蛋白質(zhì)化學(xué) (2)課程

蛋白質(zhì)化學(xué)(2)課程第1頁/共126頁問題什么是蛋白質(zhì)?什么是蛋白質(zhì)分子?蛋白質(zhì)化學(xué)的內(nèi)容是什么?

第2頁/共126頁蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能

蛋白質(zhì)的定義

蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的化學(xué)組成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系理化性質(zhì)和分離提純第3頁/共126頁蛋白質(zhì)的定義蛋白質(zhì)的定義proteinisderivedfromtheGreekwordπρωτειο?(proteios),meaning"inthelead"or"standinginfront".or

"

themostimportant"蛋白質(zhì)分子

蛋白質(zhì)的最小功能單位第4頁/共126頁蛋白質(zhì)的分類

按形狀分：

按組成分

按功能分按結(jié)構(gòu)分第5頁/共126頁按形狀分類軸比：長(zhǎng)軸與短軸的比例。10:1纖維狀蛋白

Fibrousproteins球狀蛋白質(zhì)

Globularproteins膜蛋白

Membraneproteins第6頁/共126頁纖維狀蛋白

a-Keratina-ibroinandβ-Keratin:β-SheetProteinsTripleHelix

:Collagen第7頁/共126頁球狀蛋白質(zhì)第8頁/共126頁膜蛋白

第9頁/共126頁按組成分類

終產(chǎn)物氨基酸

簡(jiǎn)單蛋白（simpleprotein）

結(jié)合蛋白（conjugatedprotein）第10頁/共126頁分類溶解度實(shí)例可溶不溶或沉淀清蛋白(albumins)水、稀鹽、稀酸、稀堿飽和硫酸銨血清清蛋白、卵清蛋白球蛋白（globulins）稀鹽、稀酸、稀堿水、1/2飽和硫酸銨血清清蛋白、溶菌酶谷蛋白(glutelins)稀酸、稀堿水、稀鹽麥谷蛋白醇溶蛋白(prolamines)70%~90%乙醇水小麥醇溶谷蛋白組蛋白(histones)水、稀酸氨水富含Arg、Lys的堿性蛋白，與DNA結(jié)合精蛋白(protamines)水、稀酸氨水富含Arg、Lys，缺少Trp、Tyr硬蛋白(scleroproteins)水、稀鹽、稀酸、稀堿角蛋白、膠原蛋白簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)第11頁/共126頁分類輔基實(shí)例核蛋白類DNA或RNA病毒、脫氧核糖蛋白糖蛋白類糖類免疫球蛋白、血型糖蛋白脂蛋白類脂類血細(xì)胞凝集素磷蛋白類磷酸基乳酪蛋白黃素蛋白類黃素腺嘌呤二核苷酸或黃素單核苷酸氨基酸氧化酶、琥珀酶脫氨酸色蛋白類血紅素或葉綠素血紅蛋白、葉綠素蛋白金屬蛋白金屬離子，如:Fe、Mo、Cu、Zn等固氮酶、鐵氧還蛋白結(jié)合蛋白第12頁/共126頁蛋白質(zhì)在生命活動(dòng)中的作用生物體的組成成分-結(jié)構(gòu)酶運(yùn)輸運(yùn)動(dòng)抗體激素遺傳信息的控制細(xì)胞膜的通透性記憶、識(shí)別按功能分類第13頁/共126頁以上分類方法各有什么好處?第14頁/共126頁蛋白質(zhì)的化學(xué)組成

一、蛋白質(zhì)的元素組成特征

二、蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位

三、氨基酸的主要理化性質(zhì)第15頁/共126頁蛋白質(zhì)的元素組成所有蛋白質(zhì)均含有C:50-55%H:6％-8％O:20％-23％

N:15％-17％某些蛋白質(zhì)含有：S，P等非金屬元素個(gè)別蛋白質(zhì)含有：Zn,Fe,Cu等金屬元素第16頁/共126頁蛋白質(zhì)的元素組成特點(diǎn)各種蛋白質(zhì)的平均含量氮為16％左右蛋白質(zhì)含量（克%）=每克生物樣品中含氮的克數(shù)

6.25（蛋白質(zhì)系數(shù)）凱氏（Kjeldahl）定氮法測(cè)定第17頁/共126頁蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法最常用的四種基本方法：定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚法（Lowry法）和紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。其中：Bradford法和Lowry法靈敏度比紫外法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)。第18頁/共126頁凱氏（Kjeldahl）定氮消化、蒸餾和滴定第19頁/共126頁方法選擇每種測(cè)定法各有優(yōu)缺點(diǎn)。選擇時(shí)應(yīng)考慮：①對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間?？捡R斯亮藍(lán)法（Bradford法），越來越廣泛的應(yīng)用第20頁/共126頁我國(guó)的牛奶事件

三聚氰胺“白色血液”0r牛奶致癌

性激素、IGF-1

第21頁/共126頁三聚氰胺牛奶按照我國(guó)制定的生鮮牛奶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，原奶的蛋白質(zhì)含量在2.9％以上，即100克生鮮牛奶的蛋白質(zhì)含量在2.9克以上屬于合格產(chǎn)品，如低于2.9％，就意味著向原奶里摻加了水。我國(guó)目前采用的檢測(cè)牛奶蛋白質(zhì)含量的方法是凱氏定氮法。凱氏定氮法的缺點(diǎn)是：能檢測(cè)出氮元素的量，而檢測(cè)不出氮屬于什么化合物。三聚氰胺（Melamine）（C3H6N6），俗稱密胺、蛋白精，IUPAC命名為“2,4,6-三氨基-

1,3,5-三嗪”，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，被用作化工原料。白色單斜晶體，幾乎無味，微溶于水（3.1g/L常溫），可溶于甲醇、甲醛、乙酸等，不溶於丙酮、醚類、對(duì)身體有害，不可用於食品加工或食品添加物。由它制成的樹脂可用作阻燃劑。它也是殺蟲劑環(huán)丙氨嗪在動(dòng)物和植物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。第22頁/共126頁蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位

氨基酸的結(jié)構(gòu)

氨基酸的分類

稀有氨基酸

非蛋白質(zhì)氨基酸第23頁/共126頁構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位

---氨基酸（AminoAcid）自然界氨基酸有300種，蛋白質(zhì)氨基酸有20種。蛋白質(zhì)氨基酸結(jié)構(gòu)：L-氨基酸通式第24頁/共126頁記住三字母第25頁/共126頁第26頁/共126頁蛋白質(zhì)氨基酸分類按R基的極性性質(zhì)（即細(xì)胞內(nèi)的pH范圍時(shí)的解離狀態(tài)）按R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)按R基極酸堿性分類按來源分類不同分類方法有不同的用途第27頁/共126頁按R側(cè)鏈極性分為四大類不帶電荷極性氨基酸：Gly,Ser,Thr,Cys,Thr,Asn,Gln帶負(fù)電荷極性氨基酸：Asp,Glu帶正電荷極性氨基酸His,Arg,Lys非極性氨基酸：Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Phe,Trp,Met第28頁/共126頁按R基的結(jié)構(gòu)分類1．脂肪族氨基酸：一氨基一羧基氨基酸：甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸羥基氨基酸：絲氨酸，蘇氨酸。含硫氨基酸：半胱氨酸，甲硫氨酸（蛋氨酸）酰胺基氨基酸：天冬酰胺，谷氨酰胺。一氨基二羧基氨基酸：天冬氨酸，谷氨酸。二氨基一羧基氨基酸：賴氨酸，精氨酸。

2.芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸。3.雜環(huán)族氨基酸：色氨酸、組氨酸、脯氨酸。第29頁/共126頁1、中性AA（有極性與非極性15種）2、酸性AA（2種）：天冬氨酸、谷氨酸3、堿性AA（3種）：組、賴、精按R基酸堿性分類第30頁/共126頁按R側(cè)鏈極性分類有何優(yōu)點(diǎn)氨基酸開發(fā)應(yīng)用氨基酸工業(yè)是自20世紀(jì)50年代以來，一個(gè)朝氣蓬勃的新興工業(yè)體系。氨基酸的研究、開發(fā)和應(yīng)用方面均取得重大進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)的新氨基酸種類和數(shù)量已由60年代50種左右，發(fā)展到80年代的400種，目前已達(dá)1000多種。其中用于藥物的氨基酸及氨基酸衍生物的品種達(dá)100多種。我國(guó)藥用氨基酸原料生產(chǎn)廠現(xiàn)今已發(fā)展到40多家，產(chǎn)量由1994年的600多t增長(zhǎng)4000多t，18種基本氨基酸中已有17種實(shí)現(xiàn)了國(guó)產(chǎn)化。氨基酸在醫(yī)藥上主要用作氨基酸輸液和口服氨基酸制劑，此外還用作治療藥物、短肽藥物和醫(yī)藥合成原料。

第31頁/共126頁蛋白質(zhì)氨基酸的理化性質(zhì)物理性質(zhì)旋光性紫外吸收氨基酸的等電點(diǎn)氨基酸的化學(xué)性質(zhì)第32頁/共126頁氨基酸物理性質(zhì)無色晶體、有味（甜、鮮、苦）或無味，不同程度溶于水、稀酸、稀堿，但不溶于任何有機(jī)溶劑。光學(xué)性質(zhì)：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸有紫外吸收，各種氨基酸在可見區(qū)都沒有光吸收除甘氨酸外，氨基酸均含有一個(gè)手性-碳原子，因此都具有旋光性。氨基酸的比旋光度是物理常數(shù)之一。第33頁/共126頁D-型和L-型第34頁/共126頁氨基酸D-型和L-型構(gòu)型

COO-

COO-NH3+CHHCNH3+RR根據(jù)甘油醛原則確定構(gòu)型自然界的氨基酸有兩種構(gòu)型除甘氨酸外，其余19種氨基酸都是L-型第35頁/共126頁D-型和L-型的生理意義？飼用氨基酸？第36頁/共126頁氨基酸的光吸收特征

色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的最大吸收波長(zhǎng)分別為279、278、259nm利用紫外分光光度計(jì)（280nm處）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的基礎(chǔ)。

第37頁/共126頁氨基酸的兩性解離與等電點(diǎn)氨基酸在結(jié)晶形態(tài)或水溶液中氨基是以-NH3+存在，羧基以-COO-存在。氨基酸的等電點(diǎn)（Isoelectricpoint,PI）：氨基酸所帶凈電荷為零時(shí)溶液的pH值第38頁/共126頁氨基酸等電點(diǎn)的滴定第39頁/共126頁第40頁/共126頁氨基酸等電點(diǎn)與溶液pH的關(guān)系?第41頁/共126頁稀有氨基酸除了20種常見氨基酸以外，還有一些僅存在于少數(shù)蛋白質(zhì)中的氨基酸。例如：膠原蛋白中羥脯氨酸和羥賴氨酸；甲狀腺球蛋白中的二碘酪氨酸和甲狀腺素；肌球蛋白中的ε-N-甲基賴氨酸；

α-角蛋白中的胱氨酸上述氨基酸是常見氨基酸的衍生物,沒有遺傳密碼，是通過有關(guān)酶的催化修飾而形成的。第42頁/共126頁非蛋白質(zhì)氨基酸

第43頁/共126頁蛋白質(zhì)氨基酸測(cè)定蛋白質(zhì)水解氨基酸分離氨基酸測(cè)定第44頁/共126頁1、蛋白質(zhì)酸水解常用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸，回流煮沸20小時(shí)左右使蛋白質(zhì)完全水解。優(yōu)點(diǎn)：不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸。缺點(diǎn)：色氨酸完全被破壞；羥基氨基酸（絲或蘇）部分被分解，天門冬酰胺和谷氨酰胺酰胺基水解成羧基。第45頁/共126頁2、蛋白質(zhì)堿水解

一般用5mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時(shí)。優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)完全水解，色氨酸不破壞。缺點(diǎn)：許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。部分的水解產(chǎn)物消旋化，是D-型和L-型氨基酸的混合物。第46頁/共126頁3、蛋白質(zhì)酶水解優(yōu)點(diǎn)：不會(huì)破壞氨基酸，不發(fā)生消旋化。缺點(diǎn)：一種酶往往水解不徹底，需多種酶協(xié)同作用。所需時(shí)間較長(zhǎng)。最常見的蛋白水解酶有以下幾種：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶等。第47頁/共126頁氨基酸分離第48頁/共126頁氨基酸的化學(xué)反應(yīng)α-氨基的化學(xué)反應(yīng)

α-羧基的化學(xué)反應(yīng)R-基的化學(xué)反應(yīng)第49頁/共126頁成肽反應(yīng)

肽鍵：蛋白質(zhì)分子中氨基酸的-COOH和氨基酸的-NH2脫水縮合而成的酰胺鍵。

肽：由肽鍵形成的化合物第50頁/共126頁α-氨基的化學(xué)反應(yīng)

氨基酸α-氨基反應(yīng)具有特殊的意義:

茚三酮的反應(yīng)

Sanger反應(yīng)

Edman反應(yīng)氨基酸的α-羧基可以和堿作用生成鹽。其重金屬鹽不溶液于水。氨基酸的羧基可以被醇類所酯化而生成相應(yīng)的酯。第51頁/共126頁茚三酮的反應(yīng)第52頁/共126頁2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)萘磺酰氯（DNS-Cl）第53頁/共126頁Edman法（異硫氰酸苯酯）第54頁/共126頁Edman降解法測(cè)定氨基酸序列第55頁/共126頁R-基的化學(xué)反應(yīng)

絲氨酸、蘇氨酸、羥脯氨酸羥基能成酯。酪氨酸苯酚基，組氨酸咪唑基具有芳香環(huán)或雜環(huán)，能與重氮化合物結(jié)合而生成棕紅色化合物，可以定性、定量測(cè)定半胱氨酸側(cè)鏈的巰基（-SH），易被氧化生成胱氨酸，胱氨酸中的二硫鍵在形成蛋白質(zhì)的構(gòu)象上起很大的作用。Ag＋、Hg2＋能與巰基反應(yīng)，生成硫醇鹽。第56頁/共126頁H2N—CHCH2SSHNO2HOOCSNO2COOHCOOH+SSNO2NO2HOOCCOOHH2N—CH—COOH+CH2SHpH8.0硫代硝基苯甲酸測(cè)定Cys含量（pH8.0λ412nm的摩爾消光系數(shù)ε=13600）第57頁/共126頁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的層次初級(jí)結(jié)構(gòu)：氨基酸排列順序高級(jí)結(jié)構(gòu):二級(jí)結(jié)構(gòu)：主鏈骨架的局部空間結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu)：二級(jí)結(jié)構(gòu)單位的集合體結(jié)構(gòu)域：多肽可以明顯區(qū)分的球狀區(qū)域三級(jí)結(jié)構(gòu)：整個(gè)多肽鏈所有原子的空間排布四級(jí)結(jié)構(gòu)：由亞基或分子締和而成的集合體第58頁/共126頁蛋白質(zhì)與多肽蛋白質(zhì)與多肽并無嚴(yán)格的界線:1.蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大,從大約6000到1000000道爾頓甚至更大。通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)；2.構(gòu)象的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)比多肽穩(wěn)定第59頁/共126頁蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（proteinprimarystructure）又稱初級(jí)結(jié)構(gòu)，共價(jià)結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)多肽鏈氨基酸的組成和排列順序。游離的-氨基端稱為氨基端或N-端；游離的-羧基端稱為羧基端或C-端。多肽鏈上不完整的氨基酸，稱為氨基酸殘基第60頁/共126頁蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析包括:組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目多肽鏈的氨基酸數(shù)目、種類多肽鏈的氨基酸順序二硫鍵的數(shù)目和位置其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序。第61頁/共126頁蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次與慨念?第62頁/共126頁GSH與GSSG第63頁/共126頁谷胱甘肽（GSH）2GSHGSSG第64頁/共126頁一級(jí)結(jié)構(gòu)的表示氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序。如上述五肽可表示為：

Ser-Val-Tyr-Asp-Gln第65頁/共126頁一級(jí)結(jié)構(gòu)分析第66頁/共126頁氨基酸自動(dòng)測(cè)序儀

第67頁/共126頁蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原理肽單位平面結(jié)構(gòu)和二面角維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵二級(jí)結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)第68頁/共126頁蛋白質(zhì)的構(gòu)象原理1.構(gòu)型與構(gòu)象構(gòu)型是指在立體異構(gòu)體中取代原子或基團(tuán)在空間的取向。構(gòu)型互變-共價(jià)鍵的破裂構(gòu)象是指基團(tuán)當(dāng)單鍵旋轉(zhuǎn)時(shí)可能形成的不同的立體結(jié)構(gòu)。構(gòu)象改變并不涉及共價(jià)鍵的破裂。

2.多肽鏈折疊的空間限制

肽骨架由肽平面組成

肽平面繞Cα-N1和Cα-C2鍵旋轉(zhuǎn)。Φ和Ψ可以取-180‘—+180’之間的一值。但Φ和Ψ的大小受R基影響。第69頁/共126頁肽鍵（peptidebond）：肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)組成肽鍵的原子處于同一平面。

0.127nm鍵長(zhǎng)=0.132nm

0.148nmC—NC=N第70頁/共126頁肽平面（peptideplane）:連接在肽鍵上的六個(gè)原子共處于一個(gè)平面上，此平面稱為肽平面。第71頁/共126頁兩面角（dihedralangle）

Cα碳原子位于兩個(gè)肽平面的交線上。Cα上的Cα-N和Cα-C都是可繞鍵旋轉(zhuǎn)，其中以Cα-N旋轉(zhuǎn)的角度稱為ф，而以Cα-C旋轉(zhuǎn)的角度稱為ψ，這就是α-碳原子上的一對(duì)二面角。第72頁/共126頁維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵

離子鍵(a)氫鍵（b）疏水作用力(c)范德華引力(d)配位鍵、二硫鍵(e)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象主要靠非共價(jià)鍵維持第73頁/共126頁二級(jí)結(jié)構(gòu)

（secondarystructure）指多肽鏈主鏈在一級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步的盤旋或折疊，形成的周期性構(gòu)象，又稱為主鏈空間結(jié)構(gòu)，主鏈構(gòu)象結(jié)構(gòu)單元。維系二級(jí)結(jié)構(gòu)的力是氫鍵。二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式

α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、γ-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲第74頁/共126頁α-螺旋(α-helix)

第75頁/共126頁3.613螺旋每一圈含3.6個(gè)殘基，13個(gè)原子，螺距0.54nm，殘基高0.15nm，螺旋半徑0.23nmφ角-57°，ψ角等于-47°。相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵。即一個(gè)肽單位的基氧原子與其前的第三個(gè)肽單位的基氫原子生成一個(gè)氫鍵。氫鍵與螺軸幾乎平行。所有肽鍵都能參與鏈內(nèi)氫鍵的形成。與α-碳原子相連的R側(cè)鏈，位于α-螺旋的外側(cè)。由1條充分伸展的肽鏈的肽鍵平面折疊成的右手螺旋。第76頁/共126頁β-折疊（β-sheet）多肽鏈中一段較伸展的周期性折疊的鋸齒形的主鏈構(gòu)象β-折疊有兩種類型:即平行結(jié)構(gòu)和反平行結(jié)構(gòu).第77頁/共126頁-折疊-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒樁折疊構(gòu)象。在-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團(tuán)處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個(gè)氨基酸之間的軸心距為0.35nm。-折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。第78頁/共126頁β-轉(zhuǎn)角(β-turn)又稱為β-回折、β-彎曲或發(fā)卡結(jié)構(gòu).是多肽鏈180回折處的特殊結(jié)構(gòu)。在第一個(gè)氨基酸殘基的C=O和第四個(gè)氨基酸殘基的N-H之間形成一個(gè)氫鍵。第79頁/共126頁無規(guī)卷曲（randomcoil）蛋白質(zhì)的肽鏈中沒有確定規(guī)律性肽段構(gòu)象。結(jié)構(gòu)比較松散。和α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角比較是不規(guī)則的，但對(duì)于一些蛋白質(zhì)分子來講，特定的無規(guī)卷曲構(gòu)象是不能被破壞的，否則就失去活性。γ-轉(zhuǎn)角（γ-turnangle）存在于蛋白質(zhì)180回折處，是由3個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成，第一個(gè)和第三個(gè)殘基之間形成兩個(gè)氫鍵以維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定第80頁/共126頁二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)第81頁/共126頁超二級(jí)結(jié)構(gòu)（supersecondarystructure）

球狀蛋白質(zhì)分子中的一級(jí)結(jié)構(gòu)順序上相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)常常在三維中相互靠近，在局部區(qū)域形成規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)的聚合體。motif

常見的超二級(jí)結(jié)構(gòu)類型第82頁/共126頁結(jié)構(gòu)域（domain）結(jié)構(gòu)域(strucburaldomain)或稱轄區(qū)，是近似球狀的三維實(shí)體。對(duì)于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相對(duì)獨(dú)立的三維實(shí)體締合而成三級(jí)結(jié)構(gòu)。丙酮酸激酶的一個(gè)結(jié)構(gòu)域第83頁/共126頁超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級(jí)結(jié)構(gòu)是若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。是蛋白質(zhì)二級(jí)至三級(jí)結(jié)構(gòu)的一種過渡態(tài)構(gòu)象層次。結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位。在超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞曲折疊成緊密的近似球行的結(jié)構(gòu)，具有部分生物功能。對(duì)于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)域締合而成三級(jí)結(jié)構(gòu)。第84頁/共126頁蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)

（tertiarystructure）

指一條多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)（超二級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域）的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步盤繞、折疊而成的具有特定肽鏈走向的緊密球狀結(jié)構(gòu),或者說三級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中所有原子的空間排布。維系三級(jí)結(jié)構(gòu)的力有疏水作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵第85頁/共126頁鯨肌紅蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)1957年由JohnKendrew用X射線晶體分析法測(cè)定的有三維結(jié)構(gòu)1）由一條多肽鏈（153個(gè)Aa殘基）和一個(gè)血紅素組成。2）多肽鏈主鏈主鏈骨架折疊、盤繞成A,B,C,D,E,F,G,H8個(gè)肽段3）8個(gè)肽段均為α-螺旋結(jié)構(gòu)，兩段之間的拐角處形成無規(guī)卷曲4）親水氨基酸分布于分子的外表面，Mb溶于水5）疏水氨基酸包埋于分子內(nèi)部，形成疏水空穴，血紅素輔基位于其中第86頁/共126頁四級(jí)結(jié)構(gòu)由具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈通過非共價(jià)鍵連接起來的結(jié)構(gòu)形式；最小的單位通常稱為亞基或亞單位Subunit，亞基,分別以α、β、γ、δ、ε命名。根據(jù)亞基數(shù)目的不同，可分為二聚體、三聚體、四聚體等。寡聚蛋白(Oligomerprotein)與多聚蛋白(polymerprotein)。四級(jí)結(jié)構(gòu)包括亞基的種類、數(shù)目、空間排布以及相互作用。亞基的排列是對(duì)稱的。維持四級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力是疏水鍵、離子鍵、氫鍵、范德華引力。主要是疏水力。第87頁/共126頁Hb（hemeglobin）四級(jí)結(jié)構(gòu)第88頁/共126頁Mb與Hb第89頁/共126頁結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系高級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第90頁/共126頁一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1、一級(jí)結(jié)構(gòu)中個(gè)別氨基酸改變可能改變功能Cys-Tyr-Phe-Glu-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly加壓素SSCys-Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly

催產(chǎn)素SS2、關(guān)鍵肽端的改變導(dǎo)致功能改變ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素)SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDELAEAFPLEF第91頁/共126頁一級(jí)結(jié)構(gòu)反映物種的進(jìn)化-分子進(jìn)化細(xì)胞色素C的種屬差異性（以人為標(biāo)準(zhǔn)）物種殘基改變數(shù)物種殘基改變數(shù)黑猩猩0雞、火雞13牛羊豬10昆蟲20馬12酵母45第92頁/共126頁一級(jí)結(jié)構(gòu)改變引起分子病

最早從分子水平證明的先天性遺傳病—鐮刀形紅細(xì)胞貧血癥。第93頁/共126頁高級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)變性（proteindenaturation）

理化因素使天然蛋白質(zhì)失去原有的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性。蛋白質(zhì)的變性只是三維構(gòu)象的改變，不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。包括可逆和不可逆變性。變性蛋白的特征：溶解度降低黏度變化易被酶水解凝固生物學(xué)活性喪失第94頁/共126頁牛胰RNase的可逆變性第95頁/共126頁血紅蛋白的變構(gòu)與輸氧功能變構(gòu)作用（allostericeffect）是指對(duì)于多亞基的蛋白質(zhì)或酶，效應(yīng)劑作用于某個(gè)亞基，引發(fā)其構(gòu)象改變，繼而引起其他亞基構(gòu)象的改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)或酶的生物活性的變化。這樣的效應(yīng)劑也稱變構(gòu)劑。血紅蛋白中的4個(gè)亞基與氧分子的親和性不同。氧分子與血紅蛋白的一個(gè)亞基結(jié)合后，引起其構(gòu)象發(fā)生改變，這種變化在亞基之間傳遞，改變了其他亞基與氧的結(jié)合能力。第96頁/共126頁第97頁/共126頁氧合可以引發(fā)血紅蛋白4個(gè)亞基的8對(duì)離子鍵相繼斷開，從緊湊的T構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)樗沙诘腞構(gòu)象第98頁/共126頁蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

第99頁/共126頁蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量蛋白質(zhì)相對(duì)分子量在10000-1000000之間。測(cè)定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。最準(zhǔn)確可靠的方法是超離心法（Svedberg于1940年）蛋白質(zhì)顆粒在25-50X104g離心力作用下從溶液中沉降下來。沉降系數(shù)（s）：?jiǎn)挝浑x心場(chǎng)的沉降速度。沉降系數(shù)單位常用S，1S=1×10-13（s）第100頁/共126頁蛋白質(zhì)分子量（M）與沉降系數(shù)（s）關(guān)系M=——————RTsD（1－Vρ）R—?dú)怏w常數(shù)（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T—絕對(duì)溫度D—擴(kuò)散常數(shù)（蛋白質(zhì)分子量很大，離心機(jī)轉(zhuǎn)速很快，則忽略不計(jì)）V—蛋白質(zhì)的微分比容（m3·g-1）ρ—溶劑密度（20℃，g·ml-1）

s—沉降系數(shù)第101頁/共126頁反應(yīng)名稱試劑顏色反應(yīng)有關(guān)基團(tuán)蛋白質(zhì)或氨基酸雙縮脲反應(yīng)NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個(gè)以上肽鍵所有蛋白質(zhì)米倫反應(yīng)HgNO3、Hg(NO3)及HNO3混合物紅色

Tyr黃色反應(yīng)濃HNO3及NH3黃色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反應(yīng)乙醛酸試劑及濃H2SO4紫色

Trp坂口反應(yīng)α-萘酚、NaClO紅色胍基Arg酚試劑反應(yīng)堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍(lán)色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反應(yīng)茚三酮藍(lán)色自由氨基及羧基α-氨基酸

蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)—OHN第102頁/共126頁蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)能發(fā)生兩性離解，有等電點(diǎn)。在電場(chǎng)中，如果蛋白質(zhì)分子所帶正電荷多于負(fù)電荷，凈電荷為正，則向負(fù)電極移動(dòng)，反之，凈電荷為負(fù)，向正極移動(dòng)，這種泳動(dòng)現(xiàn)象稱電泳。利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。第103頁/共126頁蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點(diǎn)與氨基酸的兩性解離與等電點(diǎn)有何異同，聯(lián)系?第104頁/共126頁蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去第105頁/共126頁蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶電荷和水化作用有關(guān)。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)溶解性質(zhì)在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)的沉淀分為可逆沉淀和不可逆沉淀?？赡娉恋碛址Q為非變性沉淀。如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。不可逆沉淀又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等。第106頁/共126頁

蛋白質(zhì)分離提純的一般原則蛋一般程序分前處理、粗分級(jí)和細(xì)分級(jí)三步。

第一步是前處理(pretreatment)。把蛋白質(zhì)從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，生物活性。

第二步是粗分級(jí)(roughfractionation)。蛋白質(zhì)混合物選用適當(dāng)方法，將所要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白質(zhì)分離開來。一般用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等。

第三步是細(xì)分級(jí)(finefractionation)。樣品經(jīng)粗分級(jí)后，使用層析法，電泳法等進(jìn)一步提純。第107頁/共126頁1．前處理

選擇適當(dāng)?shù)纳锊牧?，加上適當(dāng)?shù)某樘嵩噭?，?.1mol／LNaCl溶液，采用適當(dāng)?shù)募?xì)胞破碎方法，對(duì)生物材料進(jìn)行細(xì)胞破碎，使蛋白質(zhì)充分釋放到溶液中．離心，除去沉淀，得到上清液。第108頁/共126頁沉淀分離

采用適當(dāng)?shù)某恋矸?，從抽提液中分離目的蛋白。

硫酸銨分段鹽析法

乙醇分段沉淀法

等電點(diǎn)沉淀法

選擇性變性法原理有什么不同?第109頁/共126頁

純化

如果要均一的高純度蛋白質(zhì)制劑，需要進(jìn)一步提純。通常采用柱層析法。如：離子交換柱層析，分子篩層析、親和層析、疏水吸附層析、高效液相層析等。通常采用制備性電泳法進(jìn)一步提純，如：制備性聚丙烯酰胺凝膠電泳、蔗糖密度梯度等電聚焦電泳等。電泳法只能處理少量的樣品，因此，在提純后期使用比較合適。也可采用結(jié)晶法對(duì)目的蛋白質(zhì)進(jìn)一步提純。蛋白質(zhì)制劑必須達(dá)到較高的純度(大約是50％