肺結(jié)核的新診斷技術(shù)

肺結(jié)核的新診斷技術(shù)第1頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四NTP中現(xiàn)行實(shí)驗(yàn)室技術(shù)涂片：萋尼染色顯微鏡檢培養(yǎng)：固體培養(yǎng)基：簡單法、離心法藥敏：固體培養(yǎng)基：絕對濃度法、比例法菌種鑒定：鑒別培養(yǎng)基＋生化試驗(yàn)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)不能適應(yīng)不斷深入的結(jié)核病防治工作的需要第2頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)室新診斷技術(shù)總覽細(xì)菌學(xué)檢測方法發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED）液體培養(yǎng)分子生物學(xué)檢測方法GenexpertHAINGenechip免疫學(xué)檢測方法ELISOPT&TSPOT和Quantiferon血清學(xué)診斷方法第3頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四熒光比色(MIGIT)(MBBactAlert)RutheniumcomplexCO2pH液體培養(yǎng)第4頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四BACTECTB460原理：標(biāo)本經(jīng)前處理接種至含有14C-棕櫚酸的12B培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)。分枝桿菌分解14C-棕櫚酸，產(chǎn)生14CO2，BACTECTB460儀自動檢測，14CO2含量，并換算成生長指數(shù)（GI）。優(yōu)點(diǎn)：快速：將分離培養(yǎng)的陽性檢出時(shí)間由常規(guī)培養(yǎng)所需的2-8周縮短至3-14天，將藥敏試驗(yàn)的報(bào)告時(shí)間由常規(guī)方法的4周縮短至1周。操作簡便、靈敏度高，可進(jìn)一步做藥敏試驗(yàn)、菌種初步鑒定。缺點(diǎn)：放射性同位素污染。儀器與試劑價(jià)格昂貴。未實(shí)現(xiàn)全自動化污染率高第5頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四原理：是BACTECTB460的換代產(chǎn)品。標(biāo)本經(jīng)前處理后接種到系統(tǒng)配套的液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中包被有對氧濃度敏感的熒光物質(zhì)，當(dāng)細(xì)菌生長代謝消耗培養(yǎng)基中的氧時(shí)，氧濃度降低，熒光被激發(fā)，系統(tǒng)可以連續(xù)檢測熒光水平，自動報(bào)告結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)：系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化，操作更簡便、自動化更強(qiáng)。解決了BACTECTB460的同位素污染問題。24小時(shí)連續(xù)檢測，有利于早期報(bào)告陽性結(jié)果。缺點(diǎn)：儀器與試劑價(jià)格更昂貴。未能解決高污染率的問題BACTECMGIT960

分枝桿菌生長指示管第6頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四液體培養(yǎng)1CrucianiM,etal.JCM2004;42:2321-23252

Meanof14studiesinMGIT960=10.7%(2.0-30.0)[]=acceptablerange培養(yǎng)方法敏感性(95%CI)結(jié)果報(bào)告周期污染(%)涂陽涂陰羅氏培養(yǎng)0.76(0.73-0.79)22.333.7[3–5]MGIT9600.88(0.84-0.91)11.716.513.8-16.6210.7(2.0-30.0)[5–10]MGIT+羅氏0.92(0.87-0.95)第7頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四MGIT7mlMGIT7mlMGIT7mlMGIT7mlMGIT7mlMGIT7mlMGIT7ml+SMGIT7ml+IMGIT7ml+RMGIT7ml+EGCSIRE0,8mlBACTECMGITSIRE補(bǔ)充劑每種藥物0,1ml轉(zhuǎn)移0,5ml

陽性MGIT培養(yǎng)物0,1ml

陽性MGIT培養(yǎng)物9,9ml

蒸餾水轉(zhuǎn)移

0,5ml插入BACTECMGIT960BACTECMGIT960TB–藥敏試驗(yàn)S.I.R.E.第8頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四LED顯微鏡發(fā)光二級管(LED)技術(shù)提供價(jià)廉、穩(wěn)定的光源壽命150,000h反復(fù)開關(guān)不影響壽命不釋放有毒氣體不需要暗室操作人員工作負(fù)荷減輕第9頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四第10頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四快速藥敏-商業(yè)化線性探針檢測（LPAs）

GenoType?MTBDRplus,HAIN檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群以及利福平、異煙肼耐藥相關(guān)的突變檢測XDR的試劑盒也已經(jīng)發(fā)布INNO-LipaRifTB檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群以及于利福平耐藥相關(guān)的突變大多數(shù)利福平耐藥的菌株同時(shí)也耐異煙肼WHO鼓勵(lì)使用的工具可使用涂陽痰標(biāo)本和培養(yǎng)物進(jìn)行操作快速、簡便易用，僅需基本PCR技術(shù)然而，價(jià)格比較昂貴，且不能檢測造成耐藥突變的熱點(diǎn)區(qū)域外的突變11第11頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四MTBDRplus操作流程DNA提取用NALC/NaOH處理痰標(biāo)本2)PCR擴(kuò)增3)

雜交擴(kuò)增產(chǎn)物和固化在膜上的特異性探針雜交4)

結(jié)果判讀第12頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四rpoB

野生型探針:WT1-WT8rpoB

突變探針:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L→野生型缺失→野生型突變MTBDRplus

rpoB511513516518522526531533rpoBWT2rpoBWT4rpoBWT6rpoBWT8rpoBWT7rpoBMUT1(D516V)rpoBMUT3(S531L)rpoBMUT2A(H526Y)rpoBMUT2B(H526D)514515rpoBWT1rpoBWT3rpoBWT5509508505第13頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四katG

基因突變MTBDRplus

katG野生探針區(qū)域突變探針突變KatGWT315KatGMUT1S315T1KatGMUT2S315T2第14頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四MTBDRplus

inhA野生探針區(qū)域突變探針突變InhAWT1-15InhAMUT1C15T-16InhAMUT2A16GInhAWT2-8InhAMUT3AT8CInhAMUT3BT8AinhA

基因突變第15頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四MTBDRplus反應(yīng)條帶(示范)第16頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四南非的經(jīng)驗(yàn)：GenotypeMTBDRplusassay:直接從涂片陽性標(biāo)本中檢測rpob基因突變(耐利福平),katG基因(高濃度異煙肼耐藥),inhA基因(低濃度異煙肼耐藥)靈敏度、特異度，陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值耐利福平98.9,99.4,97.9,和99.7耐異煙肼94.2,99.7,99.1,和97.9耐MDR-TB98.8,100,100,和99.7BarnardM,etal.AmJRespirCritCareMed2008;177:787-92第17頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四結(jié)核耐藥檢測基因芯片激光共焦掃描儀軟件判讀結(jié)核耐藥檢測芯片獲北京市自主創(chuàng)新產(chǎn)品證書樣品制備儀雜交儀通

量：兩個(gè)一線抗結(jié)核藥速

度：

6小時(shí)（比傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)法快50-100倍）靈敏度：103CFU/反應(yīng)特異性：對照設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)；自動判讀基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測分離株或者痰樣本中結(jié)核桿菌多藥耐藥（利福平、異煙肼）。InternationalJournalofTuberculosisandLungDisease,13:914-920,2009（IF=2.3）18獲國家醫(yī)療器械證書和歐盟CE認(rèn)證第18頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四XpertMTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌檢測利福平耐藥直接標(biāo)本檢測100分鐘可獲得結(jié)果第19頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四工作流程痰簡單，僅需1個(gè)步驟的準(zhǔn)備工作獲得結(jié)果的時(shí)間<90min工作量:>16樣本/天/模塊不需要生物安全規(guī)綜合控制性能對MTB特異敏感性與培養(yǎng)相似通過rpoB基因檢測利福平耐藥產(chǎn)品和系統(tǒng)設(shè)計(jì)GeneXpert系統(tǒng)的檢測模塊測試模塊的擴(kuò)大和交換對非分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室人員僅需要最多1天的培訓(xùn)GeneXpert樣本準(zhǔn)備、擴(kuò)增、檢測自動化MTB/利福平耐藥性檢測痰標(biāo)本可以直接放入模塊中，而無需與任何試劑進(jìn)行混合處理第20頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四報(bào)告結(jié)果時(shí)間:1h45minGeneXpertDNA分子與PCR試劑混合樣本自動過濾和清洗超聲裂解捕獲的生物體，釋放DNA半嵌套實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增

&檢測集成反應(yīng)管456濃縮細(xì)菌去除抑制劑12標(biāo)本液化和作用15分鐘后轉(zhuǎn)移2ml3結(jié)束手工工作7結(jié)果可打印XpertMTB/RIF第21頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四單中心評估研究（初步結(jié)果）不同研究設(shè)計(jì)和研究人群，肺結(jié)核和肺外結(jié)核標(biāo)本檢測結(jié)核匯總的未經(jīng)校正的敏感性

92%匯總的未經(jīng)校正的特異性

98%檢測利福平耐藥匯總的未經(jīng)校正的敏感性

98%匯總的未經(jīng)校正的特異性

99%第22頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四操作方面廢棄物管理–如痰標(biāo)本容器儲存和供應(yīng)–反應(yīng)盒龐大,2-28°C,有效期12個(gè)月電力供應(yīng)–UPS(400VA)或電池組培訓(xùn)–需求不高(使用計(jì)算機(jī)、預(yù)防污染)生物安全–與涂片鏡檢相同每年校正–模塊更換安全–防盜(計(jì)算機(jī))第23頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四世界衛(wèi)生組織快速開展XpertMTB/RIF診斷試驗(yàn)技術(shù)和實(shí)施方面的考慮2011年3月第24頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四WHO對XpertMTB/RIF的建議摘要：高度推薦用于懷疑MDR-TB以及合并HIV感染的結(jié)核病病人的初診診斷對于MDR－TB、HIV不嚴(yán)重的地區(qū)，可以在涂片之后考慮使用XpertMTB/RIF，特別是用于診斷涂陰病人（取決于費(fèi)用）肺外標(biāo)本的有關(guān)證據(jù)尚有限增加檢測次數(shù)可能增加敏感性，但需考慮費(fèi)用增加適用于兒童不能替代傳統(tǒng)涂片、培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)第25頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四步驟

1:特異抗原激發(fā)淋巴細(xì)胞IFN-

釋放陰性對照ESAT-6或CFP-10孵育孵育顯影步驟

2:用ELISA檢測

IFN-

YYYYYYYYYYYY洗滌YYYYYY

洗滌YYYQuantiFERONTBGold?實(shí)驗(yàn)第26頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四T-SPOTTB(ELISPOT)技術(shù)

單核細(xì)胞分離TB抗原刺激，IFN-

釋放一抗捕獲IFN-

與標(biāo)記的二抗結(jié)合

酶作用標(biāo)記物－顯色每一斑點(diǎn)代表釋放IFN-的一個(gè)細(xì)胞YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYIFN-抗原第27頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四小結(jié)用途操作生物安全要求費(fèi)用液體培養(yǎng)更敏感、快速的培養(yǎng)＋＋＋＋＋＋＋＋LPA/基因芯片快速診斷M/XDR＋＋＋＋＋＋＋LED涂陽病人發(fā)現(xiàn)＋＋＋＋Xpert快速診斷＋＋＋＋＋NTP中如何應(yīng)用－給誰用？哪里做？怎么用？第28頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議液體培養(yǎng)用于:

結(jié)核病可疑癥狀者檢查,可以作為結(jié)核?。退帲┑脑\斷依據(jù)和結(jié)核病患者治療效果判斷,液體培養(yǎng)可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng)推薦理由:液體培養(yǎng)在已經(jīng)在我國注冊；國內(nèi)外研究顯示其敏感性和TAT優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)；數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性,符合成本效果；推薦使用層級:

區(qū)縣、地市和省級（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)）第29頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議GenXpert即將可以用于:

結(jié)核病可疑癥狀者檢查,可以作為結(jié)核病的輔助診斷方法和結(jié)核病患者治療效果判斷,它有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的培養(yǎng)和利福平的藥敏試驗(yàn)（可疑耐藥結(jié)核病患者）推薦理由:即將在我國獲得注冊證書；國內(nèi)外研究顯示其敏感性和特異性，陽性結(jié)果報(bào)告時(shí)間優(yōu)于傳統(tǒng)方法；WHO在全球推薦數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性,符合成本效果；可能使用層級:

區(qū)縣（？）、地市和省級（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)）第30頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議LPA可以用于:

可疑耐藥結(jié)核病患者查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)推薦理由:在我國獲得注冊證書；國內(nèi)外研究顯示其敏感性和特異性（TAT)較好；WHO在全球推薦數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性,符合成本效果；可能使用層級:

地市和省級（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)）第31頁，共35頁，2023年，2月20日，星期四國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議基因芯片可以用于:

可