外植體選擇和滅菌演示文稿

外植體選擇和滅菌演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)外植體選擇和滅菌目前二頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

一般來(lái)說(shuō)，無(wú)論何種類(lèi)型的細(xì)胞工程技術(shù)，起始階段均涉及外植體取材、滅菌、接種與培養(yǎng)等基本過(guò)程。目前三頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)§1、外植體的選擇和滅菌目前四頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)一外植體的選擇(一)外植體的基因型不同種類(lèi)的植物同一植物的不同器官

對(duì)誘導(dǎo)條件反應(yīng)是不一致的，有的部位誘導(dǎo)分化的成功率高，有的部位卻很難脫分化，或者再分化頻率很低目前五頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)單子葉植物不易誘導(dǎo)器官發(fā)生。b.木本植物較難誘導(dǎo)。c.存在基因型差異（如番茄29%~63%）d.開(kāi)始生長(zhǎng)季節(jié)取材容易誘導(dǎo)。目前六頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)外植體種類(lèi)及基因型目前七頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)(二)外植體的部位目前八頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)目前九頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)常用的外植體種類(lèi)：①莖尖（園藝植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最多，繁殖率高，不易發(fā)生遺傳變異，但取材有限）②莖段（采用嫩莖的切段促進(jìn)腋芽萌發(fā)，取材容易）③葉（幼嫩葉片組織通過(guò)愈傷組織或不定芽分化產(chǎn)生植株，取材容易，操作方便，但易發(fā)生變異）；④花球和花蕾⑤種子、根、塊根、塊莖、花瓣、胚等。

對(duì)于大多數(shù)植物來(lái)講，莖尖是最好的部位，由于其形態(tài)已基本建成，生長(zhǎng)速度快，遺傳性穩(wěn)定，也是獲得無(wú)病毒苗的重要途徑，但莖尖往往受到材料來(lái)源的限制，而采用莖段可解決培養(yǎng)材料不足的困難。目前十頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)在選擇植物外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，還要求考慮待培養(yǎng)材料的來(lái)源是否有保證，是否容易成苗；同時(shí)要考慮到該外植體，特別是經(jīng)過(guò)脫分化產(chǎn)生的愈傷組織，是否會(huì)引起不良變異，喪失原品種的優(yōu)良性狀。目前十一頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

選取適宜的外植體；常用外植體有莖尖、莖段、節(jié)間、葉片、葉柄等。

C、流水沖洗外植體；

D、外植體切割、分離及滅菌處理；

E、外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

F、環(huán)境條件控制促進(jìn)外植體的生長(zhǎng)。目前十二頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)(三)取材季節(jié)目前十三頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)取材的季節(jié)以早春為好

不同植物的取材季節(jié)要求各有不同。對(duì)大多數(shù)植物而言，應(yīng)在其生長(zhǎng)開(kāi)始的季節(jié)采樣。在生長(zhǎng)末期或已進(jìn)入休眠期時(shí)取樣，則外植體可能對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無(wú)反應(yīng)，較難成活。在母株生長(zhǎng)旺盛的季節(jié)取材，不僅成活率高，而且增殖率也大。

目前十四頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)(四)器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡目前十五頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)1幼年組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力作為外植體的器官，其生理狀態(tài)和發(fā)育年齡直接影響形態(tài)發(fā)生。一般情況下，幼年組織比老年組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力，生理年齡越老的組織或器官，越接近發(fā)育上的成熟，其再生能力逐漸減弱甚至完全失去再生能力。

目前十六頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)外植體狀態(tài)：目前十七頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)2外植體的來(lái)源

-生長(zhǎng)在自然環(huán)境下的植物

-有目的地培育在溫室控制條件下生長(zhǎng)的植物

-無(wú)菌環(huán)境下已經(jīng)過(guò)離體培養(yǎng)的植物自然環(huán)境中生長(zhǎng)的植株，一般帶有微生物，甚至與某些微生物具有寄生關(guān)系，使植株具有內(nèi)生菌。取自這些植物的外植體，在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)有微生物滋生，從而影響培養(yǎng)效果。目前十八頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)自然環(huán)境生長(zhǎng)植株目前十九頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)溫室控制條件下生長(zhǎng)植株目前二十頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)已離體培養(yǎng)植株目前二十一頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

多數(shù)情況下，應(yīng)盡量使用溫室或人工氣候室控制培養(yǎng)的植物材料作為外植體來(lái)源，減少培養(yǎng)過(guò)程中的微生物感染概率。同時(shí)，生長(zhǎng)在控制條件下的植物可以保持培養(yǎng)料間的一致性，提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，也便于培養(yǎng)技術(shù)的規(guī)范。目前二十二頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

某些多年生植物或特殊材料，必須取自自然生長(zhǎng)的植物，就需要盡可能避免使用那些生長(zhǎng)過(guò)于潮濕和不潔凈環(huán)境中的植物。對(duì)于培養(yǎng)過(guò)程中可能出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的材料，應(yīng)盡量取生長(zhǎng)旺盛期的生長(zhǎng)點(diǎn)部位作為起始培養(yǎng)的材料。

目前二十三頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)3、供體植株的管理取自室外的外植體材料，供體植株的管理十分重要，這與外植體培養(yǎng)時(shí)的污染率密切相關(guān)。植株管理中應(yīng)注意：⑴避免昆蟲(chóng)危害許多昆蟲(chóng)如蚜蟲(chóng)、螨類(lèi)和飛虱是許多植物病蟲(chóng)害的傳播媒介，會(huì)引起植物組織的潛在感染。目前二十四頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)⑵注意防病尤其是真菌和細(xì)菌病害的侵染，取自感病植株的外植體，在培養(yǎng)中的污染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于來(lái)自健康植株的外植體，必要時(shí)需使用化學(xué)藥劑防治病害。⑶控制濕度給供體植株澆水時(shí)應(yīng)從根部給水，避免從上部澆水，以免上部形成易于病原侵染的濕度環(huán)境；盡可能降低溫室濕度；取材前盡可能保持植株干爽。目前二十五頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)3、材料取材⑴材料選擇培養(yǎng)材料應(yīng)選擇有代表性的主要植物、選擇性狀優(yōu)良的種質(zhì)或特殊的基因型。快速繁殖時(shí)應(yīng)在植株生長(zhǎng)的最適時(shí)期取材，花藥培養(yǎng)應(yīng)在花粉發(fā)育到單核期取材。目前二十六頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)(五)外植體大小目前二十七頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)外植體大?。和庵搀w越小成苗能力越弱，較大的外植體增殖較快。外植體極性：當(dāng)外植體以形態(tài)學(xué)的基部接種于培養(yǎng)基上時(shí)，從遠(yuǎn)離基部的表面誘導(dǎo)出芽、苗數(shù)目較多。目前二十八頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

選取材料的大小一般在之間。胚胎培養(yǎng)或脫毒在0.5cm以下。材料太大易污染，材料太小難于成活。

目前二十九頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)外植體取材方法--確定大小

取大小適中的莖段、芽體進(jìn)行清洗、滅菌，大了容易污染，小了不易成活。目前三十頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)外植體的大小

0.5-1cm，過(guò)大的外植體容易污染，過(guò)小存活率很低。目前三十一頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)目前三十二頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)外植體的大小外植體的來(lái)源生理學(xué)上的年齡取材的季節(jié)選材外植體的選擇有什么要求?目前三十三頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)二、外植體的滅菌目前三十四頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

滅菌：是指用物理或化學(xué)方法將所有致病和非致病的微生物全部殺滅。常用滅菌方法:

干熱滅菌:150度，40’

1２0度，120’

濕熱滅菌:高壓滅菌鍋，壓力達(dá)0.5kg/cm2時(shí)放氣，壓力達(dá)1.1kg/cm2,121度,16-30’

射線(xiàn)滅菌:紫外燈

過(guò)濾滅菌:細(xì)菌過(guò)濾器（孔徑0.45um

）

熏蒸滅菌:每立方米體積2-8mL甲醛＋甲醛一半量的高錳酸鉀

火燒滅菌：酒精燈

藥劑滅菌：外植體

目前三十五頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)(一)外植體的滅菌

原則：殺菌又不傷害活細(xì)胞。（選擇消毒劑，濃度、時(shí)間）藥劑：能自動(dòng)分解成低毒性或容易除去的藥劑，如次氯酸鈉能分解成殺菌的氯氣，并易散失，是常用的，低濃度氯化汞效果好但難除；多次無(wú)菌水沖洗，用鑷子翻動(dòng)使藥液均勻。目前三十六頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

1、預(yù)處理先對(duì)植物材料進(jìn)行修剪整理，去掉不需要部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料（外植體）在流水中沖洗20-60分鐘，備用。如特別不潔的外植體，可先用加有洗滌劑的水清洗10-15分鐘，再用流水沖洗干凈。目前三十七頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)2、表面滅菌（1）操作人員穿戴滅菌過(guò)的工作服、口罩。進(jìn)入接種室前雙手用洗滌劑清洗干凈，操作前再用70%酒精或消毒劑擦洗雙手。（2）操作期間雙手和臺(tái)面常用70%酒精或消毒劑擦拭。超凈工作臺(tái)使用前必須用紫外燈照射殺菌，然后開(kāi)啟風(fēng)機(jī)。目前三十八頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

（3）接種用工具（解剖刀、剪刀、鑷子）可放入70-75%酒精中，使用時(shí)需火焰灼燒滅菌，冷卻后使用。（4）外植體放入超凈工作臺(tái)內(nèi)置70-75%酒精中5-60秒

材料消毒前常用70%酒精漂洗：70%具較強(qiáng)穿透力和殺菌力，濕潤(rùn)表面，驅(qū)盡茸毛間氣泡，使藥劑殺菌效果好。但時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)損傷材料。目前三十九頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)幼穗、花蕾、花藥：飽和漂白粉上清液10-20分鐘莖段、莖尖：0.1-0.2%升汞5-10分鐘成熟胚：次氯酸鈉15-30分（活性氯2.5%）（＞=5.2%）厚種皮種子：

0.1-0.2%升汞30分-60分，幻胚次氯酸鈉90-120分

表面活性劑，抽氣、攪拌或超聲振動(dòng)，使消毒劑與材料充分接觸。目前四十頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)(二)污染原因和預(yù)防措施目前四十一頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

1、污染原因污染是指在組織培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。病原菌：細(xì)菌及真菌兩大類(lèi)。目前四十二頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)⑴細(xì)菌污染特點(diǎn)-菌斑呈黏液狀，接種后1-2天發(fā)現(xiàn)。污染途徑：外植體帶菌培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底操作人員未遵守操作規(guī)程

目前四十三頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)⑵真菌污染的特點(diǎn)-污染部分長(zhǎng)有不同顏色的霉菌，接種后3-10天發(fā)現(xiàn)。污染途徑：周?chē)h(huán)境不清潔超凈工作臺(tái)過(guò)濾裝置失效培養(yǎng)瓶的口徑過(guò)大目前四十四頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)2、污染的預(yù)防措施⑴防止材料帶菌的措施-莖尖作外植體時(shí)，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)（無(wú)糖）或暗培養(yǎng)。無(wú)糖營(yíng)養(yǎng)液或自來(lái)水使枝條抽枝，以新抽嫩枝作外植體。-晴天取材，下午取材，經(jīng)日曬過(guò)可殺死部分細(xì)菌或真菌。-接種時(shí)除去外部韌皮組織，只接內(nèi)部的分生組織。目前四十五頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)（2）外植體的滅菌-多次滅菌法，次氯酸鈉-無(wú)菌水-次氯酸鈉-多種藥液交替浸泡法，肥皂水-酒精-次氯酸鈉-無(wú)菌水。目前四十六頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)（3）嚴(yán)格按照操作程序。目前四十七頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

第二節(jié)

外植體無(wú)菌接種

目前四十八頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

污染來(lái)源：空氣中微生物，接種工具、材料、工作人員帶菌目前四十九頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)一、接種室的消毒目前五十頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

新潔爾滅擦地板、墻壁:使用前0.1%新潔爾滅擦地板、墻壁甲醛熏蒸：在接種前一天進(jìn)行，按每立方米體積2-6mL甲醛，倒入燒杯中，取甲醛一半量的高錳酸鉀倒入燒杯中，利用高錳酸鉀的強(qiáng)氧化性而使甲醛揮發(fā)達(dá)到殺菌目的）（紫外線(xiàn)照射：接種前1小時(shí)進(jìn)行，打開(kāi)紫外燈照射20－30分鐘，利用臭氧（O3）殺菌，停15－20分鐘后開(kāi)始接種）

酒精噴霧目前五十一頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

二外植體的接種—無(wú)菌接種外植體的接種是把經(jīng)過(guò)表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞、轉(zhuǎn)放到無(wú)菌培養(yǎng)基上的全部操作過(guò)程。整個(gè)過(guò)程均需無(wú)菌操作。燒烤瓶口，換濾紙，消毒剪刀，在酒精燈下方操作等。目前五十二頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

原則：殺菌又不傷害活細(xì)胞。（選擇消毒劑，濃度、時(shí)間）藥劑：能自動(dòng)分解成低毒性或容易除去的藥劑，如次氯酸鈉能分解成殺菌的氯氣，并易散失，是常用的，低濃度氯化汞效果好但難除；多次無(wú)菌水沖洗，用鑷子翻動(dòng)使藥液均勻。目前五十三頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)幼穗、花蕾、花藥：飽和漂白粉上清液10-20分鐘莖段、莖尖：0.1-0.2%升汞5-10分鐘成熟胚：次氯酸鈉15-30分（活性氯2.5%）（＞=5.2%）厚種皮種子：

0.1-0.2%升汞30分-60分，幻胚次氯酸鈉90-120分升汞處理方法：

升汞＋Na2S－－－絮狀沉淀（至絮狀沉淀不再產(chǎn)生為止）－－＋FeSO4（中和過(guò)多的Na2S）目前五十四頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)材料消毒前常用70%酒精漂洗：70%具較強(qiáng)穿透力和殺菌力，濕潤(rùn)表面，驅(qū)盡茸毛間氣泡，使藥劑殺菌效果好。但時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)損傷材料。表面活性劑，抽氣、攪拌或超聲振動(dòng)，使消毒劑與材料充分接觸。目前五十五頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)（三）工作人員：洗手，戴帽、口罩，70%酒精擦手。目前五十六頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)（四）無(wú)菌操作：燒烤瓶口，換濾紙，消毒剪刀，在酒精燈下方操作等。目前五十七頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)（1）借助接種用工具將材料切割分離。（2）將培養(yǎng)基放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，火焰灼燒培養(yǎng)基瓶口，然后打開(kāi)培養(yǎng)瓶口，置培養(yǎng)瓶為斜角，避免灰塵落入平中。

目前五十八頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

（3）迅速將切割分離下的所需組織、細(xì)胞、器官，放入培養(yǎng)基上，及時(shí)蓋上瓶蓋。（4）工具用后應(yīng)及時(shí)滅菌，避免交叉污染。（5）工作人員操作時(shí)禁止不必要的談話(huà)。目前五十九頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)第三節(jié)外植體的培養(yǎng)

目前六十頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

接種只是完成了離體培養(yǎng)的第一步，植物離體培養(yǎng)和栽培植物一樣，生長(zhǎng)過(guò)程中也受到各種環(huán)境因素的影響。培養(yǎng)條件是離體培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。在培養(yǎng)基條件適宜的基礎(chǔ)上，影響試管苗生長(zhǎng)的主要因素有光照、溫度、濕度、氧氣。目前六十一頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)

外植體的培養(yǎng)條件1、光照光照對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，是離體培養(yǎng)中非常重要的環(huán)境因素。光照強(qiáng)度、光質(zhì)以及光照時(shí)間，對(duì)細(xì)胞的增殖、器官的分化都有很大影響。除特殊要求外，一般都采用日光燈作光源，光照強(qiáng)度1000-5000Lx，根據(jù)不同植物或器官需要，可以每天連續(xù)光照12-16小時(shí)。目前六十二頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)馬鈴薯連續(xù)光照，葡萄要求短日照。光質(zhì)也影響芽的再生，藍(lán)光有利于器官發(fā)生，煙草實(shí)驗(yàn)，而紅光有利于根的發(fā)生。目前六十三頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)2、溫度離體培養(yǎng)中對(duì)溫度的控制比光照更為重要，大所數(shù)植物最適溫度在23-32℃之間。培養(yǎng)室溫度是25±2℃。低于15℃時(shí)，培養(yǎng)的組織生長(zhǎng)停頓，高于35℃對(duì)生長(zhǎng)也不利。因此，培養(yǎng)室應(yīng)安裝空調(diào)機(jī)或其他的控溫設(shè)備。變溫處理對(duì)有些植物器官發(fā)生有促進(jìn)作用，如豌豆。目前六十四頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)3、濕度培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)相對(duì)濕度通常是100%，而環(huán)境中的相對(duì)濕度會(huì)直接影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)。因此，培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)室一般要求相對(duì)濕度保持在70-80%，相對(duì)濕度過(guò)低影響培養(yǎng)物生長(zhǎng)和分化，應(yīng)向室內(nèi)噴灑水，以提高濕度；過(guò)高雜菌滋生，大量污染，應(yīng)及時(shí)地通風(fēng)除濕。目前六十五頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)4、氧氣離體培養(yǎng)的試管苗是需要氧氣的，在固體培養(yǎng)或液體靜置培養(yǎng)時(shí)，如果組織完全浸入培養(yǎng)基中，與氧氣隔絕，就會(huì)停止生長(zhǎng)。因此，接種時(shí)要有部分組織合空氣接觸。振蕩培養(yǎng)是解決通氣的良好辦法。固體培養(yǎng)中，如瓶塞不透氣，培養(yǎng)物也不能生長(zhǎng)，要選擇通氣性好的培養(yǎng)瓶蓋，增加可利用的氧氣，迅速除去釋放出來(lái)的CO2，有利于外植體外層細(xì)胞開(kāi)始分裂。要注意保持培養(yǎng)容器內(nèi)良好的通氣性。維持適宜的氧氣和二氧化碳濃度，防止有害氣體的積累。目前六十六頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)第四節(jié)外植體的褐變及其防止措施目前六十七頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)一、褐變的原因及防止措施

褐變是指外植體在培養(yǎng)過(guò)程中體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞內(nèi)的酚類(lèi)物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類(lèi)物質(zhì)，這種褐變物向外擴(kuò)散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，抑制其它酶的活性，影響外植體的分化，最后變褐死亡的現(xiàn)象。目前六十八頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)一、褐變的原因及防止措施（一）褐變的原因

褐變是指外植體在培養(yǎng)過(guò)程中體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞內(nèi)的酚類(lèi)物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類(lèi)物質(zhì)，這種褐變物向外擴(kuò)散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，抑制其它酶的活性，影響外植體的分化，最后變褐死亡的現(xiàn)象。目前六十九頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)⑴基因型某些植物酚類(lèi)物質(zhì)含量較多。⑵外植體的生理狀態(tài)幼年的材料培養(yǎng)含醌類(lèi)物質(zhì)較少。

目前七十頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)⑶培養(yǎng)基的成分-過(guò)高的無(wú)機(jī)鹽濃度-生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)使用不當(dāng)，BA過(guò)多-分生能力強(qiáng)的材料，氧化受抑制，褐變也被抑制-培養(yǎng)條件不適宜，溫度過(guò)高或光照過(guò)強(qiáng)，褐變加速。⑷材料轉(zhuǎn)移時(shí)間時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起材料褐變。目前七十一頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)（二）褐變的防止措施1選擇適宜的外植體一般來(lái)說(shuō)，最好選擇生長(zhǎng)處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。2培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分中的無(wú)機(jī)鹽、蔗糖濃度、激素水平等對(duì)褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關(guān)系（1）

適當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)鹽濃度

低濃度的無(wú)機(jī)鹽可促進(jìn)外植體的生長(zhǎng)與分化，減輕外植體褐變的程度。

目前七十二頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)（2

）適當(dāng)和適量的激素

王異星在荔枝的組織培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D時(shí)，愈傷組織較堅(jiān)硬，增殖緩慢，易產(chǎn)生褐變。培養(yǎng)基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D時(shí)，愈傷組織淺黃疏松，增殖也快。

（3）

培養(yǎng)基的pH值

在水稻體細(xì)胞培養(yǎng)中，pH值為4.5-5.0時(shí)MS液體培養(yǎng)基可保持愈傷組織處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，其表面呈黃白色，而pH值為時(shí)，愈傷組織嚴(yán)重褐變。一般來(lái)說(shuō)，酸性環(huán)境(pH值為4.5-5.0)不利于褐變過(guò)程的發(fā)生。

目前七十三頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)3培養(yǎng)條件

如溫度過(guò)高或光照過(guò)強(qiáng)，光照會(huì)提高多酚氧化酶（PPO）的活性，促進(jìn)多酚類(lèi)物質(zhì)的氧化，從而加速被培養(yǎng)的組織褐變。高濃度CO2也會(huì)促進(jìn)褐變，其原因是環(huán)境中的CO2向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，細(xì)胞內(nèi)CO2-增多，導(dǎo)致內(nèi)膜系統(tǒng)瓦解，酚類(lèi)物質(zhì)與多酚氧化酶（PPO）相互接觸，產(chǎn)生褐變。因此，初期培養(yǎng)要在黑暗或弱光下進(jìn)行。目前七十四頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)4連續(xù)轉(zhuǎn)移。5添加褐變抑制劑和吸附劑褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養(yǎng)基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產(chǎn)物醌發(fā)生作用，使其重新還原為酚。由于其作用過(guò)程均為消耗性的，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對(duì)外植體無(wú)毒副作用，在生產(chǎn)應(yīng)用中可不受限制。在水稻細(xì)胞的培養(yǎng)基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產(chǎn)生抗氧化作用，使生色物質(zhì)的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2+結(jié)合，從而降低了其活力。陳學(xué)森等在對(duì)植酸在銀杏組織培養(yǎng)中應(yīng)用的研究中也證實(shí)了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。加活性炭，0.1-0.5%活性炭

目前七十五頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)（三）玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施1、玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原因玻璃化是在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的環(huán)境產(chǎn)生變化，試管苗為了適應(yīng)變化了的環(huán)境而呈玻璃狀。主要原因是：⑴激素濃度BA濃度提高，導(dǎo)致玻璃化苗的產(chǎn)生。⑵瓊脂濃度瓊脂濃度低，玻璃化苗增加。目前七十六頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)⑶溫度低溫易形成玻璃化苗。⑷光照時(shí)間一般要求10-12h，大于15h玻璃苗增加。⑸通風(fēng)條件培養(yǎng)瓶容量小，氣體交換不良，玻璃化苗多。（6）離子水平植物種類(lèi)不同，離子形態(tài)比例量要求不同。目前七十七頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)2、預(yù)防措施⑴控制無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分，減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量（降低氮（銨態(tài)氮）和氯）。⑵增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢(shì)（提高蔗糖和瓊脂濃度）⑶降低細(xì)胞分裂素和赤霉素濃度，增加生長(zhǎng)素比例，可以考慮加入適量脫落酸。

目前七十八頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)（4）增加光照，包括自然光照1000-1800lx，控制光照時(shí)間8-12h。（5）適溫生長(zhǎng)，熱擊處理防止玻璃化發(fā)生。（6）增加容器通風(fēng)，使用透氣性好的封口膜，最好進(jìn)行CO2施肥，這對(duì)減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用。目前七十九頁(yè)\總數(shù)九十頁(yè)\編于八點(diǎn)（7）培養(yǎng)基中加入間苯三酚、根皮苷或多效唑、矮壯素。（8）降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生；目前八十頁(yè)\總數(shù)