光動(dòng)力聯(lián)合vp3基因治療能顯著增強(qiáng)鼻咽癌移植瘤的療效

光動(dòng)力治療聯(lián)合VP3治療能顯著增強(qiáng)鼻咽癌移[]構(gòu)建好的VP3質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2，建立細(xì)胞系，并移植至鼠致瘤，將組：PDTCNE-2組；E組：PDT+空載體轉(zhuǎn)染組；F組：PDT+VP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。在腫瘤形成后行光動(dòng)力治療（photodynamictherapyPDTPDTVP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組腫瘤治療或者光動(dòng)力治療有更顯著的鼻咽癌效應(yīng)。[]鼻咽癌VP3光動(dòng)力治療治PDT是治療的一種新的激光醫(yī)療技術(shù)，它利用光敏劑能選擇性在腫瘤組而腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療的目的。VP3是雞貧血（chickenanemiaCAV）中發(fā)現(xiàn)（apoptinapoptin治療的兩者聯(lián)合治療可能會(huì)明顯提高的治療療效本實(shí)驗(yàn)小組前期已經(jīng)在體外實(shí)驗(yàn)中PDT聯(lián)合凋亡VP3較單一的方法PDT或過(guò)表達(dá)VP3能明顯增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞CNE-2的效果，本實(shí)驗(yàn)擬在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中觀察該治療方法對(duì)移植瘤pcDNA3.1(-)-His質(zhì)粒由中南大學(xué)病理生理學(xué)教研室提供，PcDNA3.1(-)Hre2.Grp78p.VP3-細(xì)胞由中南大學(xué)腫瘤提供。BALB/C鼠，4~6，雄性，體重18~22g，購(gòu)自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鼠抗VP3單克隆抗體購(gòu)自SantaCruzBiotechology，羊抗小鼠IgG購(gòu)自BosterBiologicalTechnology。光敏劑5-ALA，購(gòu)自Sigma公司。半導(dǎo)體激光LA-D-635-500，波長(zhǎng)為635nm，購(gòu)自中國(guó)廣州光電1.2.細(xì)胞培養(yǎng)CNE-2細(xì)胞在加入10%胎牛GIBICO的RPMI1640培養(yǎng)（GIBICO）37℃、5％CO2，培養(yǎng)箱中孵育。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法采用脂Lip2000(invitrogen)分別將真核質(zhì)粒PVP3和空白質(zhì)粒164014天，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。RT-PCR檢測(cè)、空載體轉(zhuǎn)染E-2CNE-2三種細(xì)胞和移植瘤組織中VP3mRNA的表達(dá)。使用Trizol(invitrogen）一步法提取細(xì)胞或組織的總RNA,步驟按完成。VP3引物序列為上游引物5‘-CGGAATTCATGAAGGCTCTCCAAGAAG-3’下游引物5‘-CGGAATTCTTACAGTCTTG-3’由invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)條件如VP3、GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用自動(dòng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(Chemilmager5500，AlphaInnotech公司)圖像，測(cè)定條帶積分光密度值(MetaMorph，UIC公司)，以GAPDH內(nèi)參照值標(biāo)準(zhǔn)化VP3值，得到VP3相對(duì)含量，3次取平均值。Western-blottingVP3組織加入適量裂解液及蛋白酶抑制劑，超聲破碎后，4℃、12000×g15min取上清液。5min40ug580V、15min12120V、80min進(jìn)行十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠(SDS)80V100min將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜取出后經(jīng)5％脫脂奶粉封閉，洗膜后加入一抗(抗apoptin，1：1000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜。次日加入二抗(IgG，1：2000稀釋)常溫孵育1h，加入ECL試劑暗室，經(jīng)顯影定影后應(yīng)用自動(dòng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)圖像，β-actinapoptin／β-actinVP3的相對(duì)表達(dá)3次取平均值。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)凋亡素（Apoptin）表達(dá)采用S-P法,移植瘤組織切片經(jīng)二甲苯30mL／L的H20210minPBS沖洗后，將其置入0．0lmol／L，pH6.0的檸檬酸緩沖液沸水浴10min，以充分抗原．切片室溫冷卻后．PBS沖洗，滴加非免疫，室溫封閉15min，然后滴加小鼠抗人Apoptin抗體(1：15min，PBSDAB2-3min后，PBS終止細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)均勻分布的棕黃色顆粒為表達(dá)陽(yáng)性，并用以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)表達(dá)程度強(qiáng)度評(píng)分：未(0分)、淺黃色(1分)、淺棕色(2分)和深棕色(3分)；觀察結(jié)果評(píng)分，即陽(yáng)(3分)和>75％(4分)．染色強(qiáng)度評(píng)分和觀察結(jié)果評(píng)分的乘積為表達(dá)程度，≥2分認(rèn)為是表達(dá)陽(yáng)．流式細(xì)胞儀測(cè)定腫瘤凋亡將腫瘤組織塊標(biāo)本用生理鹽水漂洗干凈，剪切200500rpm/min的速度離心5,2次,棄上5μlAnnexinV-FITC，輕輕混勻。室溫鼠移植瘤模型的建立及培養(yǎng)將36只成瘤鼠分成6組，每組6只，分別為A組：野CNE-2組；BCD+CNE-2E組：光動(dòng)力+空載體轉(zhuǎn)染組；F組：光動(dòng)力+質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。鼠致瘤前1天，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞融合90%左右時(shí)，用胰酶消化，無(wú)1640培基洗滌并計(jì)數(shù)，用無(wú)1640培基將3種細(xì)胞稀釋到2×106/200ul，將200ul細(xì)胞懸液注入鼠單側(cè)腋部皮下，致瘤后10天，腫瘤直徑達(dá)到0.5±0.2cm時(shí)進(jìn)行分組。鼠由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部瘤體積=1/2長(zhǎng)徑×2。腫瘤抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤體積/對(duì)照組平均瘤體積)×100%。所30天處死動(dòng)物，取出腫瘤稱(chēng)瘤重，此后將瘤組織放入預(yù)冷的生理鹽水內(nèi)，洗3—480"CRT-PCRWestern-blotting檢測(cè)。用于免疫組化分析的標(biāo)本經(jīng)40g／L固定。制光敏劑5-ALA所需濃度1mg/ml,依據(jù)鼠體重，按5mg/kg體重注射至腫瘤周?chē)?8小2cm,1cm220min,120J/cm2[2-4]1次、共三次。不需2.0SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，均數(shù)以X±S表示。兩個(gè)樣本均數(shù)Independent-SampleTtestOne-wayANOVA分析，多樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD法。P＜0.05表示差異有顯著性意義。22.1mRNA與蛋白水平檢測(cè)CNE-2細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)然后VP3的表達(dá)情況利用RT-PCR檢測(cè)VP3mRNAPVP3CNE-2VP3mRNA的表達(dá)量分AapoptinPVP3CNE-2apoptin蛋白表達(dá)CNE-25.66.3倍(P<0.001,1B）2.3各組移植瘤中VP3的表達(dá)情況利用RT-PCR檢測(cè)VP3mRNA水平表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDT+質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組VP3mRNA表達(dá)最高，為其他組的3.2~3.6（P<0.001，圖A（P<0.001apoptin的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)apoptin主要表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)，PVP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組表達(dá)強(qiáng)度（P<0.001，DT+載體轉(zhuǎn)染組和野生型E-2組（P<0.001PDT+質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組表達(dá)強(qiáng)度為最高（圖3，表12.3各組移植瘤體積及重量比較通過(guò)對(duì)各組鼠移植瘤體積測(cè)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PVP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)（P<0.001PDT+ （P<0.001，轉(zhuǎn)染組生長(zhǎng)曲線(xiàn)為最低（圖4A。通過(guò)對(duì)各組鼠移植瘤重量的測(cè)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PVP3質(zhì)（P<0.001 E-2組的0.39和（P<0.01，PD+圖2.4各組移植瘤凋亡情況PDT+（P<0.001PD+36.5%，PVP331.7%（43鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma）是我國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)的，占頭頸部惡性腫瘤首位，已嚴(yán)重地危害了人們的生命健康［5］95%以上的為非角化癌,對(duì)差，副作用大，5年生存率不到20%[]。再者鼻咽部部位隱蔽，周?chē)兄匾M織，手術(shù)，手術(shù)效果不佳。因此增強(qiáng)放射敏感性，提高5年生存率及生活質(zhì)量是臨非常棘手的難題。自從1978Dougherty首次用PDT治療皮膚和皮下以來(lái)，光動(dòng)力學(xué)療法已直接作用腫瘤部位。PDT為治療提供了一個(gè)新的方法。但PDT也存在一些不足之及光敏劑的光敏活性等都可影響PDT對(duì)腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)；②PDT對(duì)氧具有依賴(lài)性，PDT的耗氧將使受照射腫瘤組織進(jìn)一步缺氧從而大大削弱PDT對(duì)腫瘤的效應(yīng)；③PDT光敏劑5-ALA進(jìn)行PDT治療并聯(lián)合凋亡素VP3進(jìn)行鼻咽癌移植瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)先用前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)驗(yàn)證好的PVP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞CNE-2，以空白質(zhì)粒為胞株構(gòu)建鼠移植瘤模型，鼠移植瘤模型分為6組，分別為A組：野生型CNE-2組；B組：空載體轉(zhuǎn)染組；C組：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；D組：野生E-2組；E組：PDT+空載體轉(zhuǎn)染組；F組：PDT+10D組、EF3次PDT治療。通過(guò)對(duì)各組鼠移植瘤的體積測(cè)量繪制出生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖，發(fā)現(xiàn)F組的生長(zhǎng)曲線(xiàn)最FPDT+空載體轉(zhuǎn)染。這些結(jié)果說(shuō)明PDT+VP3對(duì)鼻咽癌的治療療效高于單獨(dú)使用PDT或VP3治療。PVP3Hresgrp-78PDT+質(zhì)粒轉(zhuǎn)Hres能乏氧和放射應(yīng)急下能顯著增強(qiáng)下游基腫瘤-放射治療研究，證實(shí)啟動(dòng)子Hres.Egr-1有乏氧和放射誘導(dǎo)性。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78（glucose-regulatedprotein-78,grp-78）啟動(dòng)子是一種應(yīng)急敏感的啟動(dòng)子，其在應(yīng)急反應(yīng)時(shí)能選擇性調(diào)控的表達(dá)。Luna等[11]構(gòu)建的G1NaGrpTK逆轉(zhuǎn)錄載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，聯(lián)合PDT治療，發(fā)現(xiàn)PDT能夠誘導(dǎo)TK在細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)。類(lèi)似的結(jié)果在Dong等[12]的實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)組期的體外實(shí)驗(yàn)中觀察到構(gòu)建了Grp78PDTGrp78啟動(dòng)子的聯(lián)合PDT。作為一種實(shí)體瘤，存在相當(dāng)部分的乏氧細(xì)胞，尤其是放療后復(fù)發(fā)或殘?jiān)畹哪[瘤組織乏氧細(xì)胞，再者PDT治療過(guò)程中造成氧耗，因此在grp-78啟動(dòng)子前嵌合乏氧敏感性的反應(yīng)元件HresVP3轉(zhuǎn)錄活性?？傊琍DT聯(lián)合VP3治療較單獨(dú)的VP3治療或者光動(dòng)力治療對(duì)鼻咽癌有更強(qiáng)的效果，1ShenYQ,ShenkTE.esandapoptosis.CrurentOpinGenetDevelop,1995,5:105-2IvanaCecic,BrandonStott,MladenKorbelikAcutephaseresponse-associatedsystemicneutrophilmobilizationinmicebearingtumorstreatedbyphotodynamictherapyInternationalImmunopharmacology6(2006)1259–1266NobuhiroNishiyamaYujiMorimotoWoo-DongJangKazunoriKataokaDesignanddevelopmentofdendrimerphotosensitizer-incorporatedpolymericmicellesforenhancedphotodynamictherapyAdvancedDrugDeliveryReviews61(2009)327–338NinaDragicevic-CuricSusannaGra¨feVolkerAlbrechtAlfredFahrTopicalapplicationoftemoporfin-loadedinvasomesforphotodynamictherapyofsubcutaneouslyimntedtumoursinmice:ApilotstudyJournalofPhotochemistryandPhotobiologyB:Biology91(2008)41–50ChowE,PayneD,O'SullivanB,etal.Radiotherapyaloneinpatientswithadvancednasopharyngealcancer:comparisonwithanintergroupstudy.Iscombinedmodalitytreatmentreallynecessary?RadiotherOncol2002;63:269–74.GomerCJ,RuberN.FerrarioA,etal.PropertiesandapplicationsofPDT.Radiat羅樂(lè),鄒俊,鄧善熙,等.光動(dòng)力學(xué)療法[J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版HprnungR,WaltH,CromptonNE,eral.m2THPC-medictedphotodynamictherapy(PDT)doesnotinduce atochemotherapy,radiotherapyonPDTonhumanbreastcancercellinLunaMC,ChenX,WongS,eral.Enhancedphotodynamictherapyefficacywithinduciblesuicidegenetherapycontrolledbythegrppromoter.CancerRes.2002Mar1;62(5):1458-1461.DongD,DubeauL,BadingJ,etal.Spontaneousandcontrollableactivationofsuicidegeneexpressio