大鼠脊髓損傷BBB評(píng)分中文版

Westernblot試驗(yàn)操作步驟一、 蛋白樣品制備1用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下（不要將培養(yǎng)基倒掉），用吸管將其吸至離心管中2用4°C預(yù)冷的PBS1ml沖洗培養(yǎng)瓶2次收集入上述離心管中3lOOOrpm，離心10min4倒掉上清，沉淀用lmlPBS重懸，轉(zhuǎn)入EP管中，再加lmlPBS沖洗離心管壁上殘留的細(xì)胞轉(zhuǎn)入EP管中5 4°C,4000rpm,離心5min6倒掉上清液（用搶把殘余上清吸干凈）7配制裂解液，計(jì)算所需用量，每個(gè)EP管中加入lOOul裂解液（10mg組織/lOOul）若有4管（4組），配制400ul裂解液：PMSF儲(chǔ)備液濃度lOOmM,用RIPA稀釋至lMm.【單去污劑裂解液（PMSF）：lmol/LTris?HCl（pH8.O）2.5ml;NaCl0.438gTritonX-1000.5ml;蒸餾水至50ml;混勻后4°C保存】4°C裂解30-45min,每5min振蕩一次4C14000g離心5min,取上清（移入1.5ml的EP管中）。10蛋白定量（常用BCA法，參見(jiàn)蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明）每管蛋白一致，分裝約2Oul/管左右（加入5xbuffer并用RIPA稀釋成lx）11將蛋白樣1OOC，變性5min,-8O°C（or-2OC）保存。二、 SDS的配制：1試劑及配制：（1） 3O%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g,N,N-亞甲基雙丙烯酰胺lg,去離子水至lOOml,過(guò)濾，避光，4°C貯存。（2） 1.5mmol/LTris溶液（PH8.8）：稱取18.15gTris堿（分析純）加適量的超純水溶解，用濃鹽酸（分析純）調(diào)pH值至8.8,加超純水定容至1OOml,室溫儲(chǔ)存。（3） l.Ommol/LTris溶液（pH6.8，:稱取12.1gTris堿（分析純）加適量的超純水溶解，用濃鹽酸（分析純）調(diào)pH值至6.8,加超純水定容至1OOml,室溫儲(chǔ)存。（4） 1O%SDS：lgSDS加入lOml去離子水，室溫貯存。（5） 1O%過(guò)硫酸銨溶液：O.lg過(guò)硫酸銨加入lml水，4°C保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。（6） TEMED（可購(gòu)買成品）（7） 5X電泳緩沖液（Tankbuffer）：稱取15.14gTris堿（分析純）,72.1g甘氨酸（分析純）,5gSDS（分析純），加適量的超純水溶解，pH值應(yīng)該在8.3左右，加超純水定容1000ml，室溫儲(chǔ)存。（8） 分離膠、濃縮膠液配方：（兩個(gè)用小燒杯，用完立即刷）總體積5ml2ml5ml濃度12%分離膠5%濃縮膠10%分離膠水(ml)1.61.41.930%丙烯酰胺（ml）2.00.331.71.5mmol/LTris溶液(pH8.8)(ml)1.3——1.31.0mmol/LTris溶液(pH6.8)(ml)—0.25—10%SDS(ml)(透明)0.050.020.0510%過(guò)硫酸銨溶液（ml）0.050.020.05TEMED（ml）（鋪膠前加）0.0020.0020.0022.制膠程序：（小分子量）（1） 裝板（小玻璃朝外）（2） 配制分離膠，加TEMED后，充分混勻，立即注入玻璃板間隙，從一邊開(kāi)始，并為濃縮膠留足夠空間（梳齒長(zhǎng)約1cm）。立即覆蓋蒸餾水至頂部，天冷可放入烤箱15-20分鐘,待分離膠聚合后，用濾紙吸去上面的水層，再灌入濃縮膠（配方見(jiàn)上表），插入樣品梳,避免氣泡出現(xiàn)。（3） 待聚合后（約20分鐘），拔出樣品梳，將電極緩沖液注滿電泳槽的前后槽，在加樣孔中加入10-20ul樣品（蛋白量20ug左右）。左側(cè)第一孔加maker，樣品不夠可用laodingbuffer。電泳：接通電源，濃縮膠80伏約半小時(shí)，此后分離膠120/160伏繼續(xù)1小時(shí)左右。三、轉(zhuǎn)膜：1、轉(zhuǎn)移緩沖液的配制：（先用先配）試劑用量甘氨酸14.413gTris堿3.0285g無(wú)水甲醇40-200ml（蛋白量150以上加40）水至10002、轉(zhuǎn)膜程序：（1） 剪4張濾紙，和一張PVDF膜，大小與凝膠相同（濾紙要比膠小，膜稍大以防轉(zhuǎn)膜時(shí)發(fā)生短路）。在膜的一角做一記號(hào)（或剪角）。（2） 將剪好的膜依次序浸入100%甲醇（10秒）一去離子水（5min）f轉(zhuǎn)移緩沖液（大于10min）。（3）濾紙和海綿（纖維）墊浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中（大于10min）（4） 剝膠，并將凝膠裁成合適大小，切角以做記號(hào)。（5）安裝轉(zhuǎn)膜裝置：從正極（紅色）一負(fù)極（黑色）依次為：白色邊盒一多孔墊片一（1~2張）濾紙一PVDF膜一凝膠一（1?2張）濾紙一多孔墊片一黑色邊盒?？凵系蹩酆蟛暹M(jìn)轉(zhuǎn)膜槽中。轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)加冰盒，防止電泳時(shí)過(guò)熱。（6） 接通電源：恒流電轉(zhuǎn)移兩個(gè)小時(shí)，電流一般是100mA（視蛋白大小而定）。（7） 電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，將膜取出。四、封閉及免疫反應(yīng)（一）試劑的配制：1.5xTBS：（PH7.5）用時(shí)稀釋5倍試劑1000ml用量Tris-base6.05gNaCl43.83g去離子水至1000ml1xTBST：1xTBS+0.05%Tween-20試劑1000ml用量Tween-200.5ml1xTBS1000mlBlockingbuffer：1xTBST+5%DryMilk試劑100ml用量DryMilk5g1xTBST100ml（二）、免疫反應(yīng)程序：取膜（平頭鑷子，玻璃平皿），放入10mlBlockingbuffer（封閉緩沖液），室溫輕搖2h,或4°C過(guò)夜。一抗孵育，用TBST配制，1:1000（比例須看說(shuō)明書，裝入塑封袋中趕凈氣泡后用封口機(jī)封口），室溫?fù)u床上孵育1h后4°C過(guò)夜。用TBST室溫洗膜10minX3次二抗孵育。用Tbst稀釋，1:2000（比例須看說(shuō)明書，方法同上），室溫輕搖45min-2h。用TBST洗膜10minX3次。五、顯影：1試劑（1） 超敏發(fā)光液（ECL）（A、B液等比混合）（2） 顯影液：顯影粉（按說(shuō)明書配制）（3） 定影液：定影粉（按說(shuō)明書配制）2顯影程序（1） 發(fā)光液工作液的配制：等體積混合適量A液（200ul）和B液（200ul）,視膜大小而定，直接在保鮮膜上混合。（2） 顯色反應(yīng)：將膜取出，用吸水紙略吸去過(guò)多的液體（切勿接觸膜的蛋白面），然后置于保鮮膜上，浸入并與發(fā)光液均勻充分地接觸。（3） 壓片檢測(cè)：將膜固定于暗盒內(nèi)（蛋白面朝膠片）。暗盒內(nèi)放入膠片，壓片曝光。（壓片時(shí)間要摸索，15s-過(guò)夜）（4） 顯影：膠片放入顯影液，觀察顯影情況。（時(shí)間視顯影情況而定）（5） 定影：膠片放入定影液，2-10min。流水沖洗，干燥保存六、ECL膜再生1試劑膜再生液：（500ml）SDS：10g；Tris：3.62g （Tris堿）；H2O：400ml調(diào)PH值6.7；定容至500ml；加250卩甲-巰基乙醇。2膜再生程序：（1） TBST洗膜10minX3次（2） 用時(shí)將膜浸在膜再生液中，60°C水浴30min（搖床）（3） TBST洗膜10minX3次（4） 封閉液封閉BBB法脊髓損傷的行為學(xué)評(píng)分評(píng)估大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。將動(dòng)物放置于平臺(tái)上,觀察記錄其后肢的行走及肢體活動(dòng)。評(píng)分分三部分第一部分為0—7分，評(píng)判動(dòng)物后肢各關(guān)節(jié)活動(dòng)第二部分為8一13分，評(píng)判后肢的步態(tài)及協(xié)調(diào)功能第三部分為14一21分，評(píng)判運(yùn)動(dòng)中爪的精細(xì)動(dòng)作，三項(xiàng)滿分為21分.定義：將動(dòng)物放入一開(kāi)口盆中，輕敲盆壁，使其爬行，觀察動(dòng)物的臀、膝、踝關(guān)節(jié)行走、軀干運(yùn)動(dòng)及其協(xié)調(diào)情況。0無(wú)可觀察到的后肢運(yùn)動(dòng)1或2個(gè)后肢關(guān)節(jié)輕度活動(dòng)，一般為髖關(guān)節(jié)/膝關(guān)節(jié)。1個(gè)后肢關(guān)節(jié)大幅運(yùn)動(dòng)和另一關(guān)節(jié)輕度活動(dòng)2個(gè)后肢關(guān)節(jié)大幅運(yùn)動(dòng)所有3個(gè)后肢關(guān)節(jié)輕度活動(dòng)2個(gè)后肢關(guān)節(jié)輕度運(yùn)動(dòng)和第3個(gè)關(guān)節(jié)大幅運(yùn)動(dòng)2個(gè)后肢關(guān)節(jié)大幅運(yùn)動(dòng)，第3個(gè)關(guān)節(jié)輕度活動(dòng)所有3個(gè)后肢關(guān)節(jié)大幅運(yùn)動(dòng)不負(fù)重?cái)[動(dòng)，或足底著地，但不負(fù)重僅站立的時(shí)候足底負(fù)重或偶爾/頻繁/持續(xù)以足背負(fù)重步行，無(wú)足底負(fù)重步行

偶見(jiàn)負(fù)重步行，但前、后肢不協(xié)調(diào)由頻繁到持續(xù)負(fù)重步行，但無(wú)前、后肢協(xié)調(diào)由頻繁到持續(xù)負(fù)重步行，偶見(jiàn)前、后肢協(xié)調(diào)由頻繁到持續(xù)負(fù)重步行，頻繁前、后肢協(xié)調(diào)101112131415161718192021持續(xù)協(xié)調(diào)足底步行，優(yōu)勢(shì)爪在剛觸地和抬起時(shí)旋轉(zhuǎn)頻