經(jīng)典液相色譜法平面色譜分析

經(jīng)典液相色譜法平面色譜分析演示文稿目前一頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)（優(yōu)選）經(jīng)典液相色譜法平面色譜分析目前二頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)薄層色譜法：

將固定相均勻涂布在表面光滑的平板上，形成薄層而進(jìn)行色譜分離和分析的方法。按分離原理又可分為：吸附薄層色譜法分配薄層色譜法分子排阻色譜法目前三頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)紙色譜法：將固定相放在紙上，以紙做載體進(jìn)行點(diǎn)樣、展開、定性、和定量的液-液分配色譜法。

20世紀(jì)40年代產(chǎn)生應(yīng)用于生化醫(yī)藥學(xué)方面的微量分析。

20世紀(jì)60年代后，應(yīng)用減少。目前四頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)薄層電泳法帶電荷的被分離物在紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠及聚丙稀酰胺凝膠等惰性介質(zhì)上，向與其相反的電極方向，以不同的速度遷移而實(shí)現(xiàn)分離。目前五頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)薄層色譜法的特點(diǎn)：分離能力強(qiáng)，斑點(diǎn)集中。靈敏度高，幾微克，甚至幾十納克的物質(zhì)也能檢出。展開時(shí)間短，一般只需十至幾十分鐘。一次可以同時(shí)展開多個(gè)試樣目前六頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)

試樣預(yù)處理簡(jiǎn)單，對(duì)被分離物質(zhì)性質(zhì)沒有限制。點(diǎn)樣量較大，可點(diǎn)成點(diǎn)或條狀。所用儀器簡(jiǎn)單，操作方便。目前七頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)定性參數(shù)

比移值18.4.2平面色譜法參數(shù)目前八頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)目前九頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)

相對(duì)比移值Rr

討論可消除系統(tǒng)誤差，提高重現(xiàn)性和可靠性；

相對(duì)比移值范圍可以大于或小于1。目前十頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)相平衡參數(shù)

推導(dǎo)比移值與分配系數(shù)的關(guān)系已知色譜過程方程：目前十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)（等距展開）目前十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)K趨近0，Rf

趨近1，組分不被固定相保留。

K趨近∞，Rf趨近0，組分停留在原點(diǎn)，完全被固定相保留。目前十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)討論

Rf與K有關(guān)，即與組分性質(zhì)（溶解度）以及薄層板和展開劑的性質(zhì)有關(guān)。色譜條件一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，是薄層色譜基本定性參數(shù)，說明組分的色譜保留行為。目前十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)分離參數(shù)分離度目前十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)分離數(shù)

SN越大，說明板的容量越大。目前十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)18.5薄層色譜法主要類型吸附薄層色譜法分配薄層色譜法分子排阻色譜法正相色譜法反相色譜法目前十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)18.5.1吸附薄層色譜的吸附劑和展開劑吸附劑最常用的是硅膠、氧化鋁、聚酰胺、纖維素、葡聚糖、磷酸鈣、磷酸鎂、硅酸鈣鎂等。

硅膠：SiO2·H2O

結(jié)構(gòu)：內(nèi)部——硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)→多孔結(jié)構(gòu)表面——有硅醇基→吸附活性中心→氫鍵作用目前十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)

表：硅膠的活度與含水量硅膠含水量％活性級(jí)別氧化鋁含水量％0Ⅰ05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ15目前十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)適用范圍：硅膠表面的pH約為5，適合分析酸性或中性物質(zhì)。硅膠的類型：硅膠H：不含黏合劑，鋪成硬板需另加粘合劑。硅膠G：是硅膠和鍛石膏混合而成。目前二十頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)

硅膠GF254：含鍛石膏和無機(jī)熒光劑，即錳激活的硅酸鋅(Zn2SiO4:Mn),在254nm紫外光下呈強(qiáng)烈黃綠色熒光背景。購(gòu)買時(shí)注意：規(guī)格（主要是種類、活度級(jí)別和粒度）

常規(guī)：10～40μm

高效：5μm或10μm目前二十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)氧化鋁堿性氧化鋁、中性氧化鋁、酸性氧化鋁使用時(shí)可不加黏合劑，也可加煅石膏或CMC等黏合劑；通常使用活性級(jí)別Ⅱ～Ⅲ級(jí)。目前二十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)展開劑常見溶劑的極性由強(qiáng)到弱的順序：

水>酸>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮>乙酸乙酯>乙醚>氯仿>二氯甲烷>甲苯>苯>三氯乙烷>四氯化碳>環(huán)己烷>石油醚目前二十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)如何選擇吸附劑和展開劑？用“競(jìng)爭(zhēng)吸附”解釋目前二十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)

被分離物質(zhì)的極性

吸附劑的活度展開劑極性大小大小大小防止吸附太牢，Rf太小防止Rf太大目前二十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)

開展實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以選用單一溶劑展開，再根據(jù)Rf的大小，進(jìn)一步調(diào)整展開劑的種類或選用二元、三元展開劑。分離酸性物質(zhì)，可在展開劑中加入少量酸性溶劑，如甲酸、乙酸等分離堿性物質(zhì)，可在展開劑中加入少量堿性溶劑，如氨水、乙二胺等。目前二十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)

例如：用氯仿展開時(shí)，如果Rf值太小，則可加入極性___的展開劑，如_____。如果Rf值太大，可加入極性____的展開劑，如_______________。環(huán)己烷、石油醚小乙醇大目前二十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)18.5.2薄層色譜操作方法

可分制板、點(diǎn)樣、展開和顯色四個(gè)步驟。薄層板的制備軟板的制備硬板的制備硬板加了粘合劑，常用的粘合劑有羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)和鍛石膏(CaSO4·1/2H2O)兩種。目前二十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)硅膠-CMC板制備取羧甲基纖維素鈉5~7g,加1000ml水，加熱使溶解，放置澄清，取上清液100ml,分次加入硅膠約33g,調(diào)成糊狀。去除氣泡后，將糊狀的吸附劑倒在清潔的玻璃板上，使均勻涂布于整塊玻璃板上，平放自然晾干，105℃活化1h，置干燥器中保存?zhèn)溆?。目前二十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)點(diǎn)樣

a.樣品溶液的制備一般選用易揮發(fā)，與展開劑極性相似的有機(jī)溶劑，如甲醇、丙酮、乙醇等。配制樣品液濃度為0.01%~0.1%。目的：使點(diǎn)樣后溶劑能迅速揮發(fā)，減少色斑的擴(kuò)散。目前三十頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)b.點(diǎn)樣量和點(diǎn)樣工具點(diǎn)樣毛細(xì)管，微量注射器點(diǎn)樣量一般以幾微升為宜，毛細(xì)管大約1cm左右。點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑以2~4mm為宜。

目前三十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)c.點(diǎn)樣方法吸取一定量的樣液，輕輕接觸于薄層的點(diǎn)樣線上，點(diǎn)樣線一般距薄層底邊1.5~2cm，點(diǎn)間距約0.8~1.5cm(新藥典規(guī)定為1.5~2.0cm)。點(diǎn)樣后形成的原點(diǎn)面積越小越好，一般原點(diǎn)直徑不超過2~4mm為宜。目前三十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)

展開和展開劑的流速展開先預(yù)飽和。展開前，將薄層板置于盛有展開劑的色譜缸內(nèi)飽和15～30min,此時(shí)薄板不與展開劑直接接觸，當(dāng)色譜缸內(nèi)展開劑蒸汽、薄層與缸內(nèi)大氣達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，即飽和時(shí)，再將薄層板浸入展開劑中，稱預(yù)飽和。目前三十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)邊緣效應(yīng)：指點(diǎn)在薄層板上的同一物質(zhì)，薄板邊緣的Rf值高于中部的Rf值的現(xiàn)象。目前三十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)目前三十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)展開劑的流速Uf目前三十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)目前三十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)

實(shí)際情況比上面分析的要復(fù)雜的多?？傊?，薄層色譜過程中展開劑的流速是空間、時(shí)間的復(fù)雜函數(shù)。目前三十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)顯色顯色方法：

a.在日光下觀察，劃出有色物質(zhì)的斑點(diǎn)位置。

b.在紫外燈下觀察有無暗斑或熒光斑點(diǎn)，并記錄顏色、位置、強(qiáng)弱。能發(fā)熒光的物質(zhì)或少數(shù)有紫外吸收的物質(zhì)可用此法檢出。目前三十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)c.熒光薄層板檢測(cè)。

d.顯色劑顯色。適用于無色，又無紫外吸收的物質(zhì)。薄層色譜常用的通用型顯色劑有碘、硫酸溶液、熒光黃溶液等。目前四十頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)18.5.3定性和定量分析定性分析依據(jù)：Rf值。用已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作對(duì)照，在多種展開系統(tǒng)中比較Rf值的大小?；蚺c其它分析方法聯(lián)用。目前四十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)定量分析

洗脫法用溶劑將斑點(diǎn)中的組分洗脫下來，再用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行定量測(cè)定。

斑點(diǎn)需預(yù)先定位。目前四十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)直接定量法：

目視比較法：

將一系列已知濃度的對(duì)照品與試樣溶液點(diǎn)在同一薄層板上，展開并顯色后，…

目前四十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)薄層掃描法：用一定波長(zhǎng)、一定強(qiáng)度的光束照射薄層上的斑點(diǎn)，用儀器測(cè)量照射前后光束強(qiáng)度的變化，從而求得物質(zhì)含量的方法。精密度為±5%。雙波長(zhǎng)型薄層掃描儀測(cè)定方法：透射法和反射法。掃描方法：線形掃描和曲折形掃描目前四十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)λ1λ2CHLPPMPM雙波長(zhǎng)薄層掃描光學(xué)線路示意圖目前四十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)18.5.4高效薄層色譜法(highperformancethinlayerchromatography；HPTLC)

高效薄層色譜的分離效率比經(jīng)典薄層色譜提高三倍，每分鐘可分離5個(gè)以上組分，最多可分離40種組分。檢出靈敏度提高，分析時(shí)間縮短。高效薄層色譜法與經(jīng)典薄層色譜法在吸附劑粒度等方面不同。目前四十六頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)

表：TLC與HPTLC的比較參數(shù)TLCHPTLC板尺寸(cm)20×2010×10顆粒直徑(μm)10~405,10顆粒分布寬窄點(diǎn)樣量(μl)1~50.1~0.2有效塔板數(shù)>600>5000展開距離(cm)10~153~6展開時(shí)間(min)30~2003~20最小檢測(cè)量：吸收(ng)1~50.1~0.5

熒光(pg)50~1005~10目前四十七頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)18.6紙色譜法目前四十八頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)18.6.1紙色譜法的分離原理

～是以紙為載體的色譜法，分離原理屬于分配色譜的范疇。

固定相：紙纖維上吸附的水分。(或甲酰胺、緩沖液等濾紙可以吸留的物質(zhì)。)

流動(dòng)相：不與水相混溶的有機(jī)溶劑?；蚩膳c水混溶的溶劑。paperchromatography目前四十九頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)分離原理：紙色譜法可以看成是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間連續(xù)萃取的過程。依據(jù)溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離的目的。常用比移值Rf來表示各組分在色譜中的位置。目前五十頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)Rf值與化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系

化合物的極性應(yīng)根據(jù)整個(gè)分子及組成分子的各個(gè)基團(tuán)來考慮。目前五十一頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)CHOHCOHHOCHHCOHHCOHCH2OHCHO

HOCHHOCHHCOHHCOHCH3CHO

CH2

HCOHHCOHHCOHCH3葡萄糖鼠李糖洋地黃毒糖目前五十二頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)

表：三種六碳糖的Rf值糖溶劑系統(tǒng)123葡萄糖0.030.170.10鼠李糖0.270.420.44洋地黃毒糖0.580.660.88溶劑系統(tǒng)1.正丁醇－水2.正丁醇－乙酸－水（4：1：5）3.乙酸乙酯－吡啶－水（25：10：35）目前五十三頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)18.6.2紙色譜法的實(shí)驗(yàn)條件色譜紙的選擇a.要求濾紙質(zhì)地均勻，應(yīng)有一定的機(jī)械強(qiáng)度。b.紙纖維的松緊適宜。c.紙質(zhì)應(yīng)純，雜質(zhì)量要小，無明顯的熒光斑點(diǎn)。薄紙定性，厚紙制備或定量。

Rf值相差小慢速濾紙大快速濾紙目前五十四頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)固定相：紙纖維吸附的水濾紙纖維有較強(qiáng)的吸濕性，通常含20%~25%的水。其中有6%~7%的水是以氫鍵締合的形式與纖維素上的羥基結(jié)合在一起。一般條件下較難脫去。所以為固定相。紙纖維是一個(gè)惰性載體。

目前五十五頁\總數(shù)六十一頁\編于十三點(diǎn)

在分離一些極性較小的物質(zhì)，為了增加其在固定相中的溶解度，常用甲酰胺或二甲基甲酰胺、丙二醇等作為固定相。分離酸、堿性物質(zhì)，常將紙條浸過緩沖溶液。目前五十六頁\總數(shù)