第十一章色譜基礎

第十一章色譜基礎1第1頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四一、歷史： 1903年，俄國植物學家MikhailIswett最先發(fā)明。他采用填充有固體CaCO3細粒子的玻璃柱，將植物色素的混合物（葉綠素和葉黃素Chlorophylls&xanthophylls加于柱頂端，然后以溶劑淋洗，被分離的組份在柱中顯示了不同的色帶，他稱之為色譜（希臘語中“chroma”=color;“graphein”＝wite）2第2頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四3第3頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四4第4頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四英國學者馬丁由于對色譜法作出重要貢獻而獲得1951年諾貝爾獎。1937-1972年，15年中有12個Nobel獎是有關色譜研究的！5第5頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四二、色譜法共同的基本特點具備兩個相：·其中的一相固定不動，稱為固定相；·另一個是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。 由于Tswett的開創(chuàng)性工作，因此人們尊稱他為“色譜學之父”，而以他的名字命名的Tswett獎液成為了色譜界的最高榮譽獎。·色譜法是一種分離技術，對于復雜有機混合物試樣具有極高的分離效率，也是色譜法不同于其他分析方法的顯著特點?！さ?1世紀色譜科學將在生命科學等前沿科學領域發(fā)揮不可代替的重要作用。6第6頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四三、應用 色譜法的發(fā)展對有機化學的發(fā)展起到了巨大的推動作用，如對天然有機化合物的分離、分析、結構測定；大氣、水中有機污染物的測定；農產品、食品中農藥殘留量的測定；產品質量檢測；遺傳密碼的破譯；興奮劑檢測；天然物質中抗癌活性組分的分離分析；宇宙空間有機物質尋找。參考網站：中國色譜網7第7頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四8第8頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四四、色譜法的特點·優(yōu)點：“三高”、“一快”、“一廣”高選擇性——可將性質相似的組分分開高效能——反復多次利用組分性質的差異產生很好分離效果高靈敏度——1011～1013g，適于痕量分析分析速度快——幾～幾十分鐘完成分離，一次可以測多種樣品應用范圍廣—氣體、液體、固體物質化學衍生化再色譜分離、分析缺點：對未知物分析的定性專屬性差需要與其他分析方法聯用（GC-MS,LC-MS）9第9頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四五、色譜分離基本原理： 由于混合物中各組分在性質和結構上的差異，與固定相之間產生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經過反復多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。與適當的柱后檢測方法結合，實現混合物中各組分的分離與檢測?！上嗉皟上嗟南鄬\動構成了色譜法的基礎10第10頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四六、色譜分類方法1．按固定相的固定方式分2．按分離機制分：

11第11頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四4．按照展開程序分類 按照展開程序的不同，可將色譜法分為洗脫法、頂替法、和迎頭法。12第12頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四5．按使用領域不同對色譜儀的分類13第13頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四14第14頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四11.2色譜流出曲線（色譜圖）及有

關術語

混合組分的分離過程及檢測器對各組份在不同階段的響應15第15頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四一、色譜分離過程·以吸附色譜為例吸附→解吸→再吸附→再解吸→反復多次洗脫→被測組分分配系數不同→差速遷移→分離分配系數的微小差異→吸附能力的微小差異微小差異積累→較大差異→吸附能力弱的組分先流出；吸附能力強的組分后流出16第16頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四二、色譜流出曲線（色譜圖，chromatogram）試樣中各組分經色譜柱分離后，經過檢測器，按先后次序轉變?yōu)橄鄳碾娦盘枅D。17第17頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四三、常用色譜術語：1、基線：沒有樣品組分流出的曲線，一般是水平線。2．色譜峰：響應信號大小隨時間變化所形成的峰形曲線,一般呈正態(tài)分布。3．峰高與峰面積峰高：色譜峰頂點與峰底之間的垂直距離峰面積：峰與峰底之間的面積18第18頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四4．保留值（Retentionvalue,R）物理意義：用于表征試樣組分被固定相滯留程度。（1）用時間表示的保留值t0死時間:不被固定相吸附或溶解的物質從進樣到出現峰極大值時的時間，它與色譜柱的空隙體積成正比。不與固定相作用，因此，其流速與流動相的流速相近。據t0可求出流動相平均流速19第19頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四b．保留時間tr:試樣從進樣到出現峰極大值所經過的時間。包括隨流動相通過柱子的時間t0

在固定相中滯留的時間c．調整保留時間trˊ:某組份的保留時間扣除死時間后的時間，表示組份在固定相中滯留時間。 保留時間是色譜法定性的基本依據，但同一組分的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積來表示保留值。20第20頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四（2）用相應的流動相體積來表示的保留值a.死體積V0：色譜柱管內固定相顆粒間空隙、色譜儀管路和連接頭間空隙和檢測器間隙的總和。忽略后兩項，可由下式計算 V0=t0Fco（Fco為流速）僅適用于氣相色譜，不適用于液相色譜。

F0-檢測器出口流速：Tr-室溫；Tc-柱溫；Pa-大氣壓；Pw-室溫時水蒸汽壓。21第21頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四b.保留體積Vr

從進樣開始到被測組分在柱后出現濃度極大點時所通過的流動相的體積。保留時間與保留體積關系：VR=tRFcoc．調整保留體積VRˊ某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調整保留體積。22第22頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四3．相對保留值r2,1:組份2的調整保留值與組份1的調整保留值之比。r2,1只與柱溫和固定相性質有關，而與柱內徑、柱長L、填充情況及流動相流速無關。衡量固定相選擇性的指標，又稱選擇因子通常固定一個色譜峰為標準s，然后再求其它峰i對標準峰的相對保留值，此時以a表示：a總是大于1的。23第23頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四5．區(qū)域寬度：用于衡量柱效及反映色譜操作條件下的動力學因素。三種表示方法：標準偏差σ：0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。半峰寬W1/2：峰高一半處的峰寬。W1/2=2.354σ峰底寬W：色譜峰兩側拐點上切線與基線的交點間的距離。24第24頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四色譜流出曲線的意義：·色譜峰數=樣品中單組份的最少個數；·色譜保留值—定性依據；·色譜峰高或面積—定量依據；·色譜保留值或區(qū)域寬度—色譜柱分離效能評價指標·色譜峰間距—固定相或流動相選擇是否合適的依據25第25頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四11.3色譜法基本原理色譜分析的目的:使各組分彼此分離！1.組分在兩相間的分配系數相差足夠大，即與熱力學性質有關。2.傳質和擴散足夠快,

否則每個峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。即與動力學性質有關。因此，應從熱力學和動力學兩方面研究、解釋色譜分離行為26第26頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四描述分配過程參數1．分配系數（Distributionconstant,K）它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度之比值，即分配系數是由組分和固定相的熱力學性質決定的，是每一個溶質特征值,與固定相和溫度有關，與兩相體積、柱管的特性以及所使用的儀器無關。

分配系數的差異是所有色譜分離的實質性的原因。27第27頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四討論1．一定溫度下，組分的分配系數K越大，出峰越慢；2．試樣一定時，K主要取決于固定相性質；3．每個組份在各種固定相上的分配系數K不同；4．選擇適宜的固定相可改善分離效果；5．試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎；6．某組分的K=0時，即不被固定相保留，最先流出。28第28頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四2．分配比:1)定義：在一定溫度和壓力下，組份在兩相間的分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質量比，它反映了組分在柱中的遷移速率。其中Vm≈V0，近似等于死體積V0,Vs為固定相體積。2）意義：k值越大，說明組分在固定相中的量越多，相當于柱的容量大，與體積相關,是容量因子，分配系數是溶質因子。29第29頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四3）分配比k值可直接從色譜圖中測得A．組分滯留因子Rs，由于固定相對組分有保留作用，所以us<uB．又因為：C．因此，得到：分配比與保留時間關系30第30頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四3．K(分配系數)與k(分配比)的關系：β稱為相比率，它也是反映色譜柱柱型特點的參數。填充柱，β=6-3.5；對毛細管柱，β=60-600。4．選擇因子α：色譜柱對A、B兩組分的選擇因子α定義如下：A為先流出的組分，B為后流出的組分。通過選擇因子α把實驗測量值k與熱力學性質的分配系數K直接聯系起來，α對固定相的選擇具有實際意義。31第31頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四注意：分配系數K分配比k及選擇因子α的關系K或k反映的是某一組分在兩相間的分配：而α是反映兩組分間的分離情況！當兩組分K或k相同時，α=1時，兩組分不能分開；當兩組分K或k相差越大時，α越大，分離得越好。也就是說，兩組分在兩相間的分配系數不同，是色譜分離的先決條件。α和k是計算色譜柱分離效能的重要參數！32第32頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四小結：（1）色譜條件一定時，K或k值越大，則組分的保留值也越大。（2）兩個組分的K或k值相等，則兩個組分的色譜峰必將重合。（3）兩個組分的K或k值差別越大，則相應的兩色譜峰相距就越遠。33第33頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四例題某色譜柱,固定相體積為0.5mL,流動相體積為2mL.流動相的流速為0.6mL/min,組分A和B在該柱上的分配系數分別為12和18,求A、B的保留時間和保留體積。Tr=tm(k+1)k=K/βtm＝Vm/F0

β=Vm/VsTr(A)=2/0.6*[(K*Vs/Vm)+1]=2/0.6*[(12*0.5/2)+1]=13.33minTr(B)=2/0.6*[(18*0.5/2)+1]=18.33minVr(B)=tr(A)*F0=13.33*0.6=8mlVr(A)=tr(B)*F0=18.33*0.6=11ml34第34頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四色譜理論色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學和動力學問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價指標及其關系。組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時間：色譜過程的熱力學因素控制.（組分和固定液的結構和性質）色譜峰變寬,色譜過程的動力學因素控制（兩相中的運動阻力，擴散）兩種色譜理論：塔板理論和速率理論；35第35頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四二、峰間距、峰形狀和峰寬的理論描述1．塔板理論（Platetheory）—柱分離效能指標 1952年，Martin等人提出的塔板理論將一根色譜柱當作一個由許多塔板組成的精餾塔，用塔板概念來描述組分在柱中的分配行為。塔板是從精餾中借用的，是一種半經驗理論，但它成功地解釋了色譜流出曲線呈正態(tài)分布。36第36頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四塔板理論假定：1）塔板之間不連續(xù)；2）塔板之間無分子擴散；3）組分在各塔板內兩相間的分配瞬間達至平衡，達一次平衡所需柱長為理論塔板高度H；4）某組分在所有塔板上的分配系數相同；5）流動相以不連續(xù)方式加入，即以一個一個的塔板體積加入。當塔板數n較少時，組分在柱內達分配平衡的次數較少，流出曲線呈峰形，但不對稱；當塔板數n>50時，峰形接近正態(tài)分布。37第37頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四塔板數n可用以評價一根柱子的柱效。色譜柱長：L，虛擬的塔板間距離：H,色譜柱的理論塔板數：n則三者的關系為：n=L/H理論塔板數與色譜參數之間的關系為：n越多，H越小、色譜峰越窄，則柱效越高。38第38頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四2．有效塔板數有效塔板高度·計算出來的n和H值有時并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因為采用tr計算時，沒有扣除死時間tM，所以需引入有效塔板數和有效塔板高度表示柱效：39第39頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四有關塔板理論的說明：1）說明柱效時，必須注明該柱效是針對何種物質、固定液種類及其含量、流動相種類及流速、操作條件等；2）應定期對柱效進行評價，以防柱效下降，延長柱壽命。3）塔板理論描述了組分在柱內的分配平衡和分離過程、導出流出曲線的數學模型、解釋了流出曲線形狀和位置、提出了計算和評價柱效的參數。40第40頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四該理論缺點:不考慮分子擴散、其它動力學因素。不能解釋峰形為什么會擴張？不能解釋影響柱效的動力學因素是什么？柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當兩組分的分配系數K相同的，無論該色譜柱的塔板數多大，都無法分離。塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實驗結果，無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。41第41頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四2．速率理論（Ratctheory）-考慮擴散傳質因素vanDeemter方程：u為流動相線速度：A，B，C為常數，其中 A—分別表示渦流擴散系數； B—分子擴散系數； C—傳質阻力系數（包括液相和固相）。 從動力學角度解釋了影響板高（柱效）的各種因素！任何減少方程右邊三項數值的方法，都可降低H，從而提高柱效。H與u成反比H與u成正比42第42頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四1）渦流擴散項由于受到固定相顆粒的阻礙，組份在遷移過程中隨流動相不斷改變方向，形成紊亂的“渦流”；從圖中可見，因填充物顆粒大小及填充的不均勻性——同一組分運行路線長短不同——流出時間不同——峰形展寬。展寬程度以A表示： A=2λdp

dp—填充物平均直徑；λ—填充不規(guī)則因子。使用細粒的固定相并填充均勻可減小A，提高柱效。對于空心毛細管柱，無渦流擴散，即A=0。43第43頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四2）分子擴散項因濃度梯度面向前后自發(fā)地擴散，使譜峰展寬。 B=2γD

(樣品注入時呈“塞子”狀分布)γ—稱為彎曲因子，它表示固定相幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況：D—組分在流動相中的擴散系數?！し肿恿看蟮慕M分，Dg小，即B小·Dg隨柱溫升高而增加，但反比與柱壓；·流動相分子量大，Dg小，即B小：·μ增加，組份停留時間短，縱向擴散??；·對于液相色譜，因Dg較小，B項可忽略。44第44頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四3）傳質阻力項-峰展寬因傳質阻力的存在，使分配不能“瞬間”達至衡.a）氣相色譜：

·減小填充顆粒直徑dp·采用分子量小的流動相，使Dg增加；·減小液膜厚度dj，Cl下降, 但k(容量因子)又減小,Cl增加。但當固定液含量一定,增加比表面來降低dj。但比表面過大會因吸附過強使峰拖尾?！ぴ黾又鶞?，可增加Dl，但k值減小.為保持合適Cl值，應控制柱溫。45第45頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四b）液液色譜：傳質阻力項C包括流動相傳質阻力系數Cm和固定相傳質阻力系數Cs。·流動相中的傳質阻力Cm、滯留的流動相傳質阻Cs力。分別與填充物大小dp、擴散系數（Dm）、微孔大小及其數量等有關。 降低流動相傳質阻力的方法有：細顆粒固定相、增加組分在固定相和流動相中的擴散系數D、適當降低線速度、短柱?！す潭ㄏ鄠髻|阻力與液膜厚度dj、保留因子k和擴散系數Ds等有關.降低固定相傳質阻力的方法有：與氣液色譜中的表述相同。46第46頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四11.4分離度及色譜分離方程

圖中（a）兩色譜峰距離近并且峰形寬。兩峰嚴重相疊，這表示選擇性和柱效都很差。圖中（b）雖然兩峰距離拉開了，但峰形仍很寬，說明選擇性好，但柱效低。圖中（c）分離最理想，說明選擇性好，柱效也高。由此可見，單獨用柱效或選擇性不能真實反映組分在色譜柱中分離情況，故需引入一個綜合性指標——分離度R。47第47頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四一、分離度（Resolution,R）同時反映色譜柱效能和選擇性的一個綜合指標。也稱總分離效能指標或分辨率。其定義為：當R<1時，兩峰有部分重疊；當R=1時，分離程度可達98%；當R=1.5時，分離程度可達99.7%。R越大，相鄰組分分離越好通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標志。48第48頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四49第49頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四二、色譜分離方程

n柱效α選擇因子k分配比也稱容量因子說明:針對后流出組分針對兩組分,一般大于1R=50第50頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四有關色譜方程的討論：1）分離度R與柱效的關系可通過增加柱長提高分離度,然而要增加1倍分離度，柱長必須增加四倍,分析時間也相應增加，且峰寬也展寬！為提高柱效，用減小塔板高度H的方法比增加柱長更有效。51第51頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四2）分離度R與選擇因子α的關系由基本色譜方式式判斷，當α=1時，R=0，這時，無論怎樣提高柱效也無法使兩組分離。顯然，α越大，柱選擇性越好，對分離有利。α的微小變化可引起R較大改變。如，當α從1.01倍增加至1.10（增加9%）時，R則增加9倍（但α>1.5,R增加不大）。改變α的方法有：降低柱溫、改變流動相及固定相的性質和組成。52第52頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四3．分離度與容量因子的關系如果設：則分離方程式寫成k增加，分離度R增加，但當k>10，則R的增加不明顯。通常k在2~10，則R的增加不明顯。通常k在2~10之間。改變k的方法有：增加柱溫（GC）、流動相性質和組成（LC）以及固定相含量。53第53頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四溶劑（流動相）組成對色譜分離的影響1：9，10-蒽醒；2：2-甲基-9，10-蒽醒；3：2-乙基-9，10-蒽醒4：1，4-二甲基9，10-蒽醒；5：2-特丁基甲基9，10-蒽醒；54第54頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四某組成的流動相可能使部分待測物得到好的分離，但同時使其它待測物的分離不令人滿意！實際工作中采用程序升溫（GC）和梯度淋洗（LC）來解決這個問題。55第55頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四三、分析時間t分析時間通常指最后一個組分出峰的時間由以下三式：得到可見，分析時間與R,α,k、H/u等參數有關。R增加1倍，分析時間則是原來的4倍。實際工作中，即要能獲得有效的分離，又要在較短時間內完成分析。56第56頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四5．基本色譜分離方程式的應用 在實際中，基本色譜分離方程式是很有用的公式，它將柱效、選擇因子、分離度三者的關系聯系起來了，知道其中兩個指標，就可計算出第三個指標。57第57頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四58第58頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四解法1：先求出組分2對組分1的相對保留值r2,1（即α值）59第59頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四60第60頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四61第61頁，共68頁，2023年，2月20日，星期四[例2]已知某色譜柱的理論塔板數為3600，組分A和B在該柱上的保留時間為27mm和30mm,求兩峰的峰半寬和分離度。62