目的基因的克隆

目的基因的克隆第1頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克?。涣硪活愂抢肞CR擴增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達。第2頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二APCR法PCR法定向擴增目的基因的基本原理PCR克隆目的基因的基本程序PCR盒式引物擴增法第3頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二使用PCR技術(shù)克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)所需的雙引物1.PCR法定向擴增目的基因的基本原理第4頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二5‘5‘目的基因5‘變性加熱5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘5‘5‘5‘加熱變性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加熱變性引物退火底物聚合123第5頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二由TaqDNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物中，其3’末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為TaqDNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆

2.PCR克隆目的基因的基本程序5’5’AATT5’5’PCR擴增產(chǎn)物T載體T7lacZMCSoriApr第6頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二3.PCR盒式引物擴增法染色體DNASau3A部分酶切加裝盒式接頭片段5‘端不含磷酸基團變性引物退火擴增第7頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二B基因文庫的構(gòu)建基因文庫的基本概念基因文庫的構(gòu)建程序基因組文庫重組克隆的排序第8頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二基因文庫的基本概念基因庫與基因文庫基因庫（genepool）特定生物體全基因組的集合（天然存在）

基因文庫（genelibraryorgenebank）從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式基因組文庫（含有全部基因）存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）

第9頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二基因文庫的基本概念基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然，cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫第10頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二基因文庫的基本概念基因文庫的完備性基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕蔲=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小

例如，人的單倍體DNA總長為2.9x109bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15kb，則構(gòu)建一個完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個克??；而當(dāng)完備性提高到0.9999時，基因文庫至少需要180萬個克隆第11頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二基因文庫的基本概念基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選第12頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二基因文庫的構(gòu)建程序基因組DNA的制備為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，

用于基因組文庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高AAAA用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長度一般在100kb左右如果先將細(xì)胞固定在低融點凝膠中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000kb大小的DNA片段第13頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二基因文庫的構(gòu)建程序基因組DNA的切割用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)第二，保證DNA片段大小均一超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控

連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！第14頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二基因文庫的構(gòu)建程序載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體l-DNA由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)粒考斯質(zhì)粒15kb25kb45kbBAC300kbYAC400kb用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌第15頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二基因文庫的構(gòu)建程序從基因文庫中篩選目的基因大型基因組文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成。除了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組文庫篩選均需多輪操作步驟第16頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二基因文庫的構(gòu)建程序從基因文庫中篩選目的基因密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆第17頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二基因文庫的構(gòu)建程序基因文庫構(gòu)建的技術(shù)性問題在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最應(yīng)引起重視的問題是：嚴(yán)禁外源DNA片段之間的連接！！！為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合：

將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級分離用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團

用TdT酶在DNA片段的末端上增補同聚尾末端第18頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二基因組文庫重組克隆的排序大型基因文庫（包括人的基因文庫）的構(gòu)建在技術(shù)上并不十分困難，如果一個YAC基因文庫的插入片段總和為整個基因組的十倍以上時，一般就能從基因文庫中調(diào)出任何一段DNA序列。然而基因文庫的克隆都是隨機序列，必須將所有的克隆排列成一個像天然染色體DNA上所表現(xiàn)出的信息順序。這項工作的工作量可能遠大于基因組文庫的構(gòu)建，屬于基因文庫的后期制作第19頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二基因組文庫重組克隆的排序?qū)我坏腨AC克隆插入DNA片段用限制性內(nèi)切酶分布均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素然后再用Sau3AI或MboI將末端標(biāo)記的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每10個YAC克隆走在同一塊板上，形成10個克隆的特征性DNA指紋圖譜電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個克隆DNA的指紋圖譜有部分相同的，則其兩個YAC片段就有互相重疊的可能性，于是這兩個YAC克隆的DNA片段克隆在染色體上是排列一起的

酶切片段末端標(biāo)記法第20頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二酶切片段末端標(biāo)記法HHHHSSSSSSSSSSSSSSSSSSS單一克隆指紋圖譜十克隆指紋圖譜載體DNA克隆DNA第21頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二基因組文庫重組克隆的排序?qū)⑷舾蒠AC克隆固定在薄膜上，并復(fù)制二十份薄膜；合成20種不同序列的短探針，其序列是隨機的用20種探針隨機定位雜交（一對一）20份YAC克隆薄膜如果某兩個克隆同時對同一種探針呈現(xiàn)雜交陽性反應(yīng)，則這兩個克隆有可能是相互重疊的。若將雜交陽性結(jié)果記為“1”，而陰性結(jié)果記為“0”，可清晰地列成一張表，最終排出上述YAC克隆的排列順序隨機探針聯(lián)合雜交法第22頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二CcDNA法cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略cDNA法分離目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性第23頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mRNAcDNA第一鏈的合成

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5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs第24頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二cDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

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3’KlenowdNTPsS1第25頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二cDNA第二鏈的合成

DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

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3’3’T4-DNAligase第26頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二cDNA第二鏈的合成

dCTPTdT引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

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3’NaOH退火KlenowdNTPsTerminaldeoxynucleotidyltransferaser第27頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略雙鏈cDNA的克隆

雙鏈平頭的cDNA通常可以使用下列三種方法克隆入載體中：

平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收

平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收

第28頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二cDNA法分離目的基因的基本程序完備分離程序

提取細(xì)胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子篩選時，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等第29頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二cDNA法分離目的基因的基本程序特異分離程序

提取細(xì)胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進行克隆特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等

第30頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二cDNA法分離目的基因的基本程序差異分離程序

利用兩組細(xì)胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細(xì)胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進而研究其生物學(xué)功能第31頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)

細(xì)菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在細(xì)胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因

第32頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二D化學(xué)合成法化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略化學(xué)合成的單元操作DNA化學(xué)合成的用途第33頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成化學(xué)合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：小片段粘接法：

混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

第34頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成補釘延長法：

混合退火根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合第35頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成大片段酶促法：

混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合第36頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成上述三種方法各有利弊：化學(xué)合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學(xué)合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為95%則合成50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%第37頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略探針等寡聚核苷酸合成在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其編碼的DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNA法得到的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子由于大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設(shè)計時必須考慮下列問題：生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針探針應(yīng)具有足夠的長度，通常在17-20個核苷酸之間探針內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互補區(qū)域第38頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略探針等寡聚核苷酸合成某段連續(xù)的氨基酸序列CysMetAspGluMetLysArgAsnIle所有可能的DNA序列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATACTGATGGGTTCCGACGGCGTCGC設(shè)計的簡并探針序列TGTATGGACGAIATGATGTATGGATGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGATGAIATGAAG此外還可以參考各種生物體的EST數(shù)據(jù)庫進行傾向性簡并序列設(shè)計expressedsequencetag第39頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二化學(xué)合成的單元操作化學(xué)合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應(yīng)，包括：基團保護、分離、縮合、分離、去保護五大操作單元。從反應(yīng)機理上來講，DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設(shè)計的第40頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二DNA化學(xué)合成的用途合成天然基因修飾改造基因

設(shè)計新型基因

制備探針、引物、接頭

如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等

基因等第41頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二E鳥槍法鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法操作的改進鳥槍法克隆目的基因的局限性第42頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二”鳥槍法(Shotgun)”.序列組裝原理:直接從已測序的小片段中尋找彼此重疊的測序克隆,然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸.優(yōu)點:不需預(yù)先了解任何基因組的情況.ABCABCABCABC小片段測序計算機拼裝第43頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二DNA的鳥槍法測序的主要步驟

第一，建立高度隨機、插入片段大小為2kb左右的基因組文庫。第二，高效、大規(guī)模的末端測序。第三，序列集合。第四，填補缺口。第44頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略隨機克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離

第45頁，共54頁，2023年，2月20日，星期二鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體DNA的切斷

超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端

全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整與載體連接

如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為轉(zhuǎn)化受