血清γ球蛋白的分離、純化與鑒定

一、目的和要求學(xué)習(xí)鹽析法分離血清蛋白的原理和技術(shù)掌握凝膠過濾層析法脫鹽的基本操作技術(shù)掌握用醋酸纖維膜電泳法分離血清蛋白的原理及方法目前一頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)二、原理（一）鹽析1.概念和原理鹽析是指溶液中加入無機(jī)鹽類而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過程。

蛋白質(zhì)在純水中溶解度較低，若稍加一些無機(jī)鹽則溶解度增加，這種現(xiàn)象稱為“鹽溶”(saltin)。而當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加到某一濃度時(shí)，蛋白質(zhì)又變得不溶而自動(dòng)析出，這種現(xiàn)象稱為“鹽析”(saltout)。

目前二頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)“鹽析”破壞了蛋白質(zhì)作為親水膠體的兩個(gè)穩(wěn)定因素但當(dāng)鹽濃度增加到一定濃度時(shí)，一方面大量的水同鹽分子結(jié)合，使得蛋白質(zhì)沒有足夠的水維持溶解狀態(tài)，破壞了維持蛋白質(zhì)親水膠的水化膜另一方面加入的鹽離子中和了蛋白質(zhì)分子相互排斥的電荷相互聚集沉淀出來表面電荷水化膜目前三頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)2.常用中性鹽：鹽析可用硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽，其中運(yùn)用最廣的是硫酸銨。硫酸銨的優(yōu)點(diǎn)

1.在水中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，2.溶解度大，3.溶解度的溫度系數(shù)變化較小，4.硫酸銨價(jià)廉易得，分離效果好，5.性質(zhì)溫和，高濃度時(shí)也不會(huì)影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。目前四頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)3.鹽濃度計(jì)算各種蛋白質(zhì)“鹽析”出來所需的鹽濃度各異，所需的最小鹽量稱做鹽析濃度。A，GAG↓半飽和(NH4)2SO4飽和(NH4)2SO4A↓血清中清蛋白和球蛋白的分離按體積：

12（50%）；14（25%）目前五頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)(1)飽和硫酸銨溶液法

將飽和硫酸銨溶液的飽和度定為100%或1按體積：

12（50%）；14（25%）(2)固體硫酸銨法可采用直接加入固體硫酸銨的方法。硫酸銨飽和度的計(jì)算目前六頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)離心力(F)等于被離心的物體質(zhì)量與向心加速度的乘積向心加速度=4π2V2r（其中V為每秒的轉(zhuǎn)數(shù)，r為離心半徑，單位cm）F=m

4π2V2r相對(duì)向心加速度=4π2V2rg多少個(gè)g（二）離心(centrifugation)----分離1.離心力目前七頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)2.離心機(jī)分類根據(jù)離心機(jī)的轉(zhuǎn)數(shù)分類可以分為三類

①<5000rpm普通離心機(jī)②5,000-25,000rpm高速離心機(jī)③25,000-10,000rpm超速離心機(jī)因離心時(shí)與空氣摩擦產(chǎn)熱很多，所以高速離心機(jī)有制冷裝置超速離心機(jī)不但有制冷裝置，而且離心室密封真空目前八頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)3.離心機(jī)的使用0.1g50g2000rpmr=12cm配平在對(duì)稱位置重量一致Balancedloadingpatternsfora12-positoncentrifugerotor目前九頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)三、操作2ml血清+2mlPBS逐滴加入飽和(NH4)2SO42ml2→6ml33%棄上清，2mlPBS+1ml飽和(NH4)2SO4

1→3ml33%棄上清，1mlPBS+0.5ml飽和(NH4)2SO4

0.5→1.5ml33%棄上清，洗滌0.5mlPBS溶解↓搖勻

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混勻靜置30min，離心3000rpm10min↓

↓

混勻靜置30min，離心3000rpm10min↓

混勻靜置30min，離心3000rpm10min目前十頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)層析利用物質(zhì)在固定相（stationaryphase）與流動(dòng)相（mobilephase）之間不同的分配比例，達(dá)到分離待測(cè)物質(zhì)的技術(shù)。

(三)層析(chromatography)---純化凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）離子交換層析法（ionexchangechromatography）親和層析法（affinitychromatography）目前十一頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）目前十二頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)葡聚糖凝膠（Sephadex）目前十三頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)離子交換層析法（ionexchangechromatography）目前十四頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)親和層析法（affinitychromatography）目前十五頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)脫鹽常用透析法和凝膠過濾層析法前者的優(yōu)點(diǎn)是透析后樣品終體積較小，但所需時(shí)間較長(zhǎng)，且鹽不易除盡凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時(shí)間也明顯縮短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。本實(shí)驗(yàn)中樣品體積較小，凝膠過濾后樣品體積不會(huì)太增加，所以選用凝膠過濾法。目前十六頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)透析(dialysis)目前十七頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）目前十八頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)按流出的時(shí)間收集不同組分目前十九頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)結(jié)果12345678910proteinNH4+11121314151617181920proteinNH4+-

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±++

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目前二十頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)(四)電泳(electrophoresis)---鑒定帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳血清蛋白包括多種蛋白質(zhì)，它們的等電點(diǎn)大都在pH7.0以下，清蛋白的等電點(diǎn)為4.6，球蛋白為5-7在PH高于它們等電點(diǎn)的緩沖液均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)由于各種蛋白質(zhì)所帶電荷的數(shù)量和分子的大小有差別，在電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度也不同目前二十一頁\總數(shù)二十三頁\編于點(diǎn)血清中清蛋白電荷數(shù)量較多，分子量小，泳動(dòng)最快。γ球蛋白則相反，泳動(dòng)最慢，適當(dāng)?shù)臅r(shí)間電泳后，不同的蛋白泳動(dòng)到不同的位置。Albuminα1α2βγ+-血清樣品電泳法可以將