度（μg/μl）:OD260×稀釋倍數(shù)×40/1000當DNA樣品中含有蛋白質、酚或其他小分子污染物時，會影響DNA吸光度的準確測定。一般情況下同時檢測同一樣品的OD260、OD280和OD230，計算其比值來衡量樣品的純度。經驗值：純DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白質、酚等污染）純RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7時表明有蛋白質或酚污染；＞2.0時表明可能有異硫氰酸殘存）若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時無法用分光光度法對核酸進行定量，可使用方案二的方法或其他方法進行估算。目前九十頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點由于RNA分子敏感脆弱，在自然狀態(tài)下難以被擴增，為了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般將其反轉錄成穩(wěn)定的DNA雙螺旋（cDNA，complementaryDNA），再插入到可以自我復制的載體中。目前九十一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-15cDNA合成過程示意圖。目前九十二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-16定向cDNA合成及分子修飾目前九十三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點因為絕大多數(shù)大腸桿菌細胞都會切除帶有5'-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以實驗中常選用mcrA-mcrB-菌株以防止cDNA被降解。目前九十四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點cDNA文庫的構建cDNA的長度一般在0.5-8kb之間，質粒載體和噬菌體類載體都能滿足要求。cDNA文庫常用Uni-zapXR（一種λ噬菌粒載體）做載體，它具備噬菌體的高效性和質粒載體系統(tǒng)利用藍白斑篩選的便利，可容納0-10kbDNA插入片段，含有pBluescript載體的全部序列。重組后可通過體內剪切反應（InVivoExcision）將cDNA插入片段轉移到質粒系統(tǒng)中進行篩選、克隆和序列分析。目前九十五頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點基因文庫的篩選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選的方法有很多種，如核酸雜交法，PCR篩選法和免疫篩選法等。目前九十六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點1、核酸雜交法：核酸雜交法以其廣泛的適用性和快速性成為基因文庫篩選中最常用的一種方法，用放射性標記的特異DNA探針適用于高密度的菌落雜交篩選。將待篩選菌落轉移到硝酸纖維素膜上，適當溫育。同時保留原來的菌落平板作對照。目前九十七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點取出已經長有菌落的膜，用堿液處理，使菌落發(fā)生裂解，DNA隨之變性。用蛋白酶K處理硝酸纖維素膜去除蛋白質，形成菌落DNA的印跡。80℃烘烤濾膜，將DNA固定在膜上。將濾膜與放射性標記的DNA或RNA探針雜交，通過放射性自顯影顯示雜交結果。通過對應于平板上的位置找到相應克隆。目前九十八頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-17通過核酸雜交篩選目的克隆流程圖目前九十九頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點2、PCR篩選法將整個文庫（以質粒的形式或者細菌的形式均可）保存在多孔培養(yǎng)板上，用設計好的目的基因探針對每個孔進行PCR篩選，鑒定出陽性的孔，把每個陽性孔中的克隆再稀釋到次級多孔板中進行PCR篩選。重復以上程序，直到鑒定出與目的基因對應的單個克隆為止。目前一百頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點3、免疫篩選法該法僅適用于對表達文庫的篩選。若實驗中靶基因的序列完全未知但是有針對該基因產物的特異性抗體，就可以采用免疫篩選法。目前一百零一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-18噬菌體表達文庫的免疫化學篩選法示意圖

目前一百零二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.4SNP的理論與應用SNP是SingleNucleotidePolymorphism的縮寫，即單核苷酸多態(tài)性，指基因組DNA序列中由于單個核苷酸（A，T，C和G）的突變而引起的多態(tài)性。目前一百零三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.4.1SNP（單核苷酸多態(tài)性）概述科學上把染色體DNA同一位置上的每個堿基類型叫做一個等位位點。SNP是基因組中最簡單最常見的多態(tài)性形式，具有很高的遺傳穩(wěn)定性。SNP檢測和分析技術已經成為繼限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）和微衛(wèi)星標記（SSR）之后的第三代遺傳標記。目前一百零四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-19染色體上共同遺傳的SNP組合。圖中SNP1和SNP2在同一條染色體上而且距離很近，SNP1有等位位點A和G，SNP2有等位位點G和T。因此，染色體對有兩種可能的SNP組合。目前一百零五頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點單倍型基因型外顯子IV內含子IV57130165232236H1H-4TTATTH-3TTATTH-1TTATTE-2TTATTB-73TTATTH2MO17CTACCB-1CTACCH3H60CCTTT玉米globulin1不同單倍型和基因型之間的多態(tài)性比較

目前一百零六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點據估計，人類DNA中每300-1000個堿基對就有一個SNP，因此，一個人類個體大約攜帶300萬-1000萬個SNPs。位于染色體上某一區(qū)域的一組相關聯(lián)的SNP等位位點被稱作單倍型（haplotype），相鄰SNPs的等位位點傾向于以一個整體遺傳給后代。因此,SNP成為第三代遺傳標志,人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關。

目前一百零七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點現(xiàn)在普遍認為SNP研究是人類基因組計劃走向應用的重要步驟。這主要是因為SNP將提供一個強有力的工具，用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關基因的鑒定、藥物的設計和測試以及生物學的基礎研究等。SNP在基因組中分布相當廣泛。大量存在的SNP位點，使人們有機會發(fā)現(xiàn)與各種疾病，包括腫瘤相關的基因組突變；從實驗操作來看，通過SNP發(fā)現(xiàn)疾病相關基因突變要比通過家系來得容易；有些SNP并不直接導致疾病基因的表達，但由于它與某些疾病基因相鄰，而成為重要的標記。SNP在基礎研究中也發(fā)揮了巨大的作用，近年來對Y染色體SNP的分析，使得在人類進化、人類種群的演化和遷徙領域取得了一系列重要成果。目前一百零八頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點根據SNP在基因組中的分布位置分為編碼區(qū)SNP（cSNP），調控區(qū)SNP（pSNP）和非編碼區(qū)SNP（rSNP）三類。編碼區(qū)內的變異率僅占周圍序列的1/5，cSNP的總量顯著少于其它兩類SNPs。cSNP分為同義cSNP（synonymouscSNP），編碼序列的改變不影響所翻譯的氨基酸序列）和非同義cSNP（non-synonymouscSNP），堿基序列的改變使氨基酸序列發(fā)生改變，可能影響蛋白質的功能。目前一百零九頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.4.2SNP的檢測技術通過DNA測序法獲得新的SNP。基因分型（genotyping）是指利用數(shù)據庫中已有的SNP進行特定人群的序列和發(fā)生頻率的研究，主要包括基因芯片技術、Taqman技術、分子信標（molecularbeacons）技術和焦磷酸測序法（pyrosequencing）等。目前一百一十頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點1．基因芯片技術通過優(yōu)化芯片雜交程序，使探針只與完全互補的序列雜交而不與含有單個錯配堿基的序列雜交。優(yōu)點是高通量，一次可對多個SNP進行規(guī)模性篩選，被檢起始材料也很少，操作步驟簡單。缺點是芯片設計成本高。而且，由于DNA樣品的復雜性，有些SNP不能被檢測。目前一百一十一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點2．Taqman技術PCR反應系統(tǒng)中加入2種不同熒光標記的分別與兩個等位基因配對的探針。隨著PCR的進行，與模板完全配對的探針逐步被TaqDNA聚合酶的5’→3’外切活性所切割，熒光基團與3’端的淬滅基團分離，熒光基團被激活。不完全配對的探針（代表另一種等位基因）不能被有效切割，供體熒光基團依然被淬滅。目前一百一十二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點3．分子信標（molecularbeacon）技術是一種呈莖環(huán)結構的熒光標記的寡核苷酸，環(huán)狀區(qū)與靶序列特異性結合，莖干區(qū)由5-8個堿基對組成，5’端帶有熒光發(fā)生基團，3’端帶有熒光淬滅基團。自由狀態(tài)時，分子信標呈發(fā)卡式結構，熒光幾乎完全淬滅。與靶分子相結合時，熒光基團和淬滅基團之間的距離增大，分子信標的熒光恢復。目前一百一十三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點Taqman技術（上）及分子信標技術（下）原理示意圖。目前一百一十四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.5基因克?。╟lone）技術在多細胞的高等生物個體水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotictwins）便是屬于同一克隆。目前一百一十五頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點在細胞水平上，克隆一詞是指由同一個祖細胞（progenitorcell）分裂而來的一群帶有完全相同遺傳物質的子細胞。在分子生物學上，人們把將外源DNA插入具有復制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復制這種過程稱為克隆。目前一百一十六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點RACE技術（rapidamplificationofcDNAends）在已知cDNA序列基礎上克隆5’或3’端缺失序列的技術。根據已知序列設計基因片段內部特異引物，由該片段向外側進行PCR擴增得到目的序列。用于擴增5’端的方法稱為5’RACE，用于擴增3’端的稱為3’RACE。目前一百一十七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5’RACE在反轉錄酶的作用下，以基因片段內部特異性引物（GSP1）啟始cDNA第一條鏈合成。RNase降解模板鏈mRNA，純化第一鏈。用末端轉移酶在cDNA鏈3’端加入連續(xù)的dCTP。以連有oligo(dG)

的錨定引物和基因片段內部特異的nested引物進行PCR擴增，得到目的片段，用nestPCR檢測。目前一百一十八頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點目前一百一十九頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點3’RACE1、用oligo(dT)錨定引物啟始cDNA第一鏈的合成.2、降解模板mRNA.3、用通用錨定引物和基因片段內部特異引物進行PCR擴增得到目的3’片段，用nestPCR法檢測.目前一百二十頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.5.2cDNA差示分析法

(RDA,RepresentationDifferenceAnalysis)通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴增目的基因片段。因為Tester和Driver在接受差示分析前均經一個4堿基切割酶處理，形成平均長度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息能被擴增。每次T減D反應后僅設置72℃復性與延伸，94℃變性這兩個參數(shù)共20個PCR循環(huán)，PCR產物的特異性和所得探針的純度高。目前一百二十一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點目前一百二十二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點目前一百二十三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.5.3Gateway大規(guī)?？寺〖夹gGateway技術利用λ噬菌體進行位點特異性DNA片段重組，實現(xiàn)了不需要傳統(tǒng)的酶切聯(lián)接過程的基因快速克隆和載體間平行轉移。目前一百二十四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點Gateway大規(guī)?？寺〔呗阅壳耙话俣屙揬總數(shù)一百五十五頁\編于十六點TOPO反應:將目的基因PCR產物連入Entry載體。載體上的CCCTT被拓撲異構酶所識別，通過與切口處的磷酸基團形成共價鍵，將該酶偶聯(lián)在載體上。5’GTGG粘性末端攻擊PCR產物的互補性末端并與接頭序列CACC退火，使PCR產物以正確方向連入Entry載體。目前一百二十六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點LR反應：將目的片段從Entry載體中重組入表達載體。Entry載體上基因兩端具有attL1和attL2位點，目的載體上含有attR1和attR2位點，在重組蛋白的作用下發(fā)生定向重組，形成新的位點attB1和attB2，將目的基因轉移到表達載體中。目前一百二十七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點GetEntryVectorGetExpressionVectorGetcDNATOPOLR目前一百二十八頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點目前一百二十九頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點目前一百三十頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點120AP2/EREBPgeneswereclonedFengJXetal(2005)AsystematicannotationupdateviacDNAsequenceanalysisandcomprehensiveprofilingofdevelopmental,hormonalorenvironmentalresponsivenessoftheArabidopsisAP2/EREBPtranscriptionfactorgenefamily.PMB59:853-868.目前一百三十一頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點5.5.4基因的圖位克隆法（Map-basedcloning）所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過該方法克隆得到。通過構建遺傳連鎖圖，將目的基因定位到某個染色體的特定位點，并在其兩側確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標記。目前一百三十二頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點通過對不同的生態(tài)型及限制性內切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的分子標記，通過染色體步移法將位于這兩個標記之間的基因片段克隆并分離出來，根據基因功能互作原理鑒定目的基因。目前一百三十三頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點圖5-26染色體步移法克隆基因示意圖目前一百三十四頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點在RFLP作圖中，連鎖距離是根據重組率來計算的，1cM（厘摩）相當于1%的重組率。人類基因組中，1cM≈1000kb；擬南芥菜中，1cM≈290kb；小麥中，1cM≈3500kb。目前一百三十五頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點用圖位克隆法獲得水稻脆桿基因BCl

目前一百三十六頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點將BCl定位于水稻3號染色體（Chr3）分子標記C524a和RM16之間；B.覆蓋BCl位點的BAC大片段。C.BCl位點的精細定位。BCl位點被定位于分子標記P2和P4之間與P3共分離。D.BCl基因結構。紅色為編碼區(qū)，白色為5’和3’非翻譯區(qū)，黑色線段為內含子。bcl-1和bcl-2表示兩個突變位點。

目前一百三十七頁\總數(shù)一百五十五頁\編于十六點Li,Y.,Qian