小分子蛋白western注意事項(xiàng)及操作技巧

摘自丁香園：跟大家分享一下小分子蛋白的western-blot相關(guān)注意事項(xiàng)以及操作技巧：我搞得蛋白質(zhì)是一個(gè)11KD的分泌性蛋白，并且是我實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中一個(gè)重要的指標(biāo)，最初學(xué)習(xí)WB技術(shù)，受困于二抗不合格一直連內(nèi)參都做不出來。。。后面改換抗體之后，才相對(duì)順利一點(diǎn)，其他指標(biāo)也相繼出來了。所以抗體真的很重要。但是在做WB實(shí)驗(yàn)的7、8個(gè)月過程中，我的核心的一個(gè)蛋白一直處于混沌狀態(tài)，可能跑30次能現(xiàn)身一次，現(xiàn)身之后又沒影好幾個(gè)月，就這樣捉摸不定，搞得我很煩，但又無可奈何。詢問了實(shí)驗(yàn)室的同學(xué)們，說法各一：1、有人說小分子量蛋白就是難跑，為什么難大家也說不清楚。2、有的說分泌性蛋白本身胞內(nèi)含量少，不好跑，需要加大上樣量，似乎也是實(shí)話。3、還有的說小分子量蛋白容易降解，你的蛋白質(zhì)降解了吧，我姑且信了。但是95%的時(shí)候我跑出的條帶都是大白板，縱然我通過PCR、細(xì)胞的免疫熒光都能夠發(fā)現(xiàn)這個(gè)蛋白，但是就是WB做不出來，4、也有朋友告訴我說分泌型蛋白你還是做ELISA吧，可是一來這個(gè)蛋白的ELISA試劑盒好貴的，二來我就是想做WB。。。。所以就開始了上下求索之路。95%的時(shí)間跑出來的條帶是這樣的。。。這一求索就是幾個(gè)月的時(shí)間。期間一直覺得電泳沒什么技術(shù)含量，電轉(zhuǎn)的過程才是重點(diǎn)，于是糾結(jié)于電轉(zhuǎn)條件；也糾結(jié)過電轉(zhuǎn)液的配置等。就在最近，再次翻閱論壇里面大神的回帖，其中一個(gè)大神提到：小分子量蛋白容易在電泳過程中彌散，電泳在壓縮膠里多壓一會(huì)，在分離膠里面跑一半就好了。對(duì)這個(gè)話百思不得其解，于是開始查詢一些實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面的文獻(xiàn)，其中有幾篇文獻(xiàn)對(duì)我很有啟發(fā)，其中有些技術(shù)原理方面的內(nèi)容如下：在含SDS緩沖液的樣品中，小分子多肽的濃縮是較困難的，因?yàn)樾》肿佣嚯呐cSDS形成的復(fù)合體具有與SDS本身類似的電荷和大小，所以偏離了相對(duì)遷移率和分子質(zhì)量對(duì)數(shù)的相互關(guān)系，因此濃縮對(duì)于小分子多肽的SDS來說就成了一個(gè)突出問題。于是回去翻了翻自己曾經(jīng)偶然跑出來的條帶的模樣，給我的感覺就是壓縮的不好，然后還有彌散的現(xiàn)象（就是那種蛋白暈開的模樣，例如這條帶下面的波浪邊緣，當(dāng)然也可能是膠不均勻的原因吧，反正我當(dāng)時(shí)就覺得是彌散的現(xiàn)象）然后我就突然有種恍然大悟的感覺，也許說的不對(duì)，但是我個(gè)人的感覺是：一般較大的分子量的蛋白（如20-70KD）與上樣緩沖液中的SDS結(jié)合后，因?yàn)楸旧淼鞍追肿哟?，SDS附著在上面之后，還是和膠里面的SDS成分有較大差異的，那么在一定電流方向的作用下，就能夠順著電流方向向下電泳；而小分子蛋白被SDS包裹結(jié)合形成復(fù)合物后，因?yàn)榈鞍追肿有?，包裹上SDS后就和膠里面本身的SDS差別沒那么大了，那么此時(shí)就算有電流作用，它也不會(huì)那么聽話的順流而下，畢竟和周遭的膠里面的SDS區(qū)別不大，在電泳向下走的過程中，可能向其他方向混亂的運(yùn)動(dòng)，走著走著就暈染開了，就像墨點(diǎn)到宣紙上一樣。所以回到前面大神說的話，讓多壓一會(huì)，那么就是為了讓小分子蛋白盡量聚集；少電泳一會(huì)，就是稍微跑開marker之后，能夠分開小分子蛋白和內(nèi)參即可，加入跑多了，例如溴酚藍(lán)跑到下沿1cm以上的位置，那時(shí)候可能小分子蛋白就又暈染開消失在膠里面了，這樣的話一抗也就不能識(shí)別那么彌散的蛋白了。專業(yè)人士原諒我粗淺的認(rèn)識(shí)哈，也許不對(duì)，但是我理解的就是這樣，我就是打個(gè)比方讓其他的科研小白能理解然后在論壇里面還看到一個(gè)建議就是用0.2%的戊二醛固定轉(zhuǎn)膜完成后的條帶45分鐘，然后再進(jìn)行后續(xù)封閉漂洗等步驟，為的就是防止小分子蛋白在后續(xù)操作中洗脫了。于是乎說干就干，開始了我的再次改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)歷程，說來簡單，實(shí)際上從25號(hào)到1號(hào)，一共8天時(shí)間，我大概做了12次WB，終于能夠重復(fù)出來結(jié)果了。要點(diǎn)如下：1、電轉(zhuǎn)液中一定不要加SDS。對(duì)于大分子量蛋白加入SDS是為了增加轉(zhuǎn)膜效率，道理上是增加了蛋白表面電荷。而對(duì)于小分子量蛋白，SDS千萬不能加，否則會(huì)封閉小分子蛋白的抗原位點(diǎn)（我忘記從哪里看到的了，文獻(xiàn)不能在這里給出，大家勿吐槽我哈）2、從最開始糾結(jié)于電轉(zhuǎn)過程，使勁摸索電轉(zhuǎn)條件，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)電泳過程同樣很重要啊。電轉(zhuǎn)的時(shí)候其實(shí)只要預(yù)染marker只要轉(zhuǎn)到膜上了，那么你的相應(yīng)分子量的目的蛋白也就轉(zhuǎn)過去了，所以這就是你摸索條件的指示帶。3、電泳過程中有推薦TRICINE-SDS膠來進(jìn)行電泳，會(huì)更有利于小分子量蛋白的分離，研讀了一些文獻(xiàn)，這個(gè)效果應(yīng)該還是很肯定的，但是鄙人沒有做過這種電泳，所以給不了什么經(jīng)驗(yàn)，我最終還是用普通SDS膠做出來的，不過鑒于我的蛋白分子量是11KD，那么假如你是幾KD甚至更小分子量的多肽，那么還是建議你用TRICINE-SDS膠來電泳吧。4、在我用SDS膠進(jìn)行電泳過程中，一直以來都是按照說明書配制壓縮膠和分離膠的，并且在說明書中，以配置2塊膠為例，分離膠說明書中是讓配置10ml，壓縮膠是3ml。我一直以為是對(duì)應(yīng)關(guān)系，在這次大悟之后我發(fā)現(xiàn)分離和壓縮完全不是一對(duì)一對(duì)應(yīng)關(guān)系，人家只是給了你配置這么多體積膠的配方而已，雖然在一個(gè)縱列上，但是絕不是對(duì)應(yīng)關(guān)系（我確實(shí)才覺悟，高手輕鄙視哈）。5、接上一條經(jīng)驗(yàn)，所以我在配膠過程中，下層分離膠配制了10ml，但是實(shí)際上每塊玻板里面只加了大概3.5ml吧，也就是整個(gè)玻板高度的60-70%的樣子。然后壓縮膠配了6ml，玻板填滿插梳子，等凝固。這里我就是想讓我的小分子蛋白盡量在濃縮膠里面多濃縮、壓扁，這樣后續(xù)再分離膠里面，即使彌散一些，也總還有剩下的。6、電泳開始，在濃縮膠層里面跑的時(shí)候，我是60-70V電壓，跑了大概快一個(gè)小時(shí)，反正就是溴酚藍(lán)都集中在上下層膠的那個(gè)界面的位置，并且在界面那里好半天都不動(dòng)了，那么這個(gè)過程我理解就是小分子量蛋白雖然表面電荷和膠里面的SDS相當(dāng)，但是終究還是會(huì)沿著電流方向定向移動(dòng)的，所以就多壓一會(huì)吧。然后開始調(diào)整電壓為110-120V在分離膠里面跑，我是跑到分離膠一半的位置就停止電泳了，這時(shí)候marker已經(jīng)分開一些了。7、接上一條，marker分開了一些，但是實(shí)話說分的并不好，你如果想同時(shí)測(cè)好幾個(gè)蛋白指標(biāo)是很困難的，不好切膠，也不好敷條帶，所以我的建議，小分子蛋白就單獨(dú)出來跑吧。8、電泳完成后，開始電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)過程我試過90V恒壓60分鐘，也試過250ma恒流15分鐘，對(duì)于我的蛋白都能得到滿意結(jié)果。9、轉(zhuǎn)膜后條帶是否必須戊二醛固定？經(jīng)過我的嘗試，對(duì)于我的11KD蛋白來說固定不固定沒有影響，那么即使固定了，戊二醛也不會(huì)影響后續(xù)的抗原抗體反應(yīng)。所以各位同學(xué)們固定不固定隨意吧，假如你的蛋白分子量很小，也許5KD以下？那么固定一下也未嘗不可。10、抗原抗體反應(yīng)很靈敏，我的抗體在免疫熒光上面已經(jīng)驗(yàn)證過的，所以敷抗體的過程沒什么說的。不過抗體稀釋比例的話，我是習(xí)慣提高濃度的，說明書1：1000，我就1：500。這個(gè)沒有依據(jù)，純癖好，也是師兄們教的。。。11、顯影這一步我覺得也有可說的。我試過多次，發(fā)現(xiàn)我的這個(gè)蛋白第一遍滴加顯影液后條帶不會(huì)很清晰，然后你可以把條帶拿出來就放一邊讓它反應(yīng)一會(huì)，然后再放回機(jī)器里面，重新滴加顯影液顯影，效果就會(huì)好不少。還有顯影時(shí)間，結(jié)合我的示例，機(jī)器給出的自動(dòng)曝光時(shí)間是30幾秒，我就直接加1分鐘改為1分30幾秒，然后就得到了下面的條帶第一遍顯影條帶，可以看到模糊有東西，但是不清楚，于是我拿出來放一邊反應(yīng)一下。反應(yīng)幾分鐘后，我再把條帶放進(jìn)機(jī)器，時(shí)間上直接增加1分鐘，再滴加新的顯影液，是不是好了很多到這里我就總結(jié)完了我的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)。當(dāng)然這78個(gè)月的摸索，還有很多想說的，但是限于篇幅和敘事能力有限，就大致總結(jié)了幾條，有些啰嗦，見諒。希望對(duì)還被小分子量蛋白WB折磨的朋友們有幫助。一、

關(guān)于上樣量的問題（要大！要大！要大！重要的事說三遍）。通常WesternBlot每孔上樣量為30-60μg，當(dāng)?shù)鞍追肿恿窟^大或過小時(shí)，上樣量建議選擇60μg。畢竟對(duì)

于小分子的蛋白來說，在跑電泳時(shí)，稍稍一個(gè)不留心，蛋白就跑丟了，丟了，了……對(duì)于分子量大的蛋白來說，為了后續(xù)轉(zhuǎn)膜成功，因此同樣需要提高蛋白的上樣量。二、合適的膠濃度。無論是蛋白分子量過大還是過小，都應(yīng)該選擇合適的濃縮膠及分離膠濃度。分子量小的蛋白，建議配置5%的濃縮膠，17%的分離膠；分子量大的蛋白，建議配置3%的濃縮膠，6%的分離膠。以此為基礎(chǔ)，要保證電泳過程中，蛋白條帶要充分跑開。三、轉(zhuǎn)膜時(shí)，要準(zhǔn)確把握住轉(zhuǎn)膜時(shí)間。建議用恒壓100V進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。對(duì)于小分子量蛋白來說，轉(zhuǎn)膜時(shí)間應(yīng)不超過40min為宜；而對(duì)于大分子量蛋白來說，大分子蛋白要比小分子蛋白慢，因此可以延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間，轉(zhuǎn)膜時(shí)間大概在1.5h-2h。另外轉(zhuǎn)膜緩沖液中，無水甲醇的濃度通常為20%。四、轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行麗春紅染色，測(cè)定蛋白豐度。PVDF膜經(jīng)麗春紅染色后，可以檢測(cè)出樣品電泳過程中呈現(xiàn)印跡的大小，通過各個(gè)泳道上樣品印跡的對(duì)比，可以初步判斷上樣量的準(zhǔn)確