第十五章基因治療

第十五章基因治療ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第1頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第一節(jié)基因治療的概念及其策略第二節(jié)基因治療的基本程序第三節(jié)基因治療的現(xiàn)狀第四節(jié)基因治療的靶向性第五節(jié)基因治療存在的問題第六節(jié)基因治療未來產(chǎn)業(yè)的展望主要內(nèi)容第2頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics

狹義概念

將具有正常功能的基因置換或增補(bǔ)患者體內(nèi)有缺陷的基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。

廣義概念

將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達(dá)到治療疾病的目的。

第一節(jié)基因治療的概念及其策略

一、基因治療（Genetherapy）概念第3頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics

基因矯正基因置換基因增補(bǔ)基因失活

“自殺基因”的應(yīng)用免疫基因治療耐藥基因治療特異性細(xì)胞殺傷性基因治療生殖細(xì)胞基因治療第一節(jié)基因治療的概念及其策略

二、基因治療的總體策略第4頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（1）基因矯正（genecorrection）對(duì)于致病基因中的異常堿基進(jìn)行精確修復(fù)，使其恢復(fù)正常功能；

（2）基因置換（genereplacement）用正?；蛟谠惶鎿Q致病基因，使細(xì)胞DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)；

（3）基因增補(bǔ)（geneaugmentation）將正?；?qū)牖颊唧w細(xì)胞內(nèi)，使其整合到染色體中一起表達(dá)，以補(bǔ)償缺陷基因的功能，但致病基因未去除。

第一節(jié)基因治療的概念及其策略

二、基因治療的總體策略第5頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（4）基因失活（geneinactivation）：

指將特定的反義核酸導(dǎo)入細(xì)胞，通過堿基互補(bǔ)作用與mRNA結(jié)合，阻斷腫瘤細(xì)胞中基因的異常表達(dá)，以抗腫瘤、抗病毒。反義RNA:

干擾mRNA的互補(bǔ)RNA;反義DNA:

干擾DNA的互補(bǔ)DNA.第一節(jié)基因治療的概念及其策略

二、基因治療的總體策略第6頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（5）“自殺基因”的應(yīng)用

自殺基因

這種基因?qū)胧荏w細(xì)胞后可產(chǎn)生一種酶，它可將原無細(xì)胞毒性或低毒藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒物質(zhì)，將細(xì)胞受體細(xì)胞殺死，這種基因被稱為“自殺基因”。自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞后，可將腫瘤細(xì)胞殺死。但對(duì)正常細(xì)胞則無傷害作用。

第一節(jié)基因治療的概念及其策略

二、基因治療的總體策略第7頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（6）免疫基因治療將某些細(xì)胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因?qū)肽[瘤患者體內(nèi)，以增強(qiáng)患者的抵抗力。（7）耐藥基因治療在腫瘤化療過程中，把產(chǎn)生抗藥物毒性的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，從而使患者能耐受更大劑量的化療。第一節(jié)基因治療的概念及其策略

二、基因治療的總體策略第8頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（8）化療保護(hù)性基因治療向正常細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入單相或多相細(xì)胞毒性藥物的抗性基因，使正常細(xì)胞耐化療藥物的能力大大提高。（9）特異性細(xì)胞殺傷性基因治療利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建以特異性殺傷靶細(xì)胞為目標(biāo)的“神奇彈頭”（10）生殖細(xì)胞基因治療

生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞補(bǔ)償性基因治療第一節(jié)基因治療的概念及其策略

二、基因治療的總體策略第9頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics

第二節(jié)基因治療的基本程序1.目的基因的選擇和制備2.基因的轉(zhuǎn)運(yùn)3.靶細(xì)胞的選擇4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染5.外源基因的表達(dá)及檢測(cè)第二節(jié)基因治療的基本程序

第10頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics在了解疾病發(fā)生的分子機(jī)制基礎(chǔ)上，選擇對(duì)疾病有治療作用的特定基因。如對(duì)單基因缺陷遺傳病，可用野生型（非突變）基因即可用于治療；對(duì)于腫瘤，最好選擇某些與該類腫瘤密切相關(guān)的癌基因或抑癌基因用于基因治療。治療性基因獲得的方法很多：用酶切或探針雜交法從基因組DNA文庫獲得，從cDNA文庫獲取，PCR擴(kuò)增，人工合成等。第二節(jié)基因治療的基本程序

一、目的基因的選擇和制備第11頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics基因治療關(guān)鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)控其適度表達(dá)。常用的載體有兩類：病毒載體和非病毒載體。病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒、腺相關(guān)病毒、痘苗病毒載體、HIV病毒載體、桿狀病毒載體等非病毒載體：脂質(zhì)體、分子耦聯(lián)載體、裸露DNA、染色體載體、多聚物

：與病毒載體的主要區(qū)別在于：采用理化方法將治療基因轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)。第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第12頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsψLTRLTRgagpolenv逆轉(zhuǎn)錄病毒載體1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第13頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics在包裝細(xì)胞中包裝成假病毒LTRneuψLTRAmproriE第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)（逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）第14頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)（1）結(jié)構(gòu)和感染過程與普通逆轉(zhuǎn)錄病毒相似；（2）可使靶細(xì)胞變成穩(wěn)定表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；（3）感染靶細(xì)胞后不擴(kuò)散；（4）假病毒感染靶細(xì)胞的效率非常高；（5）不感染非增殖細(xì)胞。第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)（逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）第15頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics同時(shí)也存在一定的缺點(diǎn):①容量小，只能容納8～10kb的外源基因片段；②血清補(bǔ)體能使之失活；③病毒滴度低，低于治療大腫瘤需要的滴度；④病毒整合到DNA后，可能引起插入突變和激活癌基因的可能；⑤宿主范圍有限，只感染增殖細(xì)胞，故在應(yīng)用上有一定局限性。第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)（逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）第16頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics腺病毒載體1、結(jié)構(gòu)E1AE1BE2BE2AE4E3L1~L5第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第17頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2、腺病毒載體特點(diǎn)（1）宿主范圍廣（2）腺病毒蛋白表達(dá)不以宿主增殖為必要條件（3）可獲得高病毒效價(jià)（4）重組體非常穩(wěn)定（5）不會(huì)引起腫瘤（6）有較高的安全性（7）無包膜，不易被補(bǔ)體滅活，可直接在體內(nèi)應(yīng)用（8）不整合入染色體第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)（腺病毒載體）第18頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics3、腺病毒載體優(yōu)點(diǎn)（1）能夠進(jìn)行位點(diǎn)特異性整合（2）無致病性（3）載體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單（4）穩(wěn)定（5）不引起腫瘤形成（6）腺相關(guān)病毒特別適合在活體條件下將基因轉(zhuǎn)入特定的靶細(xì)胞，同時(shí)又不誘發(fā)機(jī)體對(duì)被感染細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)（腺病毒載體）第19頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics單純皰疹病毒載體abU1b`a`c`Usca2、特點(diǎn)（1）滴度高（2）容量大（3）增殖細(xì)胞和非增殖細(xì)胞均可感染（4）不整合，但可長期存在并可穩(wěn)定表達(dá)1、結(jié)構(gòu)第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第20頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics痘苗病毒載體線形雙鏈DNA的有包膜病毒，其核心顆粒不依賴宿主細(xì)胞而獨(dú)立引進(jìn)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，宿主范圍廣泛且易于培養(yǎng)，容易獲得高滴度的病毒顆粒。同時(shí)痘苗病毒基因組中大量非必需基因的缺乏并不影響其在宿主細(xì)胞的復(fù)制能力，可允許在同一或不同非必需區(qū)插入多個(gè)基因，以表達(dá)多種或一種外源蛋白。缺點(diǎn)：細(xì)胞毒性；病毒能被人體的補(bǔ)體系統(tǒng)滅活并降解第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第21頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics艾滋病病毒(HIV)載體優(yōu)點(diǎn)：高效感染宿主細(xì)胞，并且其感染范圍廣；能逃避人體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，從而防止免疫排斥缺點(diǎn)：引起抑癌基因的受抑和原癌基因的激活，以及對(duì)細(xì)胞的毒性和產(chǎn)生變種病毒第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第22頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics桿狀病毒載體節(jié)肢動(dòng)物為唯一宿主的病毒，桿狀病毒對(duì)哺乳動(dòng)物是高度安全的。重組桿狀病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)得到廣泛的證實(shí)?？刹迦氪笃?，容易得到高滴度的病毒粒子和無細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)。許多經(jīng)過遺傳修飾的病毒還具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和較廣泛的宿主范圍的優(yōu)點(diǎn)第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第23頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第24頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics脂質(zhì)體脂質(zhì)體載體是用人造雙層磷脂質(zhì)，包裝DNA后形成的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。脂質(zhì)體載體無毒無抗原性，目的基因與脂質(zhì)體的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大，可單獨(dú)或聯(lián)合其他載體使用，并可通過靜脈注射使目的基因進(jìn)入特定部位。缺點(diǎn)：表達(dá)時(shí)間短，不能通過細(xì)胞膜屏障第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第25頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics分子耦聯(lián)載體分子耦聯(lián)載體由DNA、DNA結(jié)合因子和配體三部分組成。配體與特異的受體結(jié)合，經(jīng)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑，將目的基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。缺點(diǎn)：DNA易被降解，降低了基因轉(zhuǎn)移效率；靶向性不高第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第26頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics多聚物載體是利用帶正電荷的多聚陽離子與帶負(fù)電荷的DNA相結(jié)合，形成穩(wěn)定的多聚復(fù)合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的受體相結(jié)合，而被攝入到細(xì)胞中。多聚物載體聚合物聚乙烯亞氨(PEI)：PEI分子量的增加，其對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性同時(shí)增加；聚乙二醇(PEG)：降低PEI的毒性；聚D，L22，42二氨基丁酸(PDBA)：一種新型多聚物基因載體第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第27頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics裸露質(zhì)粒DNA將裸露質(zhì)粒DNA直接注入肌肉，外源基因在肌肉中的表達(dá)量與注入的外源基因含量成正比，與溶液體積無關(guān)。第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第28頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics染色體載體一些參與哺乳動(dòng)物基因表達(dá)和復(fù)制的染色體成分如轉(zhuǎn)座子、基因隔離子、增強(qiáng)子、基因座控制區(qū)、核骨架結(jié)合區(qū)以及基質(zhì)結(jié)合區(qū)等在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中，均被用來設(shè)計(jì)載體，并整合入基因組而發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)座子是一類小的DNA片段，可以在染色體不同的區(qū)域移動(dòng)并攜帶遺傳信息；轉(zhuǎn)座子的整合位點(diǎn)具有可預(yù)測(cè)性，從而提高轉(zhuǎn)基因治療的安全性。第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第29頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(Transductionpeptide)介導(dǎo)基因?qū)胂到y(tǒng)蛋白質(zhì)之所以能夠進(jìn)入細(xì)胞，就是因?yàn)樵谒鼈兊慕Y(jié)構(gòu)中含有能夠攜帶生物大分子進(jìn)入細(xì)胞的多肽-細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽。如果將這個(gè)多肽結(jié)構(gòu)和目的基因結(jié)合，它就能將目的基因帶入靶細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的表達(dá)效率高，但價(jià)格昂貴，穩(wěn)定性差，在一定程度上限制了它的應(yīng)用。第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)（其他新型載體

）第30頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics2.納米微生物技術(shù)基因治療載體納米微生物具有許多優(yōu)點(diǎn)：1)納米脂質(zhì)體主要由磷脂以及膽固醇合成，可以通過與細(xì)胞膜的融合或者胞吞作用將目的基因?qū)氚屑?xì)胞；2)納米微生物材料具有生物兼容性和可生物降解性，在傳遞過程中無毒，無免疫原性，并且可以通過新陳代謝降解，因此不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性；3)通過調(diào)節(jié)納米材料的降解速度，還可以控制目的基因的釋放速度，延長其治療效果；4)納米基因載體比表面積大，并可在表面偶聯(lián)靶細(xì)胞的配體或抗體，實(shí)現(xiàn)基因治療的主動(dòng)靶向性，大大提高基因傳遞的特異性和加強(qiáng)靶細(xì)胞對(duì)目的基因的攝取。第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)（其他新型載體

）第31頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics基因治療的受體細(xì)胞有生殖細(xì)胞和體細(xì)胞兩大類。對(duì)生殖細(xì)胞進(jìn)行基因治療，可使該生殖細(xì)胞分化發(fā)育成長的個(gè)體及其后代均具有正?；?，理論上講是根治遺傳病的理想方法。但由于涉及安全性和倫理學(xué)問題，目前基因治療中禁止使用生殖細(xì)胞作為靶細(xì)胞，只限于使用體細(xì)胞。第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第32頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics人類基因治療中，將治療基因?qū)爰?xì)胞有兩種途徑。一種為直接體內(nèi)療法（invivo）：即，將治療基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)組織細(xì)胞；另一種為間接體內(nèi)療法（exvivo）：即，在體外先將治療基因?qū)肱囵B(yǎng)的靶細(xì)胞內(nèi)，再將已獲得表達(dá)外源基因的遺傳修飾細(xì)胞回輸入病人體內(nèi)，達(dá)到治療目的。第二節(jié)基因治療的基本程序

二、基因的轉(zhuǎn)運(yùn)第33頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics選擇靶細(xì)胞的原則是：1）必須較堅(jiān)固，足以耐受處理，并易于由人體分離又便于輸回體內(nèi)；2）具有增殖優(yōu)勢(shì)，生命周期長，能存活幾月至幾年，最后可延續(xù)至病人的整個(gè)生命期；3）易于受外源遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化；4）在選用反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，目的基因表達(dá)最好具有組織特異性的細(xì)胞。目前使用得較多的是骨髓干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞等。第二節(jié)基因治療的基本程序

三、靶細(xì)胞的選擇

第34頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics

治療基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法

化學(xué)方法物理方法膜融合法病毒載體法質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)移法磷酸鈣法DEAE－葡聚糖法電穿孔法粒子轟擊法（基因槍法）第二節(jié)基因治療的基本程序

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染第35頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics1）物理方法（1）電穿孔法（electroporotion）將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中，通過電壓使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)。細(xì)胞細(xì)胞膜核膜通透性增加

高壓脈沖

DNA滲入細(xì)胞瞬間第二節(jié)基因治療的基本程序

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染第36頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics利用顯微操作把目的基因直接注入靶細(xì)胞或細(xì)胞核（2）顯微注射法（microinjection）第二節(jié)基因治療的基本程序

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染第37頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics例：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備重組基因DNA

微注射（體外）

小鼠受精卵回植假妊娠

仔鼠

動(dòng)物模型：轉(zhuǎn)基因鼠(每個(gè)鼠細(xì)胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳)第38頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第39頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsclonesheepDolly體細(xì)胞提取核重組細(xì)胞回植Dolly卵細(xì)胞去核細(xì)胞第40頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics利用亞微粒的鎢和金能吸附DNA，并將其包裹起來形成微粒，通過物理途徑獲得高速度，微粒瞬間既可進(jìn)入靶細(xì)胞，達(dá)到轉(zhuǎn)移目的基因的目的，而不損傷靶細(xì)胞。該方法可使目的基因在皮膚、肝、胰、胃及乳腺等細(xì)胞中表達(dá)。（3）微粒子轟擊法第二節(jié)基因治療的基本程序

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染第41頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics磷酸鈣沉淀法：目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并整合到受體細(xì)胞基因組中，在適當(dāng)條件下得以表達(dá)。2）化學(xué)法第二節(jié)基因治療的基本程序

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染第42頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics磷酸鈣+DNA→混合微細(xì)顆?！恋矸磻?yīng)20~30min↓細(xì)胞在沉淀物中暴露5~24h方法簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率低。第二節(jié)基因治療的基本程序

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染第43頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsDNADNA脂膜PEG仙苔病毒細(xì)胞融合轉(zhuǎn)化細(xì)胞應(yīng)用人工制備的類似細(xì)胞膜的膜性結(jié)構(gòu)-脂質(zhì)體，包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞，使其表達(dá)。3）脂質(zhì)體法（liposome）第二節(jié)基因治療的基本程序

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染第44頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics同源重組（homologusrecombination）:外源基因和染色體上的基因在同源序列間發(fā)生重組而插入染色體。是將外源基因定位導(dǎo)入細(xì)胞的染色體上。

單交換雙交換4）同源重組法第二節(jié)基因治療的基本程序

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染第45頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics通過同源重組定點(diǎn)插入珠蛋白基因

C重組后，插入外源基因片段帶有——neo基因（新霉素抗性基因），重組后的細(xì)胞在含有neo的培養(yǎng)基中生長，沒有插入新基因的細(xì)胞死亡，將有重組的細(xì)胞篩選出來。第二節(jié)基因治療的基本程序

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染第46頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsXbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正常基因座位帶有珠蛋白基因的質(zhì)粒第二節(jié)基因治療的基本程序

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染第47頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics感染細(xì)胞重組病毒5）病毒介導(dǎo)基因內(nèi)轉(zhuǎn)移第二節(jié)基因治療的基本程序

四、細(xì)胞轉(zhuǎn)染是通過病毒為載體（vector），將外源基因通過重組技術(shù)與病毒重組，然后去感染受體細(xì)胞第48頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics在篩選出轉(zhuǎn)化分子后還需要鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中外源基因的表達(dá)狀況。其中包括對(duì)目的基因和標(biāo)記基因表達(dá)的鑒定。常用方法有原位雜交，Northrn雜交，RNA打點(diǎn)雜交，免疫組織化學(xué)染色等，第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第49頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics分子雜交與印跡技術(shù)的原理核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第50頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics復(fù)性RNADNA第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第51頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics印漬技術(shù)(Blotting)首先由EdwenSouthern在1975年提出。Blotting即“印漬”，指將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印漬）到固定化介質(zhì)是病加以檢測(cè)分析的技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于DNA、RNA、和蛋白質(zhì)的檢測(cè)第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第52頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics探針技術(shù)(probe)將一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或熒光染料對(duì)它的末端或全鏈進(jìn)行進(jìn)行標(biāo)記，稱為“探針”然后用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測(cè)或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第53頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics理想探針標(biāo)記的特性1.高靈敏度；2.與探針的結(jié)合不能影響該分子的結(jié)構(gòu)；3.與探針的結(jié)合不影響探針的主要理化性質(zhì)；4.用酶促方法標(biāo)記時(shí)，應(yīng)該不影響酶促反應(yīng)；5.標(biāo)記后的檢測(cè)方法具有高靈敏度和高特異性；6.具有化學(xué)穩(wěn)定性、檢測(cè)方便、無毒、無環(huán)境污染。第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第54頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsDNA印跡技術(shù)又稱為Southern雜交，即DNA-DNA雜交分析。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，主要用于基因組DNA的分析，如在基因組中特異基因的定位及檢測(cè)等，亦可用于分析重組質(zhì)粒和噬菌體。在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第55頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics將DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段；經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定，凝膠中DNA片段的相對(duì)位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著;附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶的位置，確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第56頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片第57頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsSouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第58頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsRNA印漬技術(shù)又稱為Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析;是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平以及比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第59頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics蛋白質(zhì)印漬技術(shù)又稱為Western雜交，或免疫印漬技術(shù)，即利用抗原-抗體反應(yīng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的特異性蛋白質(zhì)。應(yīng)用：用于檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在、細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白質(zhì)分子的相互作用研究等。第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第60頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics三種印跡技術(shù)的比較第61頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（一）DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第62頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics斑點(diǎn)印跡斑點(diǎn)雜交法是不經(jīng)過電泳，而將被檢標(biāo)本直接點(diǎn)到膜上，烘烤固定，用于雜交。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。

第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第63頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第64頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics原位雜交即組織原位雜交，指組織切片或細(xì)胞涂片直接用于雜交分析。先經(jīng)適當(dāng)處理，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第65頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics菌落雜交第二節(jié)基因治療的基本程序

五、外源基因的表達(dá)及檢測(cè)

第66頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀

進(jìn)行基因治療必須具備下列條件：1)選擇適當(dāng)?shù)募膊?，并?duì)其發(fā)病機(jī)理及相應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)功能了解清楚；2)糾正該病的基因已被克隆，并了解該基因表達(dá)與調(diào)控的機(jī)制與條件；3)該基因具有適宜的受體細(xì)胞并能在體外有效表達(dá)；4)具有安全有效的轉(zhuǎn)移載體和方法，以及可供利用的動(dòng)物模型。第67頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics1991年，美國向一患先天性免疫缺陷病（遺傳性腺苷脫氨酶ADA基因缺陷）的女孩體內(nèi)導(dǎo)入重組的ADA基因，獲得成功1992年實(shí)施了TNF／腫瘤細(xì)胞和IL－2/腫瘤細(xì)胞方案，即分別將IL－2基因腫瘤壞死因子（tumornecrosisrector，TNF）基因?qū)肴∽曰颊咦陨聿⒔?jīng)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，結(jié)果5名黑色素瘤病人中1名腫瘤完全消退，2名90%的腫瘤消退，另2人在治療后9個(gè)月死亡。我國也在1994年用導(dǎo)入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治療了乙型血友病的患者對(duì)一些遺傳病如血友病，地中海貧血、高雪氏病等正在探索中。第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀

第68頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsADA-Gene+vector（逆轉(zhuǎn)錄病毒）重組分子患者TLyCIL-2刺激C分裂導(dǎo)入細(xì)胞生長分裂10天Gene表達(dá)

回輸患兒體內(nèi)1~2月治療一次,10個(gè)月患兒體內(nèi)ADA水平達(dá)正常人的25%

第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀

一、復(fù)合免疫缺陷綜合征的基因治療

第69頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGeneticsXR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時(shí)間長，輕傷、小手術(shù)后常出血不止。發(fā)病率為1/30000。例如：我國學(xué)者薛京倫實(shí)施的FⅨ的基因治療。第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀

二、乙型血友病第70頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics逆轉(zhuǎn)錄病毒載體+FⅨcDNA重組體5`LTRFⅨneoSVPSOLTR3`①導(dǎo)入倉鼠細(xì)胞（CHO）→FⅨ表達(dá)；②導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞→FⅨ表達(dá)；③91年，導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞→回植病人皮下→FⅨ基因表達(dá)，F(xiàn)Ⅸ基表達(dá)水平達(dá)正常人的5%。是我國基因治療成功的例子。第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀

二、乙型血友病第71頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics①IL-2Gene②TNF-Gene

（白介2）

（腫瘤壞死因子）

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入TIL（體外培養(yǎng)的自體細(xì)胞）回植患者體內(nèi)TIL進(jìn)入自體腫瘤部位，提高細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀

三、黑色素瘤的基因治療

第72頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics是指利用人工合成的反義RNA和反義DNA來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，控制細(xì)胞生長在中間階段，使編碼蛋白質(zhì)的基因能轉(zhuǎn)錄為mRNA，因而不能翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，以達(dá)治療某一疾病的目的第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀

四、反義技術(shù)

第73頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀

四、反義技術(shù)

第74頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第三節(jié)、基因治療的現(xiàn)狀

五、藥物靶向治療

第75頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第四節(jié)、基因治療的靶向性靶向性基因載體的作用原理靶向性是指在治療過程中，把治療作用或藥物效應(yīng)限定在特定的靶細(xì)胞、組織或器官內(nèi)，而不影響其他正常的細(xì)胞、組織或器官的功能。靶向性載體在這里不僅僅起一個(gè)靶向作用，還要通過各自的不同作用力和DNA分子鏈結(jié)合形成一個(gè)相對(duì)緊密的復(fù)合物粒子，使其更容易穿過細(xì)胞膜并且免受核酸酶的降解。第76頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics三個(gè)步驟：1.靶向性載體和目的基因以適當(dāng)比例混合，通過靜電荷力、分子間作用力等結(jié)合力結(jié)合在一起，使鏈狀的DNA分子折疊，形成粒狀的復(fù)合物。2.復(fù)合物在靶向性基團(tuán)的引導(dǎo)下接近靶細(xì)胞，通過細(xì)胞的內(nèi)吞或者吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，在細(xì)胞內(nèi)緊密的復(fù)合物可以保護(hù)DNA避免核酸酶的降解。3.靶向性載體和目的基因脫離，目的基因通過核膜孔或者是在細(xì)胞分裂過程中進(jìn)入細(xì)胞核，修補(bǔ)缺失基因或者關(guān)閉異?；?，而靶向性載體則分解成小分子化合物通過細(xì)胞的新陳代謝排出細(xì)胞。第四節(jié)、基因治療的靶向性

一、靶向性基因載體的作用原理第77頁，共86頁，2023年，2月20日，星期四ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics理想的基因載體應(yīng)具備以下特點(diǎn)：1)靶向特異性，并且可被免疫系統(tǒng)識(shí)別；2)高度穩(wěn)定，容易制備，可濃縮和純化；3)安全，無毒性，對(duì)人體以及環(huán)境無危害；4)有利于基因高效轉(zhuǎn)移和長期表達(dá)。第四節(jié)、基因治療的靶向性

二、靶向性基因載體的選擇第78頁，共86頁