實驗二植物體內(nèi)硝酸還原酶活力的測定

實驗二植物體內(nèi)硝酸還原酶活力的測定第1頁/共15頁NO3-和NH4+是能被植物利用的最主要的氮源。在一般田間條件下，NO3-

是植物吸收的主要形式。第2頁/共15頁硝酸鹽的還原硝酸鹽硝酸還原酶亞硝酸鹽氨亞硝酸還原酶第3頁/共15頁

硝酸還原酶是一種誘導(dǎo)酶，在植物體內(nèi)本來不含有，但在特定外來物質(zhì)的如NO3-誘導(dǎo)下可以生成硝酸還原酶。第4頁/共15頁硝酸還原酶（NR）是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽：

NO3-+NADH+H+NO2-+NAD++H2O

產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對-氨基苯磺酸（或?qū)Π被交酋０罚┘唉?萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。NR【實驗原理】第5頁/共15頁

生成的紅色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法測定。硝酸還原酶活性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般以單位時間內(nèi)每克鮮重含氮量表示，即以μg/g/h為單位。NR的測定可分為活體法和離體法?；铙w法步驟簡單，適合快速、多組測定。離體法復(fù)雜，但重復(fù)性較好。第6頁/共15頁第7頁/共15頁小麥的新鮮葉片（誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組）【實驗材料】第8頁/共15頁⑴冷凍離心機(jī)；⑵分光光度計；⑶天平(0.01g)；⑷冰箱；⑸恒溫水?。虎恃欣?；⑺剪刀；⑻離心管；⑼移液管(5、2、1mL)；⑽洗耳球；⑾試管架；(12)膠頭滴管。【實驗器材】第9頁/共15頁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取7支潔凈烘干的15ml刻度試管按下表順序加入試劑，配成0-0.20μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)亞硝態(tài)氮溶液。搖勻后在25℃下保溫30min，然后在540nm下比色測定。以亞硝態(tài)氮濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），吸光值為縱坐標(biāo)（r）建立回歸方程?！緦嶒灢襟E】第10頁/共15頁管號1234567試劑取量mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液00.10.20.40.60.81.0蒸餾水1.00.90.80.60.40.201%磺胺22222220.2%萘基乙烯胺2222222每管亞硝態(tài)氮濃度μg/mL00.020.040.080.120.160.20第11頁/共15頁酶的提取稱取0.5-1g鮮樣（誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組分別進(jìn)行），剪碎置冰箱冰凍30min，取出置研缽中，冰浴研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移入離心管中，洗研缽2-3次，將液體轉(zhuǎn)入離心管中，共用提取液6mL，4℃8000rpm離心15min，上清液即為粗酶提取液。酶反應(yīng)取4個10mL離心管，按照下表所列進(jìn)行操作，混勻，25℃保溫30min。終止反應(yīng)和比色測定

30min后立即加入lmL磺胺溶液終止酶反應(yīng)，再加lmL萘基乙烯胺溶液，顯色30min后于4000rpm離心5min，取上清液在540nm下比色測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出反應(yīng)液中亞硝態(tài)氮濃度（μg/mL）。

反應(yīng)底物

酶反應(yīng)管

粗酶液/mL

0.1mol/LKNO3磷酸緩沖液/mL

NADH溶液/mL

0.1mol/L

pH7.5磷酸緩沖液/mL

非誘導(dǎo)－對照

1.0

1.6

0

0.2

非誘導(dǎo)－實驗

1.0

1.6

0.2

0

誘導(dǎo)－對照

1.0

1.6

0

0.2

誘導(dǎo)－實驗

1.0

1.6

0.2

0

第12頁/共15頁【結(jié)果計算】

樣品中酶活性（μg·g-1·h-1）=X——反應(yīng)液酶催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮濃度（μg/mL）；V1——提取酶時加入的提取緩沖液體積（mL）；V2——酶反應(yīng)時加入的粗酶液體積（mL）；V3——與磺胺等發(fā)生顏色反應(yīng)的總體積（mL）；W——樣品質(zhì)量（g）；

t——反應(yīng)時間（h）。X*

V3

/V2*V1W*t第13頁/共15頁【注意事項】

硝酸還原酶容易失活，離