第十四章基因工程與蛋白質(zhì)工程

第十四章基因工程與蛋白質(zhì)工程一、基因工程的定義及主要內(nèi)容二、重組DNA分子引入宿主細(xì)胞和篩選鑒定三、克隆基因的表達(dá)四、基因工程的成就和展望五、蛋白質(zhì)工程目前一頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)一、基因工程定義及主要內(nèi)容基因工程也稱基因重組技術(shù)、基因克隆或分子克隆.是指利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)或改造生物產(chǎn)品、創(chuàng)建或改良動(dòng)植物品種以及開發(fā)特殊用途的微生物等.是生物工程的重要內(nèi)容之一.目前二頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)主要步驟：1.帶有目的基因的DNA片段的獲得；2、構(gòu)建DNA重組分子；3、重組DNA分子引入宿主細(xì)胞和篩選鑒定；4、基因的表達(dá).目前三頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)基因工程基本程序真核染色體DNA克隆載體（質(zhì)粒）限制酶切割限制酶切割并分離所需片斷重組載體細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞分離培養(yǎng)增值目前四頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)構(gòu)建DNA重組分子工具酶目的基因的制備克隆載體DNA分子的體外重組目前五頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)工具酶限制性內(nèi)切酶是基因工程中最主要的工具酶DNA連接酶（DNAligase）、DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ）、末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）、逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）、核酸酶S1（nucleaseS1）和核酸外切酶Ⅶ（exonucleaseⅦ）目前六頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶由Smith在1970年從流感噬血菌中發(fā)現(xiàn).細(xì)菌體內(nèi)有特異的限制修飾系統(tǒng)，這種修飾系統(tǒng)是通過特殊的修飾酶在細(xì)菌本身DNA的特異識(shí)別序列處進(jìn)行甲基化修飾，從而與外源DNA相區(qū)別。這樣，限制性核酸內(nèi)切酶就能去切割破壞外源DNA，而對(duì)本身無影響。目前已從原核生物中分離出400～500多種限制性核酸內(nèi)切酶.目前七頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別DNA特定核苷酸序列的核酸內(nèi)切酶分類:三類.命名:EcoRI分布：主要來源于原核生物。特點(diǎn)：特異性，即識(shí)別特定核苷酸序列，切割特定切點(diǎn)。結(jié)果：產(chǎn)生黏性未端（堿基互補(bǔ)配對(duì)）或平端。舉例：大腸桿菌的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開。目前八頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶可識(shí)別4或6個(gè)特異核苷酸序列.粘性末端：指限制性內(nèi)切酶的切割部位不在識(shí)別序列的中心軸，在斷段產(chǎn)生一個(gè)短的單股突伸出來的不齊末端。鈍性末端：指限制性內(nèi)切酶的切割部位在識(shí)別序列的中心軸處，即產(chǎn)生平齊末端。目前九頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶同裂酶:來源不同,但有相同的識(shí)別序列.或稱異源同工酶.同切點(diǎn)酶:不僅識(shí)別序列相同,而且切點(diǎn)也相同.同尾酶:酶的識(shí)別序列不完全相同,但切出的粘性末端相同.目前十頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)幾種限制性內(nèi)切酶的作用位點(diǎn)目前十一頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)幾種限制性內(nèi)切酶的作用位點(diǎn)目前十二頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)目的基因的制備目的基因就是所需要克隆的外源基因.制備方法：1、人工合成法.2、逆轉(zhuǎn)錄法.3、用限制性內(nèi)切酶直接從染色體DNA中分離.4、用PCR法擴(kuò)增目的基因片段.目前十三頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)目的基因的制備：人工合成法較小分子基因可用人工化學(xué)合成的方法獲得.DNA化學(xué)人工合成的方法已經(jīng)自動(dòng)化.人工合成目的基因的先決條件：基因的核苷酸序列是已知的.缺點(diǎn)是：1、不能合成太大的基因；2、合成基因時(shí)遺傳密碼的兼并現(xiàn)象會(huì)為選擇密碼帶來很大困難；3、費(fèi)用較高目前十四頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)目的基因的制備：逆轉(zhuǎn)錄法若所需基因較大，人工合成有困難，從組織中分離提取也不容易，則可利用逆轉(zhuǎn)錄法合成。該法是：以編碼某特異多肽的mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成該多肽mRNA的互補(bǔ)DNA（cDNA）；再以cDNA為模板，在DNA聚合酶I作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA（dsDNA）?？捎糜谡婧松锬康幕虻墨@得.目前十五頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)目的基因的制備：逆轉(zhuǎn)錄法目前十六頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)目前十七頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)目的基因的制備：逆轉(zhuǎn)錄法用逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA的主要問題是：1、mRNA必需提得很純.2、逆轉(zhuǎn)錄中常產(chǎn)生各種不完全的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物.3、以單鏈cDNA為模板往往難以合成與單鏈cDNA一樣長(zhǎng)的ds－cDNA，這與實(shí)驗(yàn)技術(shù)有關(guān)。目前十八頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)用限制酶切法直接從染色體DNA中分離此方法主要適用于制備原核基因.對(duì)于物理圖譜已清楚的原核基因，可用限制酶把目的基因切出來.鳥槍法：指把目的基因從已用限制酶降解的染色體片段群中分離純化出的方法，即把包括目的基因在內(nèi)的全部DNA片段插入到載體DNA（如pBR322）中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，做成基因文庫(kù)。再用目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作探針，通過分子雜交，選擇出含有所需基因的DNA片段。目前十九頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)

基因文庫(kù)的構(gòu)建

將總DNA包含的基因組各片段分別克隆在質(zhì)粒或噬菌體載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌,便構(gòu)成了該生物的基因文庫(kù)。目前二十頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)用限制酶切法直接從染色體DNA中分離此方法的優(yōu)點(diǎn)是獲得的目的基因的組織結(jié)構(gòu)與天然基因一樣，也具有間隔順序。此方法的缺點(diǎn)是：由于含有插入順序，原始轉(zhuǎn)錄本不能被原核細(xì)胞識(shí)別，并將插入順序切除，以形成成熟轉(zhuǎn)錄本，因此也得不到目的基因的產(chǎn)物多肽或蛋白質(zhì)。目前二十一頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)用PCR方法擴(kuò)增目的基因片段PCR是聚合酶鏈反應(yīng)的縮寫.是一種在體外模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù).在有少量DNA模板、引物、四種dNTP、TaqDNA聚合酶、合適的緩沖系統(tǒng)下，通過儀器控制DNA變性、退火及延伸的溫度與時(shí)間，來合成新的DNA鏈，新合成的DNA鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板。理論上經(jīng)n次循環(huán)后，DNA鏈可達(dá)2n..目前二十二頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)用PCR方法擴(kuò)增目的基因片段目前二十三頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)克隆載體目的基因若無合適的載體協(xié)助，就很難進(jìn)入受體細(xì)胞；為了保證目的基因能夠繁殖，必需將它與載體連接.理想的載體：1、較小的、能進(jìn)行復(fù)制的分子，具有高拷貝數(shù).2、具有較少的限制酶的切點(diǎn)，最好是單一切割點(diǎn)，以便所要克隆的DNA片段能被插入載體.目前二十四頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)克隆載體3、外源DNA片段插入載體后，不得使載體的復(fù)制功能喪失.4、具有某種明顯的標(biāo)志，例如抗藥性標(biāo)記，以便利用這些標(biāo)志篩選陽(yáng)性克隆.5、攜帶外源DNA的幅度較寬.6、生物防護(hù)是安全的.目前二十五頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)克隆載體pBR322目前二十六頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)克隆載體常用的克隆載體有：質(zhì)粒、噬菌體及病毒.質(zhì)粒是某些細(xì)菌中獨(dú)立于染色體外的共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA。質(zhì)粒具有復(fù)制能力，它的存在與否一般對(duì)細(xì)菌的生存沒有決定性影響。λ噬菌體是一種能感染大腸桿菌的病毒，其DNA中的1/3對(duì)噬菌體的生長(zhǎng)并非絕對(duì)需要，因此可被外源性DNA所替代，同時(shí)它可在體外包裝成病毒顆粒，高效感染大腸桿菌?？寺∪萘啃∮?3kb.目前二十七頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)克隆載體粘性質(zhì)粒（Cosmid）：是人工構(gòu)建的、兼具質(zhì)粒與噬菌體雙重特性的大容量載體?？寺∪萘靠蛇_(dá)45kb。酵母人工染色體：20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的大片段外源基因克隆體系，其克隆容量可達(dá)200-1000kb。目前二十八頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)DNA分子的體外重組所謂重組DNA分子就是把外源DNA分子（目的基因）插入到載體中，使兩種DNA分子連接起來.體外DNA分子重組有兩種方法：1、粘性末端連接法.2、平頭末端連接法.目前二十九頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)粘性末端連接法用同一種或兩種限制酶去消化載體和外源DNA分子，可產(chǎn)生相同的粘性末端，這些粘性末端能退火互補(bǔ)，進(jìn)一步用DNA連接酶將斷端封口，即可獲得重組DNA分子。用同一種限制酶處理外源DNA和載體，重組時(shí)可導(dǎo)致外源DNA特別是質(zhì)粒的自我環(huán)化.用堿性磷酸脂酶（不處理外源DNA分子）處理粘性末端的5‘磷酸基，能促使載體與外源DNA分子連接。重組體每條鏈仍殘留的一個(gè)缺口，待進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)可被修復(fù).目前三十頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)磷酸脂酶能防止載體的自我環(huán)化目前三十一頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)用兩種限制酶處理載體也可防止環(huán)化目前三十二頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)鈍性末端連接法用前述的化學(xué)合成法、逆轉(zhuǎn)錄法獲得的DNA或cDNA片斷，以及某些限制酶切生成的DNA片斷，均為鈍性末端，可用T4DNA連接酶連接，也可將其改造成粘性末端再行連接.1、加接頭：這種人工接頭含某種限制酶的單切點(diǎn)，用限制酶消化該接頭可產(chǎn)生粘性末端。2、加尾巴：應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶在載體與外源DNA分子上加上互補(bǔ)的同聚核苷酸，經(jīng)過退火可使兩者形成重組體.目前三十三頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)鈍性末端連接法末端轉(zhuǎn)移酶處理退火目前三十四頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)二、重組DNA引入宿主細(xì)胞和篩選鑒定重組DNA引入宿主細(xì)胞1、轉(zhuǎn)染：將噬菌體DNA引入宿主細(xì)胞的過程.2、轉(zhuǎn)化：將質(zhì)粒或染色體DNA引入宿主細(xì)胞的過程.轉(zhuǎn)化是否成功取決:1)制備感受態(tài)細(xì)胞;2)重組DNA避免受體細(xì)胞核酸酶的降解.重組體克隆的篩選與鑒定1、插入滅活法.2、噬菌斑形成篩選法.3、核酸雜交法.目前三十五頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)插入滅活法目前使用的質(zhì)粒載體都有抗藥標(biāo)記。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含有這種（些）抗生素的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，而未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌則不能生長(zhǎng)或被殺死。然而，當(dāng)限制酶作用于載體DNA的某一抗藥基因上并在此插入外源DNA時(shí)，載體上原有的抗藥基因即被破壞。由此重組體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，則對(duì)這個(gè)抗生素敏感，這樣便可篩選出轉(zhuǎn)化菌株。目前三十六頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)插入滅活法限制酶切轉(zhuǎn)化含四環(huán)素TA＋T目前三十七頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)三、克隆基因的表達(dá)外源基因在大腸桿菌體系中的表達(dá).外源基因在真核細(xì)胞體系中的表達(dá).目前三十八頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)四、基因工程的成就與展望在農(nóng)業(yè)上的成就與意義；在制藥工業(yè)中的成就與意義；在工業(yè)方面的成就與意義；癌癥的研究與治療；遺傳病的預(yù)防與治療.目前三十九頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)1、蛋白質(zhì)工程的概念

蛋白質(zhì)工程是研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，然后人為地設(shè)計(jì)一個(gè)新蛋白質(zhì)，并按這個(gè)設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)去改變其基因結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)?；蛘邚牡鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系出發(fā)，定向地改造天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，特別是對(duì)功能基因的修飾，也可以制造新型的蛋白質(zhì)。（一）、基因定點(diǎn)突變是指將基因的某一個(gè)或某些位點(diǎn)進(jìn)行人工替換或刪除的過程。（二）、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)依賴于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定和分子模型的建立，按照蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的理論基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)出比天然蛋白質(zhì)性能優(yōu)越的新型蛋白質(zhì)。五.蛋白質(zhì)工程目前四十頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)2、蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)

（一）、蛋白質(zhì)工程的理論設(shè)計(jì)活性設(shè)計(jì)：考慮被研究的蛋白質(zhì)的功能，涉及選擇化學(xué)基團(tuán)及其空間取向。專一性設(shè)計(jì)：指功能性蛋白質(zhì)在發(fā)揮其生理功能的時(shí)，總是與其他分子發(fā)生專一性相互作用?？蚣茉O(shè)計(jì)：是指對(duì)蛋白質(zhì)分子的立體設(shè)計(jì)。（二）、定點(diǎn)突變技術(shù)通過刪除或置換DNA片段中的核苷酸，使基因發(fā)生改變，從而產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)。改變DNA核苷酸序列的幾種方法：1.基因的化學(xué)合成.2.基因直接修飾法.3.盒式突變技術(shù).目前四十一頁(yè)\總數(shù)四十四頁(yè)\編于十七點(diǎn)3、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用示例

（一）、蛋白質(zhì)工程酶1.改變酶的催化活性；2.改變酶的底物專一性；3.提高酶的穩(wěn)定性；4.改變酶的反應(yīng)特性