蛋白質(zhì)的分離和純化

（優(yōu)選）蛋白質(zhì)的分離和純化目前一頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)一、蛋白質(zhì)的分離

2.根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。Q:下列蛋白質(zhì)如何提?。克嵝缘鞍踪|(zhì)；水溶性蛋白質(zhì)；脂溶性蛋白質(zhì)；

偏堿性溶液透析液（中性緩沖液）有機(jī)溶劑原理1.根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇不同的破碎細(xì)胞的方法（如研磨法、超聲波法、酶解法等），使各種蛋白質(zhì)釋放出來。目前二頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)一、蛋白質(zhì)的分離

1.抽提方法：（1）酸性蛋白質(zhì)：

（2）水溶性蛋白質(zhì)：

（3）脂溶性蛋白質(zhì)：偏堿性溶液透析液（中性緩沖液）有機(jī)溶劑目前三頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)二、常用的分離方法1.離心沉降法2.薄膜透析法3.凝膠色譜法4.電泳法目前四頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)

1.離心沉降法

原理：通過控制離心速率，使得分子大小、密度不同的物質(zhì)發(fā)生分層沉降，從而分離出不同種類蛋白質(zhì)。離心時(shí)相對分子質(zhì)量大的物質(zhì)先沉淀。目前五頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)2.薄膜透析法

（1）原理：利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜的特性，可將蛋白質(zhì)與其他小分子化合物分離開。（2）方法：將待分離的蛋白質(zhì)溶液裝入用半透膜制成的透析袋內(nèi)，再將透析袋放入透析液中便可進(jìn)行透析。

半透膜能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。

目前六頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)

小分子雜質(zhì)（無機(jī)鹽、單糖、二糖及氨基酸等）從透析袋中出來，而蛋白質(zhì)留在袋內(nèi)。目前七頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)3.蛋白質(zhì)分離的方法：（1）透析法目前八頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)3.凝膠色譜法(1)凝膠：由多糖類化合物（如葡聚糖、瓊脂糖）構(gòu)成的多孔球體，內(nèi)含許多貫穿的通道(2)原理：大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；小分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢。(3)作用：使樣品中分子大小不同的蛋白質(zhì)按順序分離出來目前九頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)下圖中最早洗脫下來的是什么？為什么？目前十頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)目前十一頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)分子量大小直徑大小大于凝膠顆粒空隙直徑，被阻擋在顆粒的外面小于凝膠顆粒空隙直徑，可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動方式垂直向下移動垂直向下移動，無規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動速度較快較慢運(yùn)動路徑較短較長洗脫次序先從凝膠柱洗脫出來后從凝膠柱洗脫出來目前十二頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)A．路程較長，移動速度較慢B．路程較長，移動速度較快C．路程較短，移動速度較慢D．路程較短，移動速度較快D目前十三頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進(jìn)行過程可表示為圖中哪一個(gè)B目前十四頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)

4.電泳

(1)概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。

方向：向著與其所帶電荷相反的電極移動。

(2)泳動速度和方向：

速度：帶電分子的遷移速度跟各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小,形狀有關(guān)。

一般來說，帶電顆粒所帶凈電荷越多，直徑越小，越接近于球形，則在電場中的泳動速度越快；反之，則越慢。

電泳分離時(shí)，電荷量相差越大的物質(zhì)相距越遠(yuǎn)。目前十五頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)醋酸纖維薄膜電泳瓊脂糖凝膠電泳SDS—聚丙稀酰胺凝膠電泳：測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量。

SDS能使蛋白質(zhì)完全變性，SDS所帶電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有電荷。

遷移率取決于分子大小。(3)類型（載體）:目前十六頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異目前十七頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)下列有關(guān)蛋白質(zhì)提取和分離的說法，錯誤的是 (

)A.透析法分離蛋白質(zhì)的原理是利用蛋白質(zhì)不能通過半透膜的特性B.采用透析法使蛋白質(zhì)與其他小分子化合物分離開來C.離心沉降法通過控制離心速率使分子大小、密度不同的蛋白質(zhì)分離D.蛋白質(zhì)在電場中可以向與其自身所帶電荷相同的電極方向移動D目前十八頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)三、血紅蛋白的提取和分離

1.樣品處理

2.粗分離

3.純化

4.純度鑒定目前十九頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)1.樣品處理（1）洗滌紅細(xì)胞（低速短時(shí)離心，生理鹽水）目的：去除雜蛋白。

血樣先低速短時(shí)離心分離紅細(xì)胞，然后吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。低速離心：防止白細(xì)胞沉淀。緩慢攪拌：防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。檸檬酸鈉：防止血液凝固。目前二十頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)（2）血紅蛋白的釋放

在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。注：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。甲苯：溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。蒸餾水作用：使紅細(xì)胞吸水脹破目前二十一頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)1、洗滌紅細(xì)胞的目的是

A.去除血清

B.去除雜蛋白C.除去血小板D.除去水B目前二十二頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)2、選用紅細(xì)胞作為分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料，有何好處（）A.血紅蛋白是有色蛋白B.紅細(xì)胞無細(xì)胞核C.紅細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高D.紅細(xì)胞DNA含量高A目前二十三頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)3、為了提取血紅蛋白，從學(xué)校附近的屠宰場取新鮮的豬血，對豬血處理的正確操作是

()A.要在采血容器中預(yù)先加入抗凝血劑檸檬酸鈉B.重復(fù)洗滌直到上清液呈紅色為止C.將離心后的血細(xì)胞加入清水緩慢攪拌D.取血回來后，馬上進(jìn)行高速長時(shí)間離心A目前二十四頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)

（3）分離血紅蛋白溶液

將攪拌好的混合溶液中速長時(shí)離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透明的甲苯層，第二層為脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第三層是血紅蛋白的水溶液，第四層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。目前二十五頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)分離血紅蛋白溶液有機(jī)溶劑（無色透明的甲苯層）脂類物質(zhì)（白色脂溶性物質(zhì)沉淀層）血紅蛋白溶液（紅色透明液體）紅細(xì)胞破碎物沉（暗紅色沉淀物）目前二十六頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)

取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液（PH=7）中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。【注】緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液pH的影響而保持pH穩(wěn)定。使用PH=7的磷酸緩沖液，有利于維持血紅蛋白的正常特性。2.粗分離---薄膜透析法目前二十七頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)1、下列操作正確的是（）A.分離紅細(xì)胞時(shí)采用低速長時(shí)間離心B.紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可C.分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心D.透析時(shí)要用20mmol/l的磷酸緩沖液，透析12hD目前二十八頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)2、在蛋白質(zhì)的提取和分離中，關(guān)于對樣品處理過程中，分析無誤的是（）A

洗滌紅細(xì)胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無機(jī)鹽B

洗滌時(shí)離心速度過小，時(shí)間過短，白細(xì)胞等會沉淀，達(dá)不到分離的效果C

洗滌過程選用0.1%的生理鹽水D

透析的目的是去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)D目前二十九頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)

3.純化--凝膠色譜法

去除相對分子量大的雜質(zhì)蛋白目前三十頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)凝膠色譜柱的裝填

凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。

凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹噥y洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。目前三十一頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)

洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。凝膠色譜柱的裝填50cm高目前三十二頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)樣品加入與洗脫

①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。

⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）

目前三十三頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)1、在裝填凝膠柱時(shí)，不能有氣泡存在的原因()A、氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果B、氣泡阻礙蛋白質(zhì)的運(yùn)動C、氣泡與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)D、氣泡在裝填凝膠的時(shí)候，使凝膠不緊密A目前三十四頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)2、樣品的加入和洗脫的操作不正確的是A

加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B．加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C．等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D．用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面A目前三十五頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)4.純度鑒定---SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳目前三十六頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)

蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白釋放；分離血紅蛋白溶液。（2）粗分離：薄膜透析法除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。（以血紅蛋白的分離純化為例）三、蛋白質(zhì)提取分離的程序目前三十七頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)1、下列關(guān)于DNA和血紅蛋白的提取與分離屬于的敘述中，錯誤的是()A.可用蒸餾水漲破細(xì)胞的方法從豬紅細(xì)胞中提取到DNA和蛋白質(zhì)B.用不同濃度的NaCl溶液反復(fù)溶解于析出DNA可去除部分雜質(zhì)C.透析法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)是利用蛋白質(zhì)不能通過半透膜的特性D.進(jìn)一步分離與純化血紅蛋白可用凝膠色譜法、離心法、電泳法等A目前三十八頁\總數(shù)四十二頁\編于十八點(diǎn)2、下列關(guān)于血紅蛋白提取和分離實(shí)驗(yàn)中樣品處理步驟的描述，正確的是()A.紅細(xì)胞的洗滌：加入蒸餾水，緩慢攪拌，低速短時(shí)間離心B.血紅蛋白的釋放：加入生理鹽水和甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢鐲.分離血紅蛋白：