第四章 中藥制劑的含量測(cè)定

第四章中藥制劑的含量測(cè)定第1頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)含量測(cè)定的目的與意義

在我國(guó)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，[鑒別]、[檢查]和[含量測(cè)定]項(xiàng)目是判定中藥制劑質(zhì)量?jī)?yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。中藥制劑的鑒別是研究某種原料藥或成分的存在與否，從而判定藥物的真?zhèn)?，而含量測(cè)定項(xiàng)目是研究某種成分的含量高低是否符合規(guī)定來判定藥物的優(yōu)劣。中藥制劑的含量測(cè)定是質(zhì)量控制中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。通過測(cè)定制劑中有效成分、毒性成分或某些指標(biāo)性成分的含量來衡量其制劑工藝的穩(wěn)定性和中藥材的質(zhì)量?jī)?yōu)劣，以保證中藥制劑的質(zhì)量，達(dá)到臨床用藥安全、有效和中藥制劑進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)的需要。

第2頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

中藥制劑樣品的基質(zhì)和成分組成十分復(fù)雜，而且樣品中被測(cè)成分往往含量較低，因此需要對(duì)樣品進(jìn)行各種處理，使其符合所選定分析方法的要求。樣品處理的主要作用有：

將被測(cè)成分有效地從樣品中釋放出來，并制成便于分析測(cè)定的穩(wěn)定試樣。

除去雜質(zhì)、純化樣品，以提高分析方法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度。

富集濃縮或進(jìn)行衍生化，以測(cè)定低含量被測(cè)成分。衍生化不僅可提高檢測(cè)器的靈敏度，還可以提高方法的選擇性。

使試樣的形式及所用溶劑符合分析測(cè)定的要求。

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一、樣品的粉碎樣品的粉碎有兩個(gè)目的：是保證含量測(cè)定所取樣品均勻而有代表性，提高測(cè)定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度；是使樣品中的被測(cè)組分能更快地完全提取出來。粉碎時(shí)注意事項(xiàng)：不要粉碎得過細(xì)。樣品粉碎得過細(xì)，在樣品提取時(shí)，會(huì)造成過濾困難，因此可視實(shí)際情況進(jìn)行粉碎過篩。避免污染樣品。在粉碎樣品時(shí)，要盡量避免由于設(shè)備的磨損或不干凈等原因而玷污樣品，防止粉塵飛散或揮發(fā)性成分的損失。過篩時(shí)，通不過篩孔的部分顆粒決不能丟棄，必須反復(fù)粉碎或碾磨，讓其全部通過篩孔。第4頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

二、樣品的提取對(duì)于中藥材和固體制劑樣品，在粉碎后，取粉末適量精密稱定，首先用溶劑進(jìn)行提取，使被測(cè)組分和某些共存組分從中溶解出來（前者必須完全溶出），與濾渣分離后，再對(duì)被測(cè)組分進(jìn)行含量測(cè)定。下面介紹幾種常見的提取方法：冷浸法回流提取法連續(xù)回流提取法超聲提取法超臨界流體提取法第5頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

（一）冷浸法按所需準(zhǔn)確度要求稱取一定量樣品置于帶塞容器內(nèi)，搖勻后放置，浸泡提取，溶劑用量為樣品重量的10～50倍，并稱重。浸泡時(shí)間12～24小時(shí)，浸泡期間應(yīng)注意經(jīng)常振搖，浸泡后再稱重，補(bǔ)足溶劑充分搖勻，浸泡后的溶液，可取部分測(cè)定，也可全部測(cè)定。部分測(cè)定法（即等量法）是將浸泡后的溶液，用適宜濾器過濾，精密量取一定量體積的濾液，與一定重量的樣品相當(dāng)，進(jìn)行測(cè)定。此法不適宜揮發(fā)性較大的提取溶劑。全部測(cè)定法（即總量測(cè)定法）是將浸泡后的溶液濾過，濾渣充分用溶劑洗滌至提取完全，合并濾液及洗液，濃縮或蒸干得殘留物用另一溶劑溶解，定量轉(zhuǎn)入容量瓶，稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)行測(cè)定。此法可克服部分測(cè)定法的缺陷，且提取時(shí)溶劑用量不必精密加入。第6頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（一）冷浸法另外全部測(cè)定法中提取液的濃縮蒸干，可根據(jù)具體情況采用下列方法：常壓或減壓蒸發(fā)，后者具有溫度低、速度快，適于對(duì)熱不穩(wěn)定樣品之優(yōu)點(diǎn)；自然揮散或氮?dú)饬飨麓蹈?。適于小體積樣品和揮發(fā)性溶劑，氮?dú)饬髂芊乐寡趸焕鋬龈稍铮ǔ樗芤海?，更適于熱不穩(wěn)定的樣品。冷浸法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，適于熱不穩(wěn)定的樣品，且提取雜質(zhì)少。其缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)、費(fèi)溶劑。第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

第7頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）回流提取法它是將冷浸法中的帶塞容器換成回流裝置，用單一溶劑或混合溶劑于水浴上加熱回流提取，其余操作方法同冷浸法。優(yōu)點(diǎn)：1、提取效率高于冷浸法；2、且可縮短提取時(shí)間，每次提取時(shí)間為0.5～2小時(shí)，直至提取完全為止。缺點(diǎn)：1、提取雜質(zhì)較多；2、該法對(duì)熱不穩(wěn)定或具有揮發(fā)性的成分不宜使用。第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

第8頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

（三）連續(xù)回流提取法樣品置索氏提取器中，利用遇熱可以揮發(fā)的溶劑進(jìn)行反復(fù)提?。ㄏ喈?dāng)于總是在使用新鮮溶劑提?。话闾崛?shù)小時(shí)方可完全。優(yōu)點(diǎn)：1）無需過濾，提取完全后取下虹吸回流管，就可回收溶劑，再用適宜溶劑溶解，定容，進(jìn)行測(cè)定。2）提取效率高，所需溶劑少，提取雜質(zhì)少，操作簡(jiǎn)便。缺點(diǎn)：受熱易分解的成分不宜使用。第9頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

（四）超聲提取法

樣品置適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入提取溶劑，放入超聲振蕩器中進(jìn)行提取。一般樣品30分鐘內(nèi)即可完成，最多不超過1小時(shí)。優(yōu)點(diǎn)：超聲提取能使樣品粉末更好地分散于溶劑中提高提取效率和提取速度。（超聲的助溶作用）缺點(diǎn)：促使化學(xué)反應(yīng)發(fā)生（如氧化還原反應(yīng)、大分子化合物的降解和解聚合作用等）。

對(duì)于由浸膏制成的固體制劑，用上述方法提取時(shí)，通常是精密稱取適量藥粉于量瓶中，定量加適當(dāng)溶劑提取后，以干燥濾紙過濾，棄去濾液，取續(xù)濾液（防止濾紙吸附或污染被測(cè)組分），按部分測(cè)定法測(cè)定。第10頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

（五）超臨界流體提取法（Supercritical-fluidextraction,SFE）它是以超臨界流體（常用CO2）作提取溶劑，有效、快速提取固體或半固體中的被測(cè)成分的樣品預(yù)處理新技術(shù)。超臨界流體（SF）是指高于臨界壓力（Pc）和臨界溫度（Tc）時(shí)所形成的單一相態(tài)，它既不是液體，又不是氣體，而具如下特性：對(duì)樣品組分溶解能力強(qiáng)。超臨界流體（SF）的密度與液體的相近（如CO2超臨界流體的密度為0.3～0.9g/cm3），而其具有與液體相似的溶劑作用；2)有利于樣品中的被測(cè)成分?jǐn)U散進(jìn)入SF中。SF的粘度與氣體相近，比液體的略低2個(gè)數(shù)量級(jí)，擴(kuò)散系數(shù)卻比液體的高1個(gè)數(shù)量級(jí)以上，使其具有良好的傳質(zhì)性能；第11頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3)

SF能使提取效率和提取速度大大提高。SF的表面張力幾乎為零，而較容易滲透進(jìn)樣品基質(zhì)空隙中，有利于SF與樣品的充分接觸；4)同一種SF在不同溫度和壓力下可以提取極性或分子大小都不相同的化學(xué)成分。SF的密度、粘度和擴(kuò)散系數(shù)等都與溫度、壓力和流體組成有關(guān)。溫度和壓力稍高于臨界點(diǎn)時(shí)，SF的壓縮系數(shù)最大，壓力的微小變化將導(dǎo)致較大的密度變化，而控制密度就可控制SF對(duì)溶質(zhì)的溶解能力，目前也常用升壓力（即升密度）提取法進(jìn)行分步提取。最常用的SF是CO2，它的性質(zhì)穩(wěn)定，使用安全，價(jià)格低廉，臨界點(diǎn)低（Tc=31℃和Pc=7.4MPa），易于操作。

第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

第12頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第13頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

SFE具有優(yōu)點(diǎn)：速度快萃取效率高、方法準(zhǔn)確度高、選擇性較高、節(jié)省溶劑、易于自動(dòng)化，可避免使用易燃，有毒的有機(jī)溶劑，能與色譜和光譜等分析儀器直接聯(lián)用的特點(diǎn)。SFE不僅常用于熱不穩(wěn)定成分或揮發(fā)性成分的萃取，而且也越來越多地用于熱穩(wěn)定性成分的萃取。缺點(diǎn)：對(duì)設(shè)備要求高。第14頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

三、樣品的分離凈化（一）沉淀法原理：它是基于某些試劑與被測(cè)成分或雜質(zhì)生成沉淀，分離沉淀或保留溶液以得到精制的方法。這種方法須注意：1）過量的試劑若干擾被測(cè)組分的測(cè)定，則應(yīng)設(shè)法除去；2）大量雜質(zhì)以沉淀形式除去時(shí)，被測(cè)成分應(yīng)不因產(chǎn)生共沉淀而損失；3）被測(cè)組分生成沉淀時(shí)，其沉淀經(jīng)分離后可重新溶解或直接用重量法測(cè)定。第15頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

（二）蒸餾法原理：利用某些被測(cè)成分具有揮發(fā)性，可采用蒸餾法，收集餾出液進(jìn)行含量測(cè)定，或某些成分經(jīng)蒸餾分解生成揮發(fā)性成分，利用分解產(chǎn)物（要求結(jié)構(gòu)明確）進(jìn)行測(cè)定。目前以水蒸氣蒸餾法應(yīng)用較多。1）它可分為共水蒸餾法（即直接加熱法）、通水蒸汽蒸餾法和水上蒸餾法。如中藥制劑中的揮發(fā)油，某些小分子生物堿（麻黃堿、於堿、檳榔堿）及丹皮酚等，都可用蒸餾法提取和分離凈化。2）為了使揮發(fā)性成分更完全地蒸餾出來，有時(shí)也可用鹽析作用，即在蒸餾液中加入一定量的無機(jī)鹽，常用NaCl、NaSO4、MgSO4等。第16頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

（三）液一液萃取法（LLE）

常用的兩種LLE方法是有機(jī)溶劑直接萃取法和離子對(duì)萃取法。⒈直接萃取法原理：利用試樣中被測(cè)成分與干擾成分在有機(jī)溶劑（萃取劑）中的溶解度不同，通過多次萃取來達(dá)到分離凈化的目的。多次萃取雖然有利于提高萃取回收率和結(jié)果的準(zhǔn)確度，但多次溶液轉(zhuǎn)移等操作又會(huì)帶來誤差。有時(shí)對(duì)于組分復(fù)雜，含量低的樣品，由于樣品數(shù)量多，多次萃取費(fèi)時(shí)等原因，只要每次測(cè)得的回收率重現(xiàn)性好，常在可接受的回收率前提下可采用單次提取。直接萃取法常用的溶劑有氯仿，二氯甲烷，乙酸乙酯和乙醚等?？筛鶕?jù)被測(cè)組分疏水性的相對(duì)強(qiáng)弱來選擇極性適當(dāng)?shù)娜軇缺ＷC被測(cè)組成的充分萃取，又有很好的選擇性。對(duì)于弱酸性成分應(yīng)調(diào)節(jié)水相的pH≤Ka-2。而弱堿性成分應(yīng)調(diào)節(jié)水相的pH≥PKa+2（此處為其共軛酸的pKa），以使弱酸、弱堿性成分主要以非離子化的游離酸、或堿形式存在，而提高萃取率。在提取過程中也常利用中性鹽的鹽析作用，如水相用NaCl飽和，使被測(cè)組分進(jìn)入有機(jī)相而提高提取率。

第17頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

⒉離子對(duì)萃取法：其原理是在適當(dāng)?shù)膒H介質(zhì)中，某些有機(jī)酸（堿）性物質(zhì)形成的離子與帶相反電荷的離子（也稱離子對(duì)試劑）定量地結(jié)合成為弱極性的離子對(duì)，而易溶于有機(jī)溶劑，使之萃取分離。它最適合于高度電離的有機(jī)酸、堿化合物的萃?。ú荒苡弥苯臃ㄝ腿。?，在中藥制劑分析中主要用于生物堿（B）的分析，其離子對(duì)試劑常為酸性染料（In-）如溴麝香草酚藍(lán)（BTB）和溴甲酚綠（BCG）等，在水相中的定量反應(yīng)為BH+（水相）+In_(水相)BH+·In-（水相）BH+·In-（有機(jī)相）形成的離子對(duì)BH+·In-常用成氫鍵能力強(qiáng)的氯仿或二氯甲烷提取。由上反應(yīng)可知要求水相中生物堿和酸性染料均有較高的離子化程度，因此必須注意水相的pH和離子對(duì)試劑的選擇。通常生物堿與BTB形成1∶1的離子對(duì)，最好在pH5.2～6.4提取，而二元堿形成1∶2離子對(duì)，最好在pH3.0～5.8提?。ǘ獕A的堿性弱，需要在較低的pH下離子化后形成離子對(duì)）。若氯仿層中的微量水份引起渾濁，可通過加入少許乙醇或久置分層變得澄清，也可分離有機(jī)相后加入脫水劑（常用無水Na2SO4）或經(jīng)濾紙濾過除去微量水份，另外液一液萃取時(shí)應(yīng)盡量避免發(fā)生乳化現(xiàn)象。第18頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

（四）色譜法

吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜皆可作為中藥制劑分析中的凈化分離方法，其操作方式有柱色譜，薄層色譜和紙色譜。其中經(jīng)典微柱色譜，也稱固相萃取或液—固萃取（LSE）具有設(shè)備簡(jiǎn)單，使用方便，快速，凈化效率較高而最常用，將在此做一簡(jiǎn)介。LSE通常是指樣品溶液加到裝有合適固定相（凈化劑）的長(zhǎng)5`～15cm，內(nèi)徑0.5～1cm的色譜柱中，將被測(cè)成分保留于柱上，洗去雜質(zhì)后，再洗脫被測(cè)成分進(jìn)行測(cè)定，或者是使雜質(zhì)強(qiáng)烈保留于柱上，直接洗脫被測(cè)成分進(jìn)行測(cè)定。用這種選擇性好而柱效較低的方法進(jìn)行樣品的凈化分離，尤其適用于一類總成分的含量測(cè)定，也可將色譜柱流出的樣品進(jìn)一步用GC、HPLC、TCL分離后測(cè)定。LSE的常用凈化劑（填料）有氧化鋁、氧化鎂、硅藻土、硅膠、活性炭、大孔樹脂離子交換樹脂、鍵合相硅膠C8、C18、聚酰胺等。視其性質(zhì)可分為親脂型、親水型和離子交換型填料。第19頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三固相萃取操作一般有四步：活化--除去柱子內(nèi)的雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境。上樣--將樣品用一定的溶劑溶解，轉(zhuǎn)移入柱并使組分保留在柱上。淋洗----除去不需要的組分。洗脫---用小體積的溶劑將組分淋洗下來并收集。第20頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

⒈硅膠、氧化鋁等：

它們是傳統(tǒng)的吸附劑，多以0.07～0.15mm(200～100目)的顆粒1～5g用于樣品的凈化處理，其作用機(jī)制為溶質(zhì)在吸附劑表面的極性吸附作用。通常是當(dāng)溶于有機(jī)溶劑的樣品加到柱上時(shí)非極性或低極性的雜質(zhì)先被洗出色譜柱，再用適當(dāng)極性的溶劑洗脫被測(cè)成分，而強(qiáng)極性的雜質(zhì)仍保留在柱上。氧化鋁能將黃酮類吸附在柱上，用于生物堿、苷類等的測(cè)定。例如用ＵＶ法（吸收系數(shù)法）硅膠適合于分離中性或酸性化合物，強(qiáng)烈保留堿性化合物。若把樣品提取液加到柱上，依次用極性由小到大的溶劑洗脫，則可以將雜質(zhì)和被測(cè)成分分離。另外，硅膠也和下面所述的硅藻土等一樣，還可作親水型填料使用，常見的商品硅膠柱為Sep-pakSilica，通常以甲醇、水處理后上樣。第21頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三⒉鍵合相硅膠：十八烷基鍵合相硅膠（簡(jiǎn)稱C18或ODS）是常用的固體萃取劑，其次有烷基、苯基、氰基鍵合相硅膠，可用來分開脂溶性和水溶性雜質(zhì)或成分。也常用于萃取，純化水基質(zhì)體液中憎水性藥物。該類LSE的一般操作程序?yàn)椋?)柱的活化。用2ml甲醇沖洗以潤(rùn)濕鍵合相和除去雜質(zhì)，再用0.5毫升水洗去柱中的甲醇。2)上樣。3)清洗。用2～5ml的水清洗以除去弱保留的親水成分，如無機(jī)鹽、氨基酸、親水的蛋白質(zhì)、糖以及中等保留成分的極性化合物、低肽等。4)洗脫。用2～5ml甲醇或甲醇-水洗脫大分子的肽、甾體、較親脂的藥物等強(qiáng)保留的待測(cè)組分。第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

第22頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三⒊大孔樹脂：它可分為極性和非極性型極性丙烯酰胺聚合物;非極性苯乙烯和二乙烯苯的共聚物.其吸附性質(zhì)與烷基鍵合相硅膠相似，通過疏水作用對(duì)非極性水溶性成份有吸附力。例如在測(cè)定復(fù)方歸芪劑中的黃芪甲苷時(shí)，用大孔樹脂除去水溶性的多糖雜質(zhì)，再用30%乙醇洗脫黃芪甲苷。大孔樹脂的主要特點(diǎn)是表面積極大，傳質(zhì)速率較高和具有不同的極性及適于吸附較大分子。樹脂在使用前需要前處理：用甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑除去雜質(zhì)，有時(shí)還需用酸、堿清洗。該填料用量常為1～2g，有時(shí)也用100～150mg來萃取血、尿中藥物，操作程序類似ODS填料。第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

第23頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

⒋聚酰胺：它是常用的有機(jī)吸附劑，主要通過與溶質(zhì)形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用。常用于含酚、酸、醌類藥物樣品液的凈化分離，如測(cè)定黃酮時(shí)，用樣品的乙醇提取液上柱，水洗去部分雜質(zhì)，以95%乙醇洗脫總黃酮后測(cè)定。

第24頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

⒌硅藻土、纖維素：

它們?yōu)槌Ｓ玫挠H水型填料，其原理為分配作用。填料作為支持劑，多以水基質(zhì)液作為固定相，與水不混溶的有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，較親脂的成分從固定相轉(zhuǎn)移到流動(dòng)相，而被洗脫，達(dá)到萃取的目的。其萃取率較高（一般大于80%），無濃集作用，萃取液較純凈，但洗脫劑用量較大（一般大于5ml）硅藻土柱則用干柱直接上樣，柱可再生。常見牌號(hào)為Extretut。纖維素柱的使用與硅藻土柱相似。第25頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三⒍離子交換樹脂：憎水基質(zhì)的離子交換樹脂兼有離子交換劑及大孔樹脂的一些性質(zhì)，所以對(duì)于在水中溶解度不大的藥物、洗脫劑中需含一定量的有機(jī)溶劑。離子交換樹脂柱可用于除去樣品中的離子，防止組分分解，更常用于萃取樣品液中可離解化合物。第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

第26頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

此外，近年來發(fā)展起來的固相微萃取(Solid-Phasemicroextraction,SPME)和液相微萃取(Liquid-Phasemicroextraction,LPME)技術(shù)有良好的應(yīng)用前景。SPME是一種無溶劑的萃取技術(shù)，取樣方式有直接取樣和頂空取樣。第27頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（五）消化法

對(duì)樣品進(jìn)行有機(jī)破壞，常用于中藥制劑中重金屬的檢查。常用的破壞方法有濕法消化和干法消化法。⒈濕法消化：根據(jù)所用試劑不同，下面介紹三種常見的消化方法。（1）硝酸—高氯酸法該法破壞能力強(qiáng)，反應(yīng)較激烈，故進(jìn)行破壞時(shí)，必須嚴(yán)密注意切勿將容器中的溶液蒸干，以免發(fā)生爆炸。本法適用于血，尿、組織等生物樣品和含動(dòng)植物藥制劑的破壞，經(jīng)破壞后所得無機(jī)金屬離子均為高價(jià)態(tài)，本法對(duì)含氮雜環(huán)類有機(jī)物破壞不夠完全。（2）硝酸—硫酸法該法適用于大多數(shù)有機(jī)物質(zhì)的破壞，無機(jī)金屬離子均氧化成高價(jià)態(tài)，與硫酸形成不溶性硫酸鹽的金屬離子的測(cè)定，不宜采有此法。第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

第28頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

（3）硫酸—硫酸鹽法本法所用硫酸鹽為硫酸鉀或無水硫酸納，加入硫酸鹽的目的是為了提高硫酸的沸點(diǎn)，以使樣品破壞加速完全。同時(shí)防止硫酸在加熱過程中過早地分解為SO3而損失。經(jīng)本法破壞所得金屬離子，多為低價(jià)態(tài)。本法常用于含砷或銻的有機(jī)樣品的破壞，破壞后得到三價(jià)砷或銻。濕法消化所用的儀器，一般為硅玻璃或硼玻璃制成的凱氏瓶（直火加熱）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加熱）。所用試劑應(yīng)為優(yōu)級(jí)純，水應(yīng)為去離子水或高純水，同時(shí)必須按相同條件進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)校正。操作時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。

第29頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)含量測(cè)定樣品的處理

⒉干法消化

本法是將有機(jī)物灼燒灰化以達(dá)分解的目的，將適量樣品置于瓷坩鍋、鎳坩鍋或鉑坩堝中，常加無水Na2CO3或輕質(zhì)MgO等以助灰化，混勻后，先小火加熱，使樣品完全炭化，然后放入高溫爐中灼燒，使其灰化完全即可。本法不適用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等，）有機(jī)樣品的破壞。應(yīng)用本法時(shí)要注意以下幾個(gè)問題：1）加熱灼燒時(shí)，控制溫度在420℃以下，以免某些被測(cè)金屬化合物的揮發(fā)。2）灰化完全與否，直接影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。如欲檢查灰化是否完全，可將灰分放冷后，加入稍過量的稀HCl-水（1:3）或硝酸-水（1:3）溶液，振搖。若呈色或有不溶有機(jī)物，可于水浴上將溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼燒。3）經(jīng)本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但此時(shí)切勿棄去。第30頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法

分類重量分析和滴定分析。化學(xué)分析法所用儀器簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確。主要用于測(cè)定制劑中含量較高的一些成分及含礦物藥制劑中的無機(jī)成分，如總生物堿類、總酸類、總皂苷及礦物藥制劑等?；瘜W(xué)分析法有一定的局限性，其靈敏度低，操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，專屬性不高，對(duì)于微量成分準(zhǔn)確性不理想。第31頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（一）重量分析法重量法可分為揮發(fā)法、萃取法和沉淀法。1、揮發(fā)法可測(cè)定具有揮發(fā)性或能定量轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)的組分含量。如：①供試品的干燥失重測(cè)定；②水分測(cè)定均屬揮發(fā)法；③中藥制劑分析中灰分及熾灼殘?jiān)臏y(cè)定等。2、萃取法是根據(jù)被測(cè)組分在互不相溶的兩相中溶解度的不同，達(dá)到分離的目的。如①冰硼散中冰片的含量測(cè)定；②地奧心血康膠囊中甾體總皂苷含量測(cè)定；③昆明山海棠片中總生物堿的含量測(cè)定；④甘草浸膏中甘草酸的含量測(cè)定即采用萃取法。3、沉淀法是將被測(cè)組分定量轉(zhuǎn)化為難溶化合物，測(cè)定其含量的方法，適用于制劑中純度較高的成分。如①西瓜霜潤(rùn)喉片中西瓜霜的含量測(cè)定；②苦參片中苦參總堿的含量測(cè)定；③復(fù)方元胡注射液總堿的測(cè)定。第32頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（二）滴定分析法滴定分析法分為酸堿滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化還原滴定法。1、酸堿滴定法適用于測(cè)定中藥制劑中所含有的生物堿、有機(jī)酸、內(nèi)酯類等酸、堿組分的含量。①直接滴定：對(duì)于K·C≥10-8的酸、堿組分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘靈注射液中總生物堿的含量測(cè)定、顛茄酊中生物堿的含量測(cè)定。②間接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中總酸性物質(zhì)的含量測(cè)定、草烏注射液中生物堿的含量測(cè)定等。2、沉淀滴定法主要用于生物堿、生物堿的氫鹵酸鹽及含鹵素的其他有機(jī)成分的含量測(cè)定。第33頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法3、配位滴定法包括EDTA法和硫氰酸銨法，在中藥制劑分析中，用以測(cè)定鞣質(zhì)、生物堿及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等礦物類制劑的含量。如①萬氏牛黃清心丸等的含量測(cè)定就采用硫氰酸銨法；②牛黃解毒片中石膏的含量測(cè)定。4、氧化還原滴定法適用于測(cè)定具有氧化還原性的物質(zhì)，如含酚類、糖類及礦物藥Fe、As等成分的中藥制劑。如①磁朱丸中全鐵的含量測(cè)定采用鈰量法；②牛黃解毒片中雄黃的含量測(cè)定；③丹皮酚注射液中丹皮酚的含量測(cè)。第34頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法二、可見一紫外分光光度法該法是中藥及其制劑含量測(cè)定的一種常用方法,具有靈敏度高，精度好和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。該法要求被測(cè)成分本身或其顯色產(chǎn)物對(duì)可見—紫外光具有選擇性吸收。按測(cè)定波長(zhǎng)數(shù)目不同分為單波長(zhǎng)光譜法和多波長(zhǎng)光譜法。

第35頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三紫外分光光度計(jì)工作原理紫外吸收光譜圖第36頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（一）單波長(zhǎng)光譜法

分類方法特點(diǎn)吸收系數(shù)法測(cè)定所配供試品溶液在規(guī)定波長(zhǎng)的吸收度，根據(jù)被測(cè)成分的吸收系數(shù)（E1%1cm）計(jì)算其含量①對(duì)儀器要求高，使用該法時(shí)，應(yīng)注意儀器波長(zhǎng)、空白吸收的校正，吸收度準(zhǔn)確度的檢定和雜散光的檢查②無需對(duì)照品，方法簡(jiǎn)便對(duì)照品比較法在同樣條件下配制對(duì)照品溶液和供試溶液，且使前者中所含被測(cè)成分的量應(yīng)為后者中被測(cè)成分的量的100%±10%，用規(guī)定波測(cè)定二者的吸收度，則可計(jì)算出供試品中被測(cè)成分的濃度或含量對(duì)儀器要求較高標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列不同濃度的對(duì)照品溶液（常為5個(gè)），在相同條件下分別測(cè)定吸收度，繪制A-C曲線，或求出其回歸直線方程（相關(guān)系數(shù)r≥0.999），即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下，測(cè)定供試品溶液的吸收度，就可求得供試品中被測(cè)成分的濃度或含量。①本法對(duì)儀器的精度要求不高，有時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過原點(diǎn)，只要重現(xiàn)性好也可使用②該法在比色法中最常用第37頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（二）多波長(zhǎng)光譜法（計(jì)算分光光度法）

供試品溶液中若有多種（兩種或兩種以上）組分共存，其紫外光譜彼此發(fā)生不同程度的重疊時(shí)，則可通過測(cè)定多種波長(zhǎng)處的吸收度，根據(jù)吸收度的加和性，采用適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)處理方式進(jìn)行多組分的同時(shí)測(cè)定，或者用其排除共存組分干擾，測(cè)定其中的某個(gè)組分。這就屬于多波長(zhǎng)光譜法的范疇。

第38頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法測(cè)定步驟①UV光譜測(cè)定：它是指分別測(cè)定被測(cè)組分和干擾組分溶液的UV光譜于同一坐標(biāo)系中（即重迭掃描）。被測(cè)組分的光譜通常用純化學(xué)對(duì)照品配制成適當(dāng)濃度的溶液進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于干擾組分化學(xué)結(jié)構(gòu)已知者，也可用純化學(xué)對(duì)照品測(cè)定其UV光譜，而對(duì)于干擾成分的組成尚不清楚者，通常用陰性樣品代替干擾成分來測(cè)定UV光譜。陰性樣品分為缺含被測(cè)成分藥材（即缺味）陰性樣品和缺被測(cè)成分陰性樣品。②波長(zhǎng)選擇：它是指根據(jù)各種測(cè)定方法的原理選擇一組合適的波長(zhǎng)。使得既能消除共存組分的干擾，又能使被測(cè)組分的測(cè)定靈敏度高（即回歸直線方程的斜率大）和測(cè)定誤差小。第39頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2．測(cè)定步驟③標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：通常按樣品測(cè)定條件，用標(biāo)準(zhǔn)品配制5～7種不同濃度的溶液（必要時(shí)可加入干擾組分），分別測(cè)定各所選波長(zhǎng)處的吸收度，然后計(jì)算其回歸直線方程（要求其相關(guān)系數(shù)r≧0.999）。④樣品測(cè)定：配制被測(cè)組分濃度處于標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)的樣品溶液（平行3～5份），測(cè)定各所選波長(zhǎng)處的吸光度。按回歸直線方程和稀釋度計(jì)算樣品中被測(cè)組分的濃度或含量。第三節(jié)常用定量分析方法第40頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法計(jì)算分光光度法的特點(diǎn)：在測(cè)定組成已知的復(fù)雜樣品時(shí)，可省去或簡(jiǎn)化樣品預(yù)處理步驟；中藥制劑分析中，干擾組分或陰性空白樣品的變動(dòng)性大，使得其方法的適應(yīng)性差，而只適應(yīng)于同樣品或內(nèi)控應(yīng)用；當(dāng)測(cè)定的吸收度處在吸收曲線的陡峭部位時(shí)，波長(zhǎng)的微小變動(dòng)可能對(duì)測(cè)定結(jié)果造成顯著的偶然誤差；在實(shí)際工作中，由于測(cè)試條件的變化及儀器與性能的限制，多波長(zhǎng)法常用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行樣品的測(cè)定。第41頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法三、薄層掃描法

薄層掃描法是以薄層色譜法為基礎(chǔ)發(fā)展起來的薄層色譜組分原位分析方法及薄層色譜的記錄方法，又稱薄層色譜掃描法（TLCS），相應(yīng)儀器稱為薄層掃描儀（ThinLayerChromatogramScanner）。薄層掃描法是用一定波長(zhǎng)的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜中吸收紫外光或可見光的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)用于藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測(cè)定。第42頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（一）基本原理

薄層掃描法是指薄層色譜斑點(diǎn)的色譜掃描，薄層色譜掃描是指固定波長(zhǎng)，斑點(diǎn)移動(dòng)，測(cè)定A-l(吸光度-波長(zhǎng)曲線)或F-l曲線(在固定發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度F隨展開距離L的變化所測(cè)定的F-L曲線)

。根據(jù)薄層掃描的測(cè)定方式分為薄層吸收掃描法和薄層熒光掃描法二種方法。第43頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

三、儀器及其工作原理

1.薄層掃描儀中國(guó)藥典采用雙波長(zhǎng)薄層掃描儀。常用的有島津CS-930型和CAMAG-Ⅱ型等。2.掃描儀工作原理第44頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法1、薄層吸收掃描法基本原理：Kubelka-Munk理論及曲線。由于薄層板存在明顯的散射現(xiàn)象，斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度與吸光度的關(guān)系需用Kubelka-Munk理論及曲線來描述。Kubelka-Munk理論以斑點(diǎn)的相對(duì)反射率和相對(duì)透光率計(jì)算薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度，說明了固定相的散射參數(shù)SX對(duì)斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度與吸光度間關(guān)系的影響，獲得不同散射參數(shù)SX時(shí)斑點(diǎn)的A-KX理論曲線，即Kubelka-Munk曲線。光源：鎢燈和氘燈；靈敏度：在200-800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)選擇合適波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，其靈敏度可達(dá)ng級(jí)；適用范圍：適用于在可見、紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)，及通過色譜前或色譜后衍生成上述化合物的樣品組分。第45頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2、薄層熒光掃描法基本原理：F=2.3K’I。ECL或F=KC光源：氙燈或汞燈。靈敏度：最低可測(cè)到10-50pg(1pg=10^-12g)。適用范圍：適合于本身具有熒光或經(jīng)過適當(dāng)處理后可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的測(cè)定。

Kubelka-Munk理論不適用于薄層熒光掃描，無需進(jìn)行曲線校直。用薄層熒光掃描進(jìn)行定量分析時(shí)，用斑點(diǎn)熒光強(qiáng)度的積分值（色譜峰峰面積）與斑點(diǎn)中組分的含量代替上式中F與C進(jìn)行運(yùn)算。第三節(jié)常用定量分析方法第46頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）薄層色譜的規(guī)范化操作1、儀器與材料①薄層板；②涂布器；③點(diǎn)樣器材；④展開箱（層析缸）⑤顯色與檢測(cè)儀器2、操作方法①薄層板的制備；②點(diǎn)樣；③展開；④檢測(cè)；第三節(jié)常用定量分析方法第47頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（三）定量分析方法1、方法學(xué)考察新建薄層掃描定量方法必須進(jìn)行方法考察，以說明新建方法的可靠性，考察的內(nèi)容有工作曲線、定量結(jié)果的精密度及準(zhǔn)確度、統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)等內(nèi)容。第48頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（1）工作曲線

①檢查所選擇的散射參數(shù)SX值是否適宜。SX值適宜則工作曲線被校直為直線，否則，調(diào)整SX值再校正，直至在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)工作曲線成直線為止。②考察工作曲線是否過原點(diǎn)，以便確定采用一點(diǎn)法或二點(diǎn)法定量。③確定點(diǎn)樣量的線性范圍。既使采用曲線校直，也只是在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)工作曲線為直線，因此需確定點(diǎn)樣量的上、下限。為降低定量誤差，最好調(diào)整點(diǎn)樣量，使供試品與對(duì)照品的峰面積相接近。為了克服薄層板間差異，外標(biāo)法及內(nèi)標(biāo)法均應(yīng)采用隨行標(biāo)準(zhǔn)法，即標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液交叉點(diǎn)在同一塊薄層板上。第三節(jié)常用定量分析方法第49頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（2）精密度考察

取同一供試品溶液，在同一塊薄層板上以相同點(diǎn)樣量平行點(diǎn)5點(diǎn)以上，展開后測(cè)定其峰面積，求算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD），作為衡量定量分析結(jié)果精密度的指標(biāo)。RSD應(yīng)小于4%。

式中：為n次測(cè)量的平均值，S為標(biāo)準(zhǔn)差。第50頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（3）準(zhǔn)確度考察回收率是衡量定量方法準(zhǔn)確度的指標(biāo)，常用加樣回收率（R）來衡量，其值應(yīng)在95-105%之間，測(cè)量數(shù)據(jù)一般為5-6個(gè)。將加入純品的試樣溶液、供試品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)于同一塊薄層板上，展開后進(jìn)行薄層掃描，測(cè)定各斑點(diǎn)的峰面積，計(jì)算各溶液中組分的量，計(jì)算回收率（R）。第51頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（4）統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)是檢驗(yàn)兩種方法、兩臺(tái)儀器或兩個(gè)人測(cè)量的兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精密度或準(zhǔn)確度（偶然誤差或系統(tǒng)誤差）間是否存在顯著性差異，說明新建定量方法可否代替舊方法或優(yōu)于舊方法。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)包括F檢驗(yàn)與t檢驗(yàn)。

F檢驗(yàn)即精密度差別檢驗(yàn)，用以檢驗(yàn)兩組數(shù)據(jù)的精密度或偶然誤差是否存在顯著性差異，一般為單側(cè)檢驗(yàn)。

t檢驗(yàn)即準(zhǔn)確度差別檢驗(yàn)，用以檢驗(yàn)兩組測(cè)量數(shù)據(jù)的平均值或系統(tǒng)誤差是否存在顯著性差異。若t檢驗(yàn)證明兩種方法測(cè)得的均值不存在顯著性差異時(shí)，則新方法可以代替舊方法，t檢驗(yàn)一般為雙側(cè)檢驗(yàn)。t檢驗(yàn)與F檢驗(yàn)的具體方法參見分析化學(xué)的有關(guān)論著，此從略。第三節(jié)常用定量分析方法第52頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法2、定量方法常用的定量方法有外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、追加法（疊加法）及回歸曲線定量法。（1）外標(biāo)法外標(biāo)法是薄層色譜掃描最常用的定量方法，方法簡(jiǎn)便，但點(diǎn)樣必須準(zhǔn)確。①外標(biāo)一點(diǎn)法工作曲線通過原點(diǎn)（截距為零）時(shí)可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量。只需點(diǎn)一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，與供試液同板展開，對(duì)比，測(cè)定組分含量，其計(jì)算公式為：C=F1·A式中：C為組分的重量或濃度，A為測(cè)得該組分的峰面積，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)。第53頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三②外標(biāo)二點(diǎn)法工作曲線不通過原點(diǎn)時(shí)，只能用外標(biāo)二點(diǎn)法定量，至少需點(diǎn)二種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（或一種濃度兩種點(diǎn)樣量），才能決定一直線,其計(jì)算公式為：C=F1A+F2式中：C、A同前，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)，F(xiàn)2為縱坐標(biāo)的截距，F(xiàn)1和F2值由儀器自動(dòng)算出。

外標(biāo)一點(diǎn)法、二點(diǎn)法只是指用一種或二種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比定量，為減小誤差，同一薄板上供試品點(diǎn)樣不得少于4個(gè)，對(duì)照品每一濃度不得少于2個(gè)；并調(diào)整標(biāo)淮溶液的濃度或供試品與標(biāo)準(zhǔn)溶液的點(diǎn)樣量，使其峰面積相接近；且點(diǎn)樣量必須準(zhǔn)確，宜用定量毛細(xì)管點(diǎn)樣。第三節(jié)常用定量分析方法第54頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

外標(biāo)一點(diǎn)法的直線方程：C=FAF為斜率

外標(biāo)兩點(diǎn)法的直線方程：

、

F1為斜率F2為截距第55頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（2）內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法是選一個(gè)純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，并準(zhǔn)確稱取一定量?jī)?nèi)標(biāo)物加至供試液及標(biāo)準(zhǔn)液中，計(jì)算供試品溶液中某組分含量的定量方法。

內(nèi)標(biāo)物的選擇要求是：純度合乎要求，展開后不得有雜質(zhì)斑點(diǎn)，否則內(nèi)標(biāo)斑點(diǎn)的峰面積將不能代表內(nèi)標(biāo)物的量。內(nèi)標(biāo)物須為樣品中所不含有的成分。內(nèi)標(biāo)物不與其它斑點(diǎn)相重疊，分離度合乎要求。為簡(jiǎn)化計(jì)算，內(nèi)標(biāo)物在標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品溶液中的濃度應(yīng)相等。第56頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三特點(diǎn)：1）在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)法定量準(zhǔn)確度與點(diǎn)樣量無關(guān)。2）不易找到適宜Rf值的純品內(nèi)標(biāo)物，且溶液配制等操作較麻煩。方法：1）內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法：當(dāng)工作曲線通過原點(diǎn)時(shí)采用內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法。內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法公式：2）工作曲線不通過原點(diǎn)時(shí)必須采用內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法公式：

式中：C、Cis分別為組分及內(nèi)標(biāo)物的濃度或重量，A、Ais分別為測(cè)得組分及內(nèi)標(biāo)物的峰面積，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)，F(xiàn)2為截距，F(xiàn)1和F2由儀器自動(dòng)計(jì)算并內(nèi)存，可直接給出樣品的濃度或重量。第三節(jié)常用定量分析方法第57頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（3）回歸曲線定量法將不同濃度（或不同量）的標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試液點(diǎn)在同一塊薄層板上，展開、掃描;由計(jì)算機(jī)對(duì)所測(cè)得的峰面積及相應(yīng)點(diǎn)樣量進(jìn)行線性或非線性回歸;直接由回歸方程或回歸曲線計(jì)算供試液含量的方法;CAMAG系列薄層掃描儀即采用此方法。第三節(jié)常用定量分析方法第58頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（四）影響薄層色譜分析的主要因素1、樣品的預(yù)處理及供試液的制備2、薄層色譜的點(diǎn)樣技術(shù)3、吸附劑的活性與相對(duì)濕度的影響4、溶劑蒸氣在薄層色譜中的作用5、溫度的影響第59頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三相對(duì)濕度（%）所需硫酸濃度（V/V）硫酸（ml）水（ml）326810042571005839.510065341007227.51008810.889控制相對(duì)濕度用的硫酸溶液第三節(jié)常用定量分析方法第60頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法四、氣相色譜法

氣相色譜法是以氣體為流動(dòng)相的柱色譜分離分析方法。

特點(diǎn)：分離效能高、選擇性好、靈敏度高，樣品用量少及分析速度快等特點(diǎn)，兼具分離、分析的功能，適用于熱穩(wěn)定性好的易揮發(fā)性或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)性組分的分析。

適用范圍：適用于熱穩(wěn)定性好的易揮發(fā)性或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)性組分的分析。第61頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（一）基本原理

氣相色譜是根據(jù)汽化后的試樣被載氣帶入色譜柱，由于各組分在兩相間作用不同，在色譜柱中移動(dòng)有快慢，經(jīng)一定柱長(zhǎng)后得到分離，依次被載氣帶入檢測(cè)器，將各組分濃度或質(zhì)量變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)變化記錄成色譜圖，利用色譜峰保留值進(jìn)行定性分析，利用峰面積或峰高進(jìn)行定量分析的方法。第62頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三1、塔板理論

將色譜柱的柱效用理論塔板數(shù)n或理論塔板高度H衡量，取決于區(qū)域?qū)挾龋é?、W1/2、W），其計(jì)算公式為第三節(jié)常用定量分析方法n=

=5.54

=16

H=L/n適中：tR為組分的保留時(shí)間，σ、W1/2、W分別為組分的標(biāo)準(zhǔn)差、半峰寬和基線寬度。第63頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三若以調(diào)整保留時(shí)間tR’代替tR，則得到反映色譜柱實(shí)際柱效的有效理論塔板數(shù)neff。neff=

=5.54

=16

Heff=L/neff可見，當(dāng)tR一定時(shí)，峰越窄，則H越小，n越大，柱效越高，分離性能越好。第三節(jié)常用定量分析方法第64頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2、速率理論速率理論研究了色譜過程中各種動(dòng)力學(xué)因素對(duì)柱效（峰展寬）的影響，提出了VanDeemeter方程式：H=A+B/u+CuA、B/u、Cu分別為渦流擴(kuò)散項(xiàng)、分子擴(kuò)散（縱向擴(kuò)散）項(xiàng)、傳質(zhì)阻抗項(xiàng)，從而解釋了板高隨載氣流速而改變，且有最佳流速（Hmin）的現(xiàn)象。速率方程式對(duì)于色譜分離條件的選擇具有指導(dǎo)意義，它可以說明色譜柱的填充均勻程度、載體粒度、載氣種類、柱溫和固定液膜厚度對(duì)柱效、峰擴(kuò)張的影響。對(duì)于開口毛細(xì)管柱色譜，渦流擴(kuò)散項(xiàng)A=0，故VanDeemeter方程式可簡(jiǎn)化為H=B/u+Cu，其傳質(zhì)阻抗小，柱長(zhǎng)又遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于填充柱，所以毛細(xì)管柱的柱效要比填充柱高得多，其理論塔板數(shù)達(dá)105-106。第三節(jié)常用定量分析方法第65頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3、分離度的計(jì)算分離度是衡量分離效果的指標(biāo)，以相鄰兩色譜峰峰尖距對(duì)峰寬均值的倍數(shù)表示，其定義式為：兩峰基本分離，R≥1.5兩峰完全分離。分離度的影響因素很多，可用基本分離方程式概括如下：a、b、c分別為柱效項(xiàng)，柱選擇性項(xiàng)和柱容量項(xiàng)。R==R=

abc第三節(jié)常用定量分析方法第66頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按藥典標(biāo)準(zhǔn)，中藥制劑分析時(shí)，需按各品種項(xiàng)下要求對(duì)儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，既用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，以達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。（1）色譜柱的理論板數(shù)n在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間tR和半峰寬Wh/2，按計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。若測(cè)得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長(zhǎng)、載體性能、柱填充等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。（2）分離度R定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測(cè)量，要求定量峰與其它峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度，一般R≥1.5。第三節(jié)常用定量分析方法第67頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（3）重復(fù)性取各品種項(xiàng)下的對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%，也可按各品種校正因子測(cè)定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣3次，計(jì)算平均校正因子，其相對(duì)平均偏差也應(yīng)不大于2.0%。（4）拖尾因子T為保證測(cè)量精度，特別當(dāng)采用峰高法測(cè)量時(shí)，應(yīng)檢查待測(cè)峰的拖尾因子T是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定，或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計(jì)算公式為：T=式中，W0.05h為0.05峰高處的峰寬，d1為峰極大至峰前沿之間的距離，除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95-1.05之間。第68頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（二）實(shí)驗(yàn)條件的選擇在氣相色譜分析中，為達(dá)到滿意的分離效果，需依據(jù)VanDeemeter方程式和分離度方程式選擇合適的分離條件，主要有固定相、柱溫、載氣流速等條件的選擇。1、固定相的選擇1）氣—液色譜①固定液：按極性相似、化學(xué)官能團(tuán)相似的相似性原則和主要差別選擇。②載體：一般為適宜粒度，經(jīng)酸洗并硅烷化處理的硅藻土。2）氣—固色譜：固定相大多采用高分子多孔微球（GDX），用于分離水及含羥基（醇）化合物。第69頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法2、柱溫的選擇選擇的基本原則：在使最難分離的組分有符合要求的分離度的前提下，盡可能采用較低柱溫，但以保留時(shí)間適宜及不拖尾為度。在實(shí)際工作中一般根據(jù)樣品的沸點(diǎn)來選擇柱溫，具體有如下幾點(diǎn)：高沸點(diǎn)的樣品（沸點(diǎn)300-400℃），采用1-5%低固定液配比，柱溫200-250℃。沸點(diǎn)為200-300℃的樣品，采用5-10%固定液配比，柱溫150-180℃。沸點(diǎn)為100-200℃的樣品，采用10-15%固定液配比，柱溫選各組分的平均沸點(diǎn)2/3左右。氣體等低沸點(diǎn)樣品，采用15-25%高固定液配比，柱溫選沸點(diǎn)左右，在室溫或50℃下進(jìn)行分析。對(duì)于寬沸程樣品，需采用程序升溫方法進(jìn)行分析。但需注意的是柱溫要低于固定液的最高使用溫度。第70頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3、載氣的選擇主要從對(duì)峰展寬（柱效）、柱壓降和檢測(cè)器靈敏度的影響三方面考慮。N2是最常用的載氣；載氣流速較低時(shí)，宜用N2；流速高時(shí)，宜用H2、He；較長(zhǎng)色譜柱，宜用H2作載氣；熱導(dǎo)檢測(cè)器應(yīng)選用H2、He；氫焰檢測(cè)器、電子捕獲檢測(cè)器，一般用N2；一般控制載氣流速高于其最佳流速。常用的載氣流速為20-80ml/min。第三節(jié)常用定量分析方法第71頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法4、其他條件的選擇氣化室（進(jìn)樣口）溫度：氣化溫度取決于樣品的揮發(fā)性、沸點(diǎn)范圍、穩(wěn)定性及進(jìn)樣量等因素。檢測(cè)室溫度檢測(cè)器溫度一般需高于柱溫，以免色譜柱的流出物在檢測(cè)器中冷凝而污染檢測(cè)器。通?？筛哂谥鶞?0℃左右或等于氣化室溫度。進(jìn)樣量在檢測(cè)器靈敏度足夠的前提下，盡量減少進(jìn)樣量，通常以塔板數(shù)下降10%作為最大允許進(jìn)樣量。對(duì)于填充柱，氣體樣品為0.1-1μl，液體樣品為0.1-1μl，最大不超過4μl為宜。毛細(xì)管柱需用分流器分流進(jìn)樣，分流后的進(jìn)樣量為填充柱的1/10-1/100。此外，進(jìn)樣速度要快，進(jìn)樣時(shí)間要短，注意留針時(shí)間和室溫的影響，以準(zhǔn)確控制進(jìn)樣量，以利于分離。第72頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法5、檢測(cè)器熱導(dǎo)檢測(cè)器（TCD）：通用型檢測(cè)器，應(yīng)用廣泛，但靈敏度較低；氫焰離子化檢測(cè)器（FID）：應(yīng)用最廣泛，適用于含碳有機(jī)物的測(cè)定，載氣多為N2。氮-磷檢測(cè)器（NPD）：專屬性檢測(cè)器，可用于中藥及其制劑中農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)。電子捕獲檢測(cè)器（ECD）：專屬性檢測(cè)器，適用于痕量電負(fù)性有機(jī)物—如含鹵素、硫、氧、硝基、羰基、氰基等化合物的分析。第73頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（三）定量分析方法氣相色譜常用的定量方法有內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、歸一化法等。1、內(nèi)標(biāo)法特點(diǎn)：為最常用的定量方法優(yōu)點(diǎn)：可抵消儀器穩(wěn)定性差、進(jìn)樣量不夠準(zhǔn)確等原因所帶來的定量分析誤差；缺點(diǎn)：樣品的配制較麻煩，有些內(nèi)標(biāo)物不易尋找。關(guān)鍵：選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。適用范圍：①適用于樣品的所有組分不能全部流出色譜柱；②檢測(cè)器不能對(duì)每個(gè)組分都產(chǎn)生信號(hào)；③只需測(cè)定樣品中某幾個(gè)組分含量時(shí)的情況。第74頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法原理：選擇一內(nèi)標(biāo)物，將一定量的內(nèi)標(biāo)物加入到樣品中，根據(jù)試樣重量W和內(nèi)標(biāo)物重量Ws及待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的峰而積Ai、As，求出待測(cè)組分的含量。待測(cè)組分百分含量為：Ci%=式中fi、fs分別為被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)的重量校正因子。在中藥制劑分析時(shí)，校正因子經(jīng)常不知，可采用藥典方法測(cè)定校正因子再用內(nèi)標(biāo)法，或采用內(nèi)標(biāo)對(duì)比法測(cè)定。第75頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（3）內(nèi)標(biāo)工作曲線法內(nèi)標(biāo)工作曲線法與外標(biāo)法相同，只是在各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入相同量的內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比Ai/AS對(duì)Ci作工作曲線（或求回歸方程）樣品測(cè)定時(shí)也加入等量的內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)樣品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比AX/AS由工作曲線求得待測(cè)組分含量。第76頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法2、外標(biāo)法關(guān)鍵：①進(jìn)樣量準(zhǔn)確；②實(shí)驗(yàn)條件恒定。分類：1）工作曲線法：用一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線，在完全相同條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣等體積的樣品溶液，計(jì)算其含量；2）外標(biāo)一點(diǎn)法：當(dāng)工作曲線截距為零時(shí)，可采用外標(biāo)一點(diǎn)法定量，第77頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3、歸一化法關(guān)鍵：要求所有組分均要產(chǎn)生色譜峰。適用范圍：通常只能用于粗略考察供試品的雜質(zhì)含量，一般宜用于微量雜質(zhì)的含量檢查.①校正面積歸一化法測(cè)定各組分的含量。②面積歸一化法計(jì)算：第78頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）是以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜的理論和實(shí)驗(yàn)方法。高壓輸送流動(dòng)相，采用高效固定相及在線檢測(cè)等手段發(fā)展而來的分離分析方法，具有分離效能高、分析速度快及應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。

適用范圍：適用于極性、非極性化合物，離子型化合物和高分子化合物的分離分析。第79頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（一）HPLC的基本原理

HPLC與GC的主要差別是流動(dòng)相的性質(zhì)不同。1、塔板理論用于計(jì)算理論塔板數(shù)及理論塔板高度，衡量色譜柱的柱效。在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中，其理論板數(shù)不得低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)。H=L/n第80頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法2、速率理論在HPLC中流動(dòng)相為液體。粘度大柱溫低，擴(kuò)散系數(shù)Dm很小，因此縱向擴(kuò)散項(xiàng)B/u可忽略不計(jì)，其速率方程式為：H=A+CuC=Cm+Csm+Cs式中Cm、Csm、Cs分別是組分在流動(dòng)相、靜態(tài)流動(dòng)相和固定相中的傳質(zhì)阻抗系數(shù)。對(duì)于化學(xué)鍵合相色譜，“固定液”是被鍵合在載體表面的單分子層，Cs≈0，則C=Cm+Csm。在HPLC中，當(dāng)流動(dòng)相的線速度大于1cm/s時(shí)，可近似認(rèn)為流動(dòng)相的流速與板高成直線關(guān)系，為兼顧柱效與分析速度，一般都采用較低流速。內(nèi)徑2-4.6mm的色譜柱，多采用1ml/min。第81頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（二）HPLC實(shí)驗(yàn)條件的選擇1、色譜柱的選擇根據(jù)被分離物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性和溶解度等因素進(jìn)行選擇。①大多數(shù)藥物可用C18反相（ODS）柱加以分離測(cè)定；②也可選用正相分配色譜柱（氨基柱、氰基柱）或硅膠吸附色譜柱等；③解離藥物可用離子對(duì)色譜、離子抑制色譜或離子交換色譜分離測(cè)定；④脂溶性藥物異構(gòu)體的分離測(cè)定可采用硅膠吸附色譜柱。第82頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法2、流動(dòng)相的選擇1）反相鍵合相色譜流動(dòng)相常用溶劑適用范圍部分含水溶劑甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)用于分離中等極性、弱極性藥物非水溶劑乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氫呋喃等用于分離疏水性物質(zhì)緩沖溶液三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液用于可溶于水并具可解離特性的化合物反相鍵合相色譜常用流動(dòng)相第83頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法2）正相鍵合相色譜

①常采用飽和烷烴（如正已烷）中加入一種極性較大的溶劑作為極性調(diào)節(jié)劑（如異丙醚），通過調(diào)節(jié)極性調(diào)節(jié)劑的濃度改變?nèi)軇?qiáng)度；

②常采用二元以上的混合溶劑系統(tǒng)。第84頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法3、洗脫方式

等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相的組成保持恒定，使所有組分的k值都處于這個(gè)范圍內(nèi)，適用于組分?jǐn)?shù)較少、性質(zhì)差別不大的樣品。

梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成（如溶劑極性、離子強(qiáng)度和pH值等），適用于分析組分?jǐn)?shù)多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜混合物樣品，從而使所有組分都在適宜條件下獲得分離。第85頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4、檢測(cè)器

檢測(cè)器特點(diǎn)最低檢測(cè)限適用范圍紫外檢測(cè)器（UV或UVD）分為:①可變波長(zhǎng)型②二極管陣列檢測(cè)器①用于檢測(cè)有外吸收的物質(zhì);②靈敏度較高,噪音低,線性范圍寬,對(duì)流速和溫度波動(dòng)不靈敏,可用于梯度洗脫.10-7-10-12g用于芳烴、稠環(huán)芳烴、芳香氨基酸、核酸、甾體激素、羰基和羧基化合物等熒光檢測(cè)器(FD)①用于能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質(zhì);②靈敏度高于紫外檢測(cè)器1×10-10g/ml主要用于氨基酸、多環(huán)芳烴、維生素、甾體化合化物及酶等蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)①屬通用型檢測(cè)器,理論上可用于揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品組分;②檢測(cè)靈敏度較低,適用于流動(dòng)相能揮發(fā)的色譜洗脫,不能用含緩沖鹽的流動(dòng)相用于檢測(cè)糖、高分子子化合物、高級(jí)脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等幾十類化合物第86頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4、檢測(cè)器

電化學(xué)檢測(cè)器(ECD)用于能氧化、還原的有機(jī)物質(zhì)的檢測(cè)1×10-12g/ml適用生物胺、酚、羰基化合物、巰基化合物等示差折光檢測(cè)器(RID)①屬通用型檢測(cè)器,利用組分與流動(dòng)相折射率之差進(jìn)行檢測(cè).②穩(wěn)定性好,操作方便.③靈敏度低,受環(huán)境溫度、流動(dòng)相組成等波動(dòng)的影響大,不適合梯度洗脫10-8g/ml尤其適合于糖類的檢測(cè)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(CLD)①高選擇性、高靈敏度的新型檢測(cè)器.②設(shè)備簡(jiǎn)單,自身發(fā)光,無需光源,價(jià)格便宜Pg級(jí)(10-12)用于分析微量脂質(zhì)、核酸、生物胺等第87頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5、HPLC前處理（1）流動(dòng)相的處理

①溶劑的純化選擇專供色譜分析用的“色譜純”溶劑，分析純或優(yōu)級(jí)純?nèi)軇┰诤芏嗲闆r下也可滿足色譜分析的要求。由于不同的色譜柱和檢測(cè)方法對(duì)溶劑的要求不同，有時(shí)需進(jìn)行除去紫外雜質(zhì)、脫水、重蒸等純化操作。水一般采用石英系統(tǒng)二次蒸餾水。第三節(jié)常用定量分析方法第88頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三②流動(dòng)相脫氣HPLC所用的流動(dòng)相必須預(yù)先除去其中的空氣，習(xí)稱脫氣，一般在臨用前對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行脫氣，常用的脫氣法有超聲波振蕩脫氣、惰性氣體（He）鼓泡吹掃脫氣、抽真空加熱法。③過濾過濾是為了防止不溶物堵塞流路和色譜柱入口處的微孔墊片，因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒。流動(dòng)相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是過濾，采用0.45μm以下微孔濾膜過濾。濾膜分有機(jī)溶劑專用和水溶液專用兩種。第三節(jié)常用定量分析方法第89頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（2）樣品的處理HPLC分析前需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，以便將待測(cè)物質(zhì)有效地從樣品基質(zhì)中釋放出來，使樣品的形式及所用溶劑符合HPLC的要求。①待測(cè)組分的提取根據(jù)樣品成分及組分性質(zhì)選擇合適的提取方法和提取條件。②溶劑的揮發(fā)對(duì)于液體樣品或經(jīng)處理后得到的樣品溶液，若待測(cè)物的濃度在定量限以上，且溶劑對(duì)HPLC系統(tǒng)沒有干擾，可以直接進(jìn)樣分析。但很多情況下需除去溶劑，濃縮甚至干燥樣品，除去溶劑的方法有：自然揮散或在氮?dú)饬飨麓蹈?，適用于小體積樣品和揮發(fā)性溶劑；減壓蒸發(fā)，適用于熱不穩(wěn)定樣品；冷凍干燥，適用于受熱易分解破壞的樣品。③濾過樣品溶液進(jìn)樣前，需用濾膜抽濾或針頭濾器過濾，以有效除去樣品溶液中的懸浮物或部分大分子雜質(zhì)。第90頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法其中液-液分配色譜是中藥制劑分析中應(yīng)用最廣泛的方法，根據(jù)固定相與流動(dòng)相的極性差別，分為正相色譜和反相色譜兩類。正相色譜:流動(dòng)相極性小于固定相極性的分配色譜法，主要用于極性物質(zhì)的分離測(cè)定；反相色譜:流動(dòng)相極性大于固定相極性的分配色譜法，主要用于非極性、中等極性物質(zhì)的分離測(cè)定第91頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法化學(xué)鍵合相是將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體上所形成的固定相。具有化學(xué)性能穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性好，一般在pH2-8范圍的溶液中不變質(zhì)，使用過程不流失，載樣量大，適于梯度洗脫等特點(diǎn)，已廣泛用于正相與反相色譜，離子抑制色譜，離子對(duì)色譜。藥典中HPLC法所采用的固定相均為化學(xué)鍵合相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜法.現(xiàn)就中藥制劑分析中最常用的鍵合相色譜法作一介紹。第92頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（1）反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法是現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛的方法，占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。反相色譜法一般采用非極性鍵合相，十八烷基鍵合相（簡(jiǎn)稱ODS或C18）是最常用的非極性固定相，對(duì)于各種類型的化合物都有較強(qiáng)的適應(yīng)能力；流動(dòng)相通常以水為基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量能與水互溶的極性調(diào)整劑，常用的有甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)。極性調(diào)整劑的性質(zhì)及其與水的混合比例對(duì)溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響，流動(dòng)相的極性增大，洗脫能力降低，溶質(zhì)的k增大，tR增大；反之，k與tR減小。調(diào)整流動(dòng)相的極性，可控制k值在所要求的范圍內(nèi)（k=1-10），對(duì)于結(jié)構(gòu)類似的組分，極性大的組分先出柱。第93頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（2）正相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法的應(yīng)用不如反相色譜法普及，主要用于分離分析溶于有機(jī)溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)。氰基（-CN）、氨基（-NH2）和二醇基（DIOL）鍵合相是正相色譜常用的極性鍵合相，流動(dòng)相通常用烷烴（常用正已烷）加適量極性調(diào)整劑構(gòu)成。

第94頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（3）離子對(duì)色譜法

直接將離子對(duì)試劑加入到流動(dòng)相中，用以分離離子型或可離子化化合物的方法作為離子對(duì)色譜法（PIC或IPC），該法可分為正相離子對(duì)色譜法和反相離子對(duì)色譜法，但近年來廣泛應(yīng)用的幾乎都是反相離子對(duì)色譜法，故本書只介紹反相離子對(duì)色譜法.①基本原理:以C18或C8鍵合相為固定相，用含離子對(duì)試劑的有機(jī)溶媒-水溶液為流動(dòng)相，用以分離離子型或可離子化化合物.②適用范圍:適用于有機(jī)酸、堿、鹽的分離;用離子交換色譜法無法分離的離子和非離子混合物的分離;在中藥制劑分析廣泛用于生物堿、有機(jī)酸的分析。

③缺點(diǎn):離子對(duì)試劑價(jià)格比較貴.④分離條件的選擇:離子對(duì)試劑的性質(zhì)和濃度、流動(dòng)相的pH值及流動(dòng)相中所含有機(jī)溶劑的種類與比例等。第95頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法i離子對(duì)試劑的選擇通常所選用離子對(duì)試劑的電荷應(yīng)與試樣離子的電荷相反。離子對(duì)試劑主要應(yīng)用對(duì)象1、季銨類（如四甲基、四丁基、十六烷基三甲基銨）強(qiáng)酸和弱酸（如磺酸染料、羧酸、磺胺類藥物、水溶性維生素）2、叔胺類（如三辛基胺）磺酸鹽等3、烷基磺酸鹽（如戊烷、已烷、庚烷、辛烷、十二烷基磺酸鹽）強(qiáng)堿和弱堿（如兒茶酚胺、罌粟堿、煙酰胺）4、高氯酸各種堿性物質(zhì)（如有機(jī)胺、肽）5、烷基硫酸鹽（如辛烷、十二烷基硫酸鹽）應(yīng)用對(duì)象同烷基磺酸鹽第96頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法反相離子對(duì)色譜法中流動(dòng)相pH值的選擇原則樣品類型流動(dòng)相PH值說明1、強(qiáng)酸（pKa<2）如磺酸染料2-7.4在整個(gè)pH范圍內(nèi)，樣品可離解，實(shí)際pH值的選擇取決于共存的其它組分類型。2、弱酸（pKa>2）如氨基酸、羧酸6-7.42-5樣品可離解，其k值取決于離子對(duì)的性質(zhì)樣品的離解被抑制，其k值取決于未離解樣品的性質(zhì)。3、強(qiáng)堿（pKa>8）如季銨類2-8同強(qiáng)酸4、弱堿（pKa<8）如兒茶酚胺6-7.42-5樣品的離解被抑制，其k值取決于未離解樣品的性質(zhì)樣品可離解，其k值取決于離子對(duì)的性質(zhì)。ii.流動(dòng)相pH值的控制

第97頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法iii.有機(jī)溶劑的選擇反相離子對(duì)色譜法中，甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)是最常用的流動(dòng)相，流動(dòng)相中所含有機(jī)溶劑的比例越高，組分的k值越小。一般而言，樣品組分的疏水性及離子對(duì)試劑的疏水性越強(qiáng)，所需有機(jī)溶劑的比例越高。第98頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（4）離子抑制色譜法原理:由于離子對(duì)試劑的價(jià)格較貴，對(duì)弱酸、弱堿的分離，往往采用離子抑制色譜法。通過向流動(dòng)相加入少量弱酸（常用醋酸）、弱堿（常用氨水）或緩沖鹽（常用磷酸鹽及醋酸鹽），調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相中的溶解度，改善峰形，達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，這種技術(shù)稱為離子抑制色譜法（ISC）。特點(diǎn):該方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、分離效果好，在許多場(chǎng)合可替代離子對(duì)色譜法，但重復(fù)性較差是其缺點(diǎn)。適用范圍:離子抑制色譜法通常用于反相色譜中，適用于3.0≤pKa≤7.0的弱酸、7.0≤pKa≤8.0的弱堿和兩性化合物的分離，以及它們與分子型化合物共存時(shí)的分離。第99頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法離子抑制色譜法與離子對(duì)色譜法的區(qū)別：

①離子抑制色譜法是向流動(dòng)相中加入抑制劑，調(diào)節(jié)pH值，抑制樣品組分的解離，使其以分子形式存在。而離子對(duì)色譜法是加入離子對(duì)試劑，并調(diào)節(jié)pH值使樣品組分盡可能呈解離狀態(tài)，使離子對(duì)試劑的反離子與樣品離子結(jié)合成中性離子對(duì)。②離子抑制色譜僅適用于弱堿、弱堿的分離，不適用于有機(jī)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的分離；而離子對(duì)色譜法對(duì)不同強(qiáng)度的酸、堿均適用。第100頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（四）定量分析方法HPLC常用的定量方法有:外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法（內(nèi)標(biāo)對(duì)比法和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法）內(nèi)加法。第101頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法六、原子吸收分光光度法

原子吸收分光光度法是基于從光源輻射出具有待測(cè)元素特征譜線的光，通過試樣蒸氣時(shí)被待測(cè)元素的基態(tài)原子所吸收，由輻射譜線被減弱的程度（即原子的吸光度）來測(cè)定試樣中該元素的含量。該法能測(cè)定幾乎全部金屬元素和一些半金屬元素，已廣泛應(yīng)用于中藥制劑及中藥材中重金屬、毒害元素及微量元素的檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn):靈敏度高、選擇性和重現(xiàn)性好、干擾較少、操作簡(jiǎn)便快速、測(cè)定范圍廣等優(yōu)點(diǎn)；

缺點(diǎn):是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍窄、測(cè)定不同元素一般需用不同光源燈且實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格。第102頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法(一)基本原理一個(gè)原子可具有多種能級(jí)狀態(tài)，在正常情況下原子是以其最低能態(tài)即基態(tài)形式存在的，當(dāng)吸收適當(dāng)頻率的輻射原子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，其中原子由基態(tài)躍遷到第一激發(fā)態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的吸收線稱為共振線。由于各種元素原子的結(jié)構(gòu)和外層電子排布不同，不同元素的原子從基態(tài)激發(fā)到第一激發(fā)態(tài)時(shí)吸收的能量不同，各種元素的共振線各有其特征性，稱為元素的特征譜線。對(duì)大多數(shù)元素來說，共振線是該元素所有譜線中最靈敏的譜線，通常選擇待測(cè)元素的共振線作為原子吸收定量的分析線。第103頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法（三）樣品的處理原子吸收光譜分析通常是溶液進(jìn)樣，被測(cè)樣品需事先轉(zhuǎn)化為溶液樣品，預(yù)處理方法與通常的化學(xué)分析相同，要求試樣分解完全，在分解過程中應(yīng)防止沾污和避免待測(cè)組分的損失，所用試劑及反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)后續(xù)測(cè)定應(yīng)無干擾。分解試樣最常用的方法是用酸溶解和堿熔融，近年來微波溶樣法獲得了廣泛的應(yīng)用。通常采用稀酸、濃酸或混合酸處理，酸不溶物質(zhì)采用熔融法。無機(jī)試樣如礦物類藥物大都采用此類方法。有機(jī)試樣通常先進(jìn)行消化處理，以除去有機(jī)物基體，消化后的殘留物再用合適的酸溶解。消化處理主要分干法消化和濕法消化兩種，被測(cè)元素若是易揮發(fā)的元素（如Hg、As、Cd、Pb、Sb、Se等），則不能采用干法消化，因?yàn)檫@些元素在消化過程中損失嚴(yán)重。第104頁(yè)，共114頁(yè)，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)常用定量分析方法干法消化:在較高的溫度下，用氧來氧化樣品。準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，置于石英坩鍋或鉑坩鍋中，于80~150℃低溫加熱趕去大量有機(jī)物；然后放于高溫爐中，加熱至450~550℃進(jìn)行灰化處理。冷卻后，再將灰分用HNO3、HCl或其它溶劑進(jìn)行溶解。