分子生物學4復習知識重點

分子生物學4復習知識重點1、生物大分子：是指生物體內(nèi)由分子量較低的基本結(jié)構(gòu)單位首尾相連形成的多聚化合物。包括核酸、蛋白質(zhì)和多糖。2、基因：DNA分子中含有特定遺傳信息的核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的功能單位；是合成有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA分子所必需的全部核酸序列。3、結(jié)構(gòu)基因：可被轉(zhuǎn)錄形成mRNA，并進而翻譯成多肽鏈，構(gòu)成各種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、催化各種生化反應(yīng)的酶和激素等。4、斷裂基因：編碼序列不連續(xù)的間斷基因，即編碼序列在DNA分子中是不連續(xù)的，被非編碼序列隔開，呈鑲嵌排列的斷裂形式。5、外顯子：斷裂基因中含有蛋白質(zhì)編碼信息的部分．每個外顯子均編碼一個完整蛋白質(zhì)的特定部分．6、內(nèi)含子：斷裂基因中外顯子的間插序列，可參與前體RNA的轉(zhuǎn)錄，但其轉(zhuǎn)錄的RNA序列于轉(zhuǎn)錄后的加工中被切除，不包括于成熟的RNA分子中．7、假基因：具有與功能基因相似的序列，但不能翻譯為功能蛋白質(zhì)的基因片段．分為重復的假基因和被加工過的假基因8、重疊基因：指兩個或以上的基因共有一段DNA序列9、移動基因：是基因組中可移動的一段ＤＮＡ序列，可將其本身從基因組內(nèi)的一個位置轉(zhuǎn)移至另一位置．10、基因突變：是指一個基因內(nèi)部可以遺傳的結(jié)構(gòu)改變，是基因分子內(nèi)部在某種條件作用下所發(fā)生的一個或幾個核苷酸的改變，導致結(jié)構(gòu)蛋白或酶的改變，從而影響有機體的大小、品質(zhì)、顏色、結(jié)構(gòu)和生長率等性狀的改變11、基因組：基因組就是一個物種中所有基因的整體組成，或者是一種生物所有染色體上的遺傳物質(zhì)．12、C值(Cvalue):通常是指一種生物單倍體基因組DNA的總量.13、單核苷酸多態(tài)性(SNP)：在基因組水平由單個核苷酸差異所引起的DNA序列多態(tài)性。14、C值悖理：生物的復雜性與基因組的大小并不完全成比例增加.15、基因載體：能將外源目的DNA導入受體細胞，并能自我復制和增殖的工具。其中為表達出蛋白質(zhì)設(shè)計的載體又稱表達載體。16、質(zhì)粒：是位于細胞質(zhì)中的一類獨立于染色體的可自主復制的遺傳成分，可賦予宿主細胞一定的生物性狀。17、插入失活效應(yīng)：因DNA片段的插入而導致編碼基因失活的現(xiàn)象18、黏粒：一類由人工構(gòu)建的含有λDNA的cos序列和質(zhì)粒復制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。19、酵母人工染色體(YAC)：酵母人工染色體是將酵母染色體復制與分離所需的序列與大片段目的DNA連接而構(gòu)成的，可克隆外源片段的長度可大于1Mb。YAC主要用于構(gòu)建大片段DNA，特別是用于構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫20、細菌人工染色體（BAC載體）：在大腸桿菌Ｆ因子的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。BAC能容納長達100～350kb的插入序列21、基因文庫：是來自某生物的不同DNA序列的總集，這些DNA序列都被克隆進了載體，以便于純化、貯存與分析。22基因組文庫：存在于轉(zhuǎn)化細菌內(nèi)，由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。 簡稱G-文庫。23、cDNA文庫：用細胞總mRNA 制備全套雙鏈cDNA后， 建立的基因文庫。簡稱c-文庫。24、粘性末端：含有幾個核苷酸單鏈的末端。25、同裂酶：識別相同序列的限制性內(nèi)切酶，但它們的切割位點可能不同。26、同尾酶：識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。27、基因工程：在體外對不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）進行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體DNA)，轉(zhuǎn)入微生物、植物或動物細胞內(nèi)進行無性繁殖，并表達出基因產(chǎn)物。28、逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導的DNA聚合酶）。29、亞克?。菏强寺嶒炛凶詈唵蔚囊环N，即將已克隆的DNA片段從一載體向另一載體的轉(zhuǎn)移，這一過程被稱為亞克隆。30、核酸分子雜交：用標記的已知DNA或RNA片段（探針）來檢測樣品中未知核酸序列，通過核苷酸間堿基互補的原則發(fā)生異源性結(jié)合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合核酸序列的位置或大小顯示出來。31、增色效應(yīng)：DNA變性后對260nm紫外光收增加的現(xiàn)象。32、減色效應(yīng)：當DNA分子加熱變性后，其260nm的紫外吸收會急劇增加的現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。變性DNA復性后，在260nm處的吸收值減少的現(xiàn)象33、解鏈溫度或熔解溫度（meltingtemperature,Tm)：A260值達到最大值1/2時的溫度34、核酸探針：一段帶有檢測標記的與目的基因或目的DNA特異互補的已知核苷酸序列。35、克隆載體(cloningvector)：為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。36、表達載體(expressionvector)：為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。37星星活性(staractivity)：在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性。38.單位酶:在建議使用的緩沖液及溫度下，在20ml反應(yīng)液中反應(yīng)1小時，使139.位點偏愛：即對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率。40.基因工程：在體外對不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）進行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體DNA)，轉(zhuǎn)入微生物、植物或動物細胞內(nèi)進行無性繁殖，并表達出基因產(chǎn)物。41.DNA克隆：通過將生物體基因組DNA片段作為自主復制載體的一部分進行獨立復制的方式，使對該片段的分離及操作簡單化。42.復性：在適當條件下，變性DNA的兩條互補單鏈重新結(jié)合，形成雙鏈的過程稱為復性。43.退火.在熱變性后，當溫度緩慢冷卻至比Tm值低20-30℃時，變性的單鏈DNA即可恢復雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)，這樣的復性又稱為退火。44.變性：在某些理化因素的作用下，核酸雙鏈分子堿基對的氫鍵斷裂，疏水作用被破壞，雙鏈螺旋或發(fā)夾結(jié)構(gòu)被拆開，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)被破壞，形成單鏈分子，稱為核酸的變性。45.基因擴增：指生物體內(nèi)或體外人工方式使基因拷貝數(shù)大規(guī)模增加。環(huán)境誘發(fā)擴增、基因的程序性擴增、基因組進化擴增、基因工程擴增、PCR擴增46.藥物基因組學:是研究基因序列的多態(tài)性與藥物效應(yīng)多樣性之間關(guān)系，即基因本身及其突變體與藥物效應(yīng)相互關(guān)系的一門科學。47.報告基因：是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因1、原核生物在分子生物學的應(yīng)用1.良好的研究模型進化原始，遺傳物質(zhì)比較簡單，基因組較小，便于操作2.方便的研究材料繁殖迅速，便于培養(yǎng)其中的核酸/蛋白質(zhì)及酶類容易分離純化2、細胞器的分離質(zhì)膜的處理：滲透壓沖擊；機械性剪切；非離子去污劑細胞器的分離：差速離心法.速率區(qū)帶離心法.等密度離心法差速離心法：大小和密度不同的細胞器，可以根據(jù)它們的沉降系數(shù)值不同由差速離心法互相分離并與其他細胞器分開。移去含有各種細胞器的上層懸液，并在更高的速度下進行離心以沉降線粒體，依次可分離其他細胞器．速率區(qū)帶離心法：在速率區(qū)帶離心中，混合物被加入離心管中預(yù)先鋪好的適當介質(zhì)的濃度(形成密度)梯度層。通過離心，不同成分將根據(jù)他們的沉降系數(shù)以不同的速度下沉并形成相互分離的帶或區(qū)帶．等密度離心法：也稱沉降平衡法，離心時顆粒依其密度的不同而分別沉降或向上漂浮，直至移至與其自身的密度相同的溶劑梯度為止，其結(jié)果是依樣品物質(zhì)密度的不同在梯度溶劑中形成一個個區(qū)帶3、外顯子的一般特點1.外顯子在DNA中的次序與其mRNA一致2.不同物種的相關(guān)基因的外顯子序列通常是保守的．利用這種保守性可以分離基因．3.外顯子通常短小，典型的外顯子編碼不到100aa.只有外顯子的突變才會影響蛋白質(zhì)的序列．基因的分類按產(chǎn)物的類別分：蛋白質(zhì)基因；RNA基因按其功能分：結(jié)構(gòu)基因：Structuralgene調(diào)節(jié)基因：Regulatorygene4、內(nèi)含子的一般特點1.不同斷裂基因所含的內(nèi)含子數(shù)目大不相同2.不同來源的內(nèi)含子的分子大小相差懸殊3.內(nèi)含子的位置通常是保守的4.其長度變化可以很大，高等生物的基因大小主要取決于內(nèi)含子的大?。?、假基因的形成1.基因突變改變了功能基因的轉(zhuǎn)錄起始信號2.基因突變阻止了內(nèi)含子外顯子連接處的剪接3.基因突變使翻譯提前終止6、基因重疊的方式1大基因內(nèi)包含小基因：2前后兩基因首尾重疊：3三個基因之間重疊7、移動基因的特征不利用獨立形式的元件（如質(zhì)粒ＤＮＡ），在基因組的一個位置中直接移動到另一位置不依賴于供體與受體位點序列間的任何聯(lián)系其移動局限于將其自身（有時連帶一些其他序列）轉(zhuǎn)移至同一基因組內(nèi)的新位置相當于基因組內(nèi)的載體類似物8、移動基因分類插入序列（insertionsequence,IS)，IS因子，IS原件轉(zhuǎn)座子（Tn，transposon)；又稱轉(zhuǎn)位子或易位子Mu噬菌體（mutatorphage）9、插入序列（IS）結(jié)構(gòu)共同特征：1.IS末端都有一段反向重復序列（IR序列）2.IS插入靶位點后，在其兩端的外側(cè)產(chǎn)生一段短小的同向重復序列3.IS一般只編碼參與轉(zhuǎn)位作用的轉(zhuǎn)位酶，它可識別反向重復序列10、基因移動的效應(yīng)插入位置上出現(xiàn)新基因插入突變；序列的缺失或倒位基因的移動和重排，造成同源序列整合產(chǎn)生染色體畸變增加新的變異，有利于進化最簡單的突變是點突變，即一個單一堿基的改變。點突變可以是轉(zhuǎn)換（嘌呤與嘌呤之間，嘧啶與嘧啶之間互換）或顛換（嘌呤與嘧啶之間發(fā)生互換）。11、基因突變的特征突變的重演性和可逆性突變的多方向性與復等位基因突變的有害性和有利性突變的稀有性和隨機性在真核生物中，C值一般隨著生物的進化而增加，高等生物C值一般大于低等生物。12、病毒基因組的特點1.每種病毒中只有一種核酸，DNA或RNA2.病毒核酸大小差別很大。一般DNA病毒較大，RNA病毒較小。3.大部分病毒核酸是單倍體。4.噬菌體基因組中無內(nèi)含子，但感染真核細胞的病毒基因組中具有內(nèi)含子。5.有基因重疊現(xiàn)象。6.大部分DNA用于編碼蛋白質(zhì)，只有一小部分是不翻譯的。7.調(diào)控序列可以被宿主細胞所識別。8.多數(shù)RNA病毒的基因組是有連續(xù)的幾條RNA鏈組成，但也有些病毒的基因組RNA由不連續(xù)的幾條RNA鏈組成。13、細菌的基因組及特點1.基因組相對較?。?06bp），只有一個復制啟始位點。2.具有操縱子結(jié)構(gòu)：3.基因是連續(xù)的：4.大部分DNA是用于編碼蛋白質(zhì)的，只有一小部分是不翻譯的。5.基因組中僅有少數(shù)基因存在基因重疊現(xiàn)象。6.結(jié)構(gòu)基因是單拷貝，rRNA基因是多拷貝14、真核生物基因組的特點1.基因組含有更大的DNA分子，以染色體形式儲存于細胞核內(nèi)，除配子細胞外，體細胞內(nèi)的基因的基因組是雙份的?！白⒁釩值悖理”2.基因組結(jié)構(gòu)復雜，有多個復制啟始位點，但每個復制子的長度較小。3.基因是不連續(xù)的。4.轉(zhuǎn)錄單位一般是單順反子的。5.存在重復序列6.存在多基因家族和超基因家族7.基因類型多樣15、基因載體分類來源分類：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體用途分類：克隆載體、表達載體16、質(zhì)粒的生物學特性1、質(zhì)粒是細菌染色體外能自主復制的環(huán)形雙鏈DNA分子。2、編碼一種或數(shù)種抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒3、質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復制而復制。4、接合型質(zhì)粒：自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒：不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒與控制細菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因有關(guān)質(zhì)粒DNA的遷移作用：由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程。5、根據(jù)每個寄主細胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，嚴緊型復制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為1-3個）松弛型復制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達10-200個拷貝）分型與寄主狀況有關(guān)載體的致死效應(yīng)：利用質(zhì)粒進行基因克隆時，有時大量的克隆化基因和克隆化基因產(chǎn)物可能不利于宿主細菌的生長繁殖。6、質(zhì)粒的不親和性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。這樣的兩種質(zhì)粒稱不親和質(zhì)粒。17、質(zhì)粒載體的選擇標準1.具有復制起點：能自主復制2.具有抗菌素抗性基因：兩個或兩個以上3.若干個限制性內(nèi)切酶單一識別位點（多克隆位點）4.較小的分子量和較高的拷貝數(shù)作為載體的質(zhì)粒必定包括復制基因、選擇性標記和克隆位點三部分λ噬菌體基因組中心區(qū)域的大部分對侵染裂解都是非必須的，可以被替換。18、λ噬菌體載體的優(yōu)點分子遺傳學背景十分清楚載體容量較大，~23kb有較高的感染效率，100%19、柯斯質(zhì)粒載體的優(yōu)勢具有λ噬菌體的特性具有質(zhì)粒載體的特性具有高容量的克隆能力具有與同源序列的質(zhì)粒進行重組的能力20限制性內(nèi)切酶的功能1.限制與修飾Restrictionandmodification50年代初，寄主控制的專一性（hostcontrolledspecificity）l噬菌體具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率，l在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時受到限制的現(xiàn)象。EcoliKEcoliBEcoliClK110-41lB10-411lC10-410-41說明K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)，可排除外來的DNA10-4的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果21限制性內(nèi)切酶的類型及相互區(qū)別目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。I型限制性內(nèi)切酶II類限制性內(nèi)切酶III類限制性內(nèi)切酶1.I型限制性內(nèi)切酶（1）識別位點序列：未甲基化修飾的特異序列。（2）切割位點：在距離特異性識別位點約1000—1500bp處隨機切開一條單鏈。（3）作用機理：需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。2.II類限制性內(nèi)切酶（1）識別位點序列：未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）。與DNA的來源無關(guān)。（2）切割位點：識別位點處。（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）：含有幾個核苷酸單鏈的末端。分兩種類型：①5’端凸出（如EcoRI切點）②3’端凸出（如PstI切點）（4）粘性末端的意義①連接便利i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。這比連接兩個平齊末端容易的多。ii）同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。②5’末端標記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進行32P標記。凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。③補平成平齊末端粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊末端。3.Ⅲ型限制性內(nèi)切酶：在完全肯定的位點切割DNA，但反應(yīng)需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。ⅡⅠⅢ酶分子內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起三亞基雙功能酶二亞基雙功能酶識別位點4-6BP，大多數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)二分非對稱5-7bp非對稱切割位點在識別位點中或靠近識別位點無特異性，至少在識別位點外1000bp在識別位點下游24-26bp限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng)分開的反應(yīng)互斥同時競爭限制反應(yīng)是否需要ATPNoYESYES22影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1.DNA的純度2.DNA的甲基化程度3.溫度4.緩沖液(Buffer)23T4DNA連接酶功能1.可以修復雙鏈DNA骨架的斷裂2.催化限制酶酶解反應(yīng)的逆反應(yīng)3.使退火的互補黏性末端共價連接在一起，形成新的DNA分子。主要是催化雙鏈DNA一端的3’-OH與另一雙鏈DNA5’端的磷酸根形成3’,5’-磷酸二酯鍵，使具有相同粘末端或平端的DNA末端連接起來。24末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）功能（1）5’?3’DNA聚合酶活性：在二價陽離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子的3’⑵同聚物加尾：給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。25堿性磷酸酶的作用用堿性磷酸酶處理線性載體分子，以除去5’—磷酸基團，使載體在沒有目的片段插入的情況下不能連成環(huán)狀，從而降低反應(yīng)物中載體自身環(huán)化的比例。該酶可從DNA分子的5’端去除磷酸基。催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。堿性磷酸酶有兩種：由大腸桿菌分離出來的細菌堿性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase,BAP）和由牛腸道分離出來的小牛腸堿性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase，ClAP），它們都催化切除DNA、RNA和dNTP上的5’磷酸基團。堿性磷酸酶用于從DNA片段上除去5’磷酸，以防止自身連接。26常用的DNA聚合酶的特點1.共同特點把dNTPs連續(xù)地加到引物的3’—2.主要區(qū)別1.持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。2.T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。3.其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。27基因工程的主要操作內(nèi)容1.目的基因的獲取從復雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。2.重組體的制備將目的基因的DNA片斷插入到能自我復制并帶有選擇性標記（抗菌素抗性）的載體分子上。3.重組體的轉(zhuǎn)化將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當?shù)氖荏w細胞中。4.克隆鑒定挑選轉(zhuǎn)化成功的細胞克?。ê心康幕颍?.目的基因表達使導入寄主細胞的目的基因表達出我們所需要的基因產(chǎn)物。28堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟第一步：溶菌使用“溶液Ⅰ”溶解細菌細胞壁。第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性溶液II破壞細胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。第三步：中和溶液III使DNA復性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復合物和染色體DNA、RNA沉淀。第四步：離心除去沉淀上清液中含有閉合質(zhì)粒DNA。第五步：純化DNA上清液過柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇。29形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān):分子量越大，移動越慢。相同分子量的DNA：環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快，線性分子次之，伸展開環(huán)狀最慢。30瓊脂糖凝膠的分辨力1.空隙大小決定其分辨分子大小的能力。2.空隙小，分辨率高：小分子較易通過，而大分子難通過；3.空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過。31探針的分類：（1）寡核苷酸探針：（2）基因組DNA探針：（3）cDNA探針：（4）RNA探針：32Northern印跡雜交的應(yīng)用及其對象與Southern雜交類似。檢測目的RNA的存在與否及含量。1．基本原理和基本過程與Southernblot基本相同2．鑒別RNA3．探針可用DNA或RNA片段4．待測樣品為總RNA或mRNA33蛋白質(zhì)的免疫印跡（western)操作過程蛋白的制備-----→SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離不同的蛋白質(zhì)雜交（一抗與特定蛋白結(jié)合）↓漂洗去除多余的一抗↓二抗與一抗結(jié)合↓漂洗去多余的二抗↓結(jié)果檢測34PCR基本原理在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。變性(denaturation)：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA 退火(annealing)：當溫度突然降低時，反應(yīng)體系中引物和其互補的DNA模板在局部形成雜交鏈。延伸(extension)：在DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）及Mg2+存在條件下，5’→3’的聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應(yīng)。35PCR的過程（1）第一步：變性（denature）94-95oC下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。（2）第二步：復性（anneal）50-60oC下1分鐘，引物優(yōu)先與模板復性。①引物的濃度高，②引物的鏈短。（3）第三步：延伸（extend）72oC下1-2分鐘，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（4）第四步：變性（denature）94oC下1分鐘，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。（5）第五步：重復（repeat）36引物（primer)設(shè)計原則①序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源序列。②引物長度以15-40bp為宜。③堿基盡可能隨機分布,G+C占50-60%。④引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。⑤兩引物間避免有互補序列。⑥引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴格限制。37PCR技術(shù)在醫(yī)學中應(yīng)用（1）.獲得目的基因（2）PCR在病原體基因檢測的應(yīng)用PCR技術(shù)可用于診斷禽流感、口蹄疫、愛滋病、肝炎病毒、結(jié)核桿菌等（3）PCR技術(shù)在法醫(yī)學上的應(yīng)用：個人識別與親子鑒定。①HLA-DQα分型的應(yīng)用HLA-DQα：人類白細胞抗原-DQα②在性別鑒定中的應(yīng)用（4）遺傳相關(guān)基因的檢測38原核表達體系優(yōu)勢：1.一種成熟的基因克隆表達的受體細胞2.繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制3.易于進行遺傳操作和高效表達不足之處：1）缺乏適當?shù)霓D(zhuǎn)錄后和翻譯后加工機制。2）缺乏表達蛋白質(zhì)復性系統(tǒng)，表達蛋白無特異性空間結(jié)構(gòu)。3）表達產(chǎn)物不穩(wěn)定，易被細菌蛋白酶降解。4）表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)5）很難表達大量可溶性蛋白39真核表達體系酵母、昆蟲、乳類動物細胞優(yōu)點：1.可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA2.可適當修飾表達的蛋白質(zhì)3.表達產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點：操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟40.1.細菌基因組DNA的制備一般過程及原理（1）細胞裂解（2）DNA純化（3）沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇。2.哺乳動物細胞基因組DNA的抽提一般過程及原理：（1）組織粉碎（2）細胞裂解（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。