微生物學(xué)教學(xué)課件：10-分類與鑒定

第十章

微生物分類與鑒定吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本章內(nèi)容:一、分類單元二、微生物的命名規(guī)則三、微生物分類鑒定的方法四、微生物分類系統(tǒng)五、微生物鑒定例子裸子植物苔蘚類的植物藻類被子植物原生動物海綿動物腔腸動物線蟲類甲殼綱動物昆蟲軟體動物棘皮類動物兩棲動物爬行動物Taraxacum

Dandelion，

isacorruptionoftheFrenchdentdelionmeaning“l(fā)ion‘stooth”,referringtothecoarselytoothedleaves。Othercommonnamesincludefaceclock,pee-a-bed,wet-a-bed,swine'ssnout,whiteendive,andwildendive.Hungarian：gyermekláncf?

BulgarianandMacedonian

：глухарчеandглуварче

Turkish：karahindiba

Swedish：maskros('wormrose')afterthesmallinsectsusuallypresentintheflowersFinnishandEstonian：voikukkaandv?ilill,respectively,meaning"butterflowerDutch：paardenbloem,meaning"horse-flower".Persian：qasedak(?????),meaningthe"smallpostman"Greek：kleftis(κλ?φτη?)meaning"thief"becauseitisverydifficulttocatchonceairborne.Cyprus：pappous(παππο??)meaning"grandfather"duetothewhite-colouredseedheadresemblingthewhitehairofanolderman.蒲公草、食用蒲公英、尿床草、西洋蒲

公英，鳧公英(《千金方》)、耩褥草(《唐本草》)、蒲公英(《千金翼方》)蒲公英(《本草圖經(jīng)》)、地丁(《本草衍義》)、金簪草(《士宿本草》)、孛孛丁菜、黃花苗、黃花郎(《救荒本草》)、鵓鴣英(《庚辛玉冊》)、婆婆丁(《滇南本草》)、白鼓丁(《野菜譜》)、黃花地丁、蒲公丁、真痰草、狗乳草(《綱目》)、奶汁草(《本經(jīng)逢原》)、殘飛墜(《生草藥性備要》)、黃狗頭(《植物名實圖考》)、卜地蜈蚣、鬼燈籠(《草木便方》)、羊奶奶草(《本草正義》)、雙英卜地(《貴>>民間方藥集》)、黃花草、古古丁(《江蘇植藥志》)、茅蘿卜(《四川中藥志》)、黃花三七(《杭州藥植志》)、婆婆?。ㄟ|寧）、仆公罌(《本草圖經(jīng)集》CarlLinnaeus(CarlvonLinné)卡羅魯斯林奈(1707-1778),瑞典植物學(xué)家，分類學(xué)之父。建立鑒別生物的標(biāo)準(zhǔn)；將相關(guān)生物進(jìn)行分類；為生物進(jìn)化提供依據(jù)。分類(classification)：根據(jù)一定的原則(表型特征相似性或系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性)對微生物進(jìn)行分群歸類，根據(jù)相似性或相關(guān)性水平排列成系統(tǒng)，并對各個分類群的特征進(jìn)行描述，以便查考和對未被分類的微生物進(jìn)行鑒定。(根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)建立系統(tǒng)的過程)分類學(xué)（Taxonomy

）的具體任務(wù)有三個：鑒定分類、命名、命名(nomenclature)：是根據(jù)命名法規(guī)，給每一個分類群一個專有的名稱。鑒定(identification或determination)：借助于現(xiàn)有的微生物分類系統(tǒng)，通過特征測定，確定未知的、或新發(fā)現(xiàn)的、或未明確分類地位的微生物所應(yīng)歸屬分類群的過程。(根據(jù)現(xiàn)有系統(tǒng)確定未知微生物分類歸屬的過程)1.種以上的系統(tǒng)分類單元界Kingdom門Phylum,Division綱Class目Order科Family屬Genus

種Species（基本分類單元）一、分類單元林奈的七級分類單元并把所有生物分為兩界：植物界；動物界。二界1753年林奈三界1866年Haeckel四界1956年植物界動物界原生生物界植物界動物界原始生物界菌界五界1956年植物界Plantae動物界Animalia原生生物界Protista真菌界Fungi原核生物界Monera依據(jù)表型特征的分類依據(jù)16sRNA和18sRNA序列的同源性，將原核生物分化為細(xì)菌和古生菌兩個域，而動物、植物和真菌在進(jìn)化上更具相關(guān)性，合并為真核生物域，1990年美國伊利諾伊大學(xué)CarlWoese發(fā)表生物三域（Domain）學(xué)說。依據(jù)生物系統(tǒng)發(fā)育的分類種是生物分類中基本的分類單元和分類等級。

微生物的種：指具有高度特征相似性的菌株群，這個菌株群與其他類群的菌株有很明顯的區(qū)別。2.種（species）由于細(xì)菌分類單元的劃分缺乏一個易于操作的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，為了減少因采用不同標(biāo)準(zhǔn)界定分類單元所造成的混亂，細(xì)菌系統(tǒng)分類也像其它生物分類一樣采用“模式概念”種和亞種指定模式菌株（typestrain）；

如：大量的豌豆根瘤菌(Rhizobium

leguminosarum)菌株中，只有菌株USDA2370才是模式菌株。亞屬和屬指定模式種（typespecies）；屬以上至目級分類單元指定模式屬（typegenus）.3.種以下的分類單元1）亞種(subspecies)和變種(variety)：種內(nèi)的不同菌株存在少數(shù)明顯而穩(wěn)定遺傳的變異特征，這種差異又不足以區(qū)分成新種時，可以細(xì)分成亞種或變種。2）型(form或type)：常指亞種以下的細(xì)分。當(dāng)同種或同亞種不同菌株之間的性狀差異，不足以分為新的亞種時，可以細(xì)分為不同的型。例如：抗原特征的差異，分為不同的血清型；對噬菌體裂解反應(yīng)的不同，分為不同的噬菌體型3）菌株(strain)：從自然界中分離得到的任何一種微生物的純培養(yǎng)物都可以稱為一個菌株；用實驗方法(如通過誘變)所獲得的某一菌株的變異型，也可以稱為一個新的菌株，以便與原來的菌株相區(qū)別。菌株是微生物分類和研究工作中最基礎(chǔ)的操作實體菌株與型的區(qū)別：菌株之間不存在鑒別特征的差異，命名不同的菌株無需分類學(xué)依據(jù)；不同型的細(xì)菌之間存在鑒別特征的差異，命名或鑒定不同的型必需有分類學(xué)依據(jù)。4）培養(yǎng)物（culture）：一定時間一定空間內(nèi)微生物的細(xì)胞群或生長物，如微生物的斜面培養(yǎng)物、搖瓶培養(yǎng)物。5）居群(population)：是指在一定空間中同種個體的組合。二、微生物的命名規(guī)則微生物名稱：俗名（commonname）

學(xué)名（scientificname）（1）學(xué)名國際命名法規(guī)：雙名法（林奈發(fā)明）：屬名+種名加詞屬名在前，一般用拉丁文名詞表示，字首字母大寫種名在后，常用拉丁文形容詞表示，全部小寫

一般用斜體表示Alcaligenes

denitrificans

subsp.

xylosoxydans屬名種名加詞subspecies亞種名加詞（產(chǎn)堿菌屬）（反硝化的）的縮寫（亞種）（氧化木糖的）

當(dāng)兩個或多個學(xué)名排在一起時，若它們的屬名相同，則后面的屬名可縮寫成1個、2個或3個字母，在其后加一個點。如：Bacillus可縮寫成“B.”或“Bac.”

若所分離的菌株只鑒定到屬而未鑒定到種，用sp.（單數(shù)）或spp.（復(fù)數(shù)）表示。如：Bacillussp.（2）在分類學(xué)文獻(xiàn)中

學(xué)名=屬名+種名+（首次定名人）+現(xiàn)名定名人+現(xiàn)名定名年份必要（斜體）可省略（正體）（3）三名法

有亞種或變種時，學(xué)名由“三名法”構(gòu)成

學(xué)名=屬名

+種名加詞

+subsp

或var+亞種或變種的加詞斜體正體（可省略）斜體（不可省略）三、微生物分類鑒定的方法菌種鑒定步驟：獲得純培養(yǎng)物測定必要的鑒定指標(biāo)查找權(quán)威性的菌種鑒定手冊分類鑒定方法：經(jīng)典分類鑒定法微生物遺傳型的鑒定細(xì)胞化學(xué)成分的鑒定現(xiàn)代方法數(shù)值分類法（一）經(jīng)典分類鑒定法形態(tài)學(xué)特征生理學(xué)特征生態(tài)學(xué)特征經(jīng)典鑒定指標(biāo)：生活史，有性生殖情況血清學(xué)反應(yīng)對噬菌體的敏感性其它形態(tài)和生理生化特征是最常用的細(xì)菌分類、鑒定指標(biāo)

在生物學(xué)表型為指標(biāo)的傳統(tǒng)方法，正在向微量化、簡便化、快速化、智能化的方向發(fā)展。目前，已有商品化的鑒定系統(tǒng)，如：

API系統(tǒng)

“Enterotube”

“Biolog”全自動和手動系統(tǒng)

按大量表型性狀的相似性程度進(jìn)行統(tǒng)計、歸類

特點:

使用盡可能多的性狀，每個性狀同等重要。

步驟:(1)收集菌株，選擇性狀

(2)性狀編碼

(3)相似性計算:

計算相關(guān)系數(shù)Ssm（簡單匹配相關(guān)系數(shù)）或Sj（Jaccard相關(guān)系數(shù)）：

Ssm=（a+d）/(a+b+c+d)

正負(fù)反應(yīng)性狀

Sj=a/(a+b+c)

正反應(yīng)性狀

Sj>80~85%種

Sj>65%屬

(4)系統(tǒng)聚類

(5)聚類結(jié)果的表示1.

數(shù)值分類法（統(tǒng)計分類法）（二）現(xiàn)代分類鑒定方法2.微生物遺傳型的鑒定特點：與形態(tài)及生理生化特性的比較不同，對DNA堿基組成的比較和進(jìn)行核酸分子雜交是直接比較不同微生物之間基因組的差異，因此結(jié)果更加可信。（1）DNA堿基比例的測定

測“GC比”：

(G+C)mol%=（G+C）/（A+T+G+C）×100%

分類學(xué)上，用G+C占全部堿基的克分子百分?jǐn)?shù)來表示各類生物的DNA堿基組成特征。

DNA堿基組成是各種生物的一個穩(wěn)定特征，即使個別基因突變，堿基組成也不會發(fā)生明顯變化。a）每種生物都有特定的GC%范圍，因此可以作為分類鑒定的指標(biāo)。細(xì)菌的GC%范圍為25-75%，變化范圍最大。b）GC%測定主要用于對表型特征難區(qū)分的細(xì)菌作出鑒定，從分子水平上判斷物種的親緣關(guān)系。c）

GC%的比較，主要用于分類鑒定中的否定親緣關(guān)系近的生物，它們應(yīng)該具有相似的G+C含量，但具有相似G+C含量的生物，并不一定表明它們之間具有近的親緣關(guān)系。GC%使用注意事項：同一個種內(nèi)的不同菌株GC%含量差別應(yīng)在4～5%以下；同屬不同種的差別應(yīng)低于10～15%；

GC%含量已經(jīng)作為建立新的微生物分類單元的一項基本特征，它對于種、屬甚至科的分類鑒定有重要意義。若兩個在形態(tài)及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其GC%含量的差別大于5%，則肯定不是同一個種，大于15%則肯定不是同一個屬。熱變性法浮力密度法高效液相色譜法（2）核酸的分子雜交不同生物DNA堿基排列順序的異同直接反映生物間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，堿基排列順序差異越小，它們之間的親緣關(guān)系就越近，反之亦然。（3）rRNA序列同源性分析rRNA作為進(jìn)化和系統(tǒng)分類指征的優(yōu)點：a）rRNA具有重要且恒定的生理功能；b）在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究；c）16SrRNA分子量大小適中，便于序列分析；d）rRNA在細(xì)胞中含量大(約占細(xì)胞中RNA的90%)，也易于提??；e）16SrRNA普遍存在于原核生物中(真核生物中其同源分子是18SrRNA)。因此它可以作為測量各類生物進(jìn)化的工具。一些生物大分子（如16SrRNA或18SrRNA），其分子序列的改變量與分子進(jìn)化的時間成正比，因此，這些生物大分子被作為分子計時器，真實記錄了各種生物的進(jìn)化過程?？赏ㄟ^比較不同類群的生物大分子序列的改變量來確定它們彼此系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)性或進(jìn)化距離。分子計時器：（3）rRNA序列同源性分析三種方法：

rRNA-DNA雜交、

rRNA寡核苷酸編目分析

rRNA基因序列分析（系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖）。分析不同微生物16SrRNA或18SrRNA寡核苷酸序列的同源性程度，以確定不同生物間的親緣關(guān)系和進(jìn)化譜系。T1RNA酶水解（專一性水解G上3’端磷酸酯鍵）提純rRNA（32P標(biāo)記）一系列寡核苷酸片段（長度不一以G為末端）雙向電泳分離，確定rRNA寡核苷酸的指紋圖譜寡核苷酸序列分析（6個核苷酸以上）編目，比較、計算和分析確定菌株間的親緣關(guān)系rRNA寡核苷酸編目分析實驗方法：rRNA寡核苷酸編目分析的基本原理：用一種RNA酶水解rRNA后，產(chǎn)生一系列寡核苷酸片段，如果兩種或兩株微生物的親緣關(guān)系越近，則其所產(chǎn)生的寡核苷酸片段的序列也接近，反之亦然。（4）微生物全基因組序列測定第一個古菌：詹氏甲烷桿菌第一個細(xì)菌：流感嗜血桿菌第一個真菌：釀酒酵母3.

細(xì)胞化學(xué)成分用作鑒定的指標(biāo)

細(xì)胞壁的化學(xué)成分全細(xì)胞水解液的糖型磷酸類脂成分的分析枝菌酸的分析醌類的分析脂肪酸組成和代謝產(chǎn)物分析好氧放線菌類的化學(xué)分類檢索表二氨基庚二酸二氨基庚二酸

《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》(Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology)

第一版（1923年）~第八版（1974年）~第九版（1994年）美國賓夕法尼亞大學(xué)的細(xì)菌學(xué)教授伯杰(D.Bergey)

主編。1957年第七版后，吸收了國際上細(xì)菌分類學(xué)家參加編寫，它的近代版本反映了出版年代細(xì)菌分類學(xué)的最新成果，因而逐漸確立了在國際上對細(xì)菌進(jìn)行全面分類的權(quán)威地位。四.微生物分類系統(tǒng)1.原核生物分類系統(tǒng)1984~1989年改為《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》，簡稱《系統(tǒng)手冊》(Bergey’sManualofSystematicBacteriology)（第一版，分四卷）第二版，分五卷（根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育資料，對分類單元進(jìn)行了相當(dāng)大的調(diào)整）第一卷：古生菌、藍(lán)細(xì)菌、光合細(xì)菌以及最早分支的細(xì)菌（2001）第二卷：變形桿菌（2005），分為三本：2A（Introductoryessays）;2B(TheGammaproteobacteria);2C(Otherclassesofproteobacteria)第三卷：硬壁菌門(Firmicutes)(2009)第四卷：TheBacteroidetes,Spirochaetes,Tenericutes,Acidobacteria,Fibrobacteres,Fusobacteria,Dictyoglomi,Gemmatimonadetes,,,,(2011)第五卷：放線菌門（Theactinobacteria）intwoparts(2012)伯杰氏手冊是目前進(jìn)行細(xì)菌分類、鑒定的最重要依據(jù)，其特點是描述非常詳細(xì)，包括對細(xì)菌各個屬種的特征及進(jìn)行鑒定所需做的實驗的具體方法。2.

菌物分類系統(tǒng)Ainsworth菌物系統(tǒng)（Ainsworth’ssystemoffungi）

第七版(1983年)

第八版(1995年)

影響力較大高溫產(chǎn)氫菌的分離篩選與鑒定應(yīng)用新能源厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的微生物高溫產(chǎn)氫菌的富集

高溫產(chǎn)氫菌的篩選產(chǎn)氫菌的分離高溫產(chǎn)氫菌的分離篩選可降解纖維素厭氧產(chǎn)氣氫菌的富集菌種來源：長白山溫泉。培養(yǎng)條件：用80%N2+20%CO2混合氣來提供厭氧環(huán)境，75℃、120rpm振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)基：DSMZ516(濾紙做碳源)高溫產(chǎn)氣菌的快速分離瓊脂糖濃度：1.2%碳源：1%的纖維二糖菌液稀釋倍數(shù)：105產(chǎn)氣菌的挑取：利用滅菌后的微量進(jìn)樣器將固體培養(yǎng)基中氣泡周圍的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中。20mL40mL60mL60℃靜置培養(yǎng)高溫產(chǎn)氫菌的純化Hungate滾管技術(shù)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基體積10mL，60℃靜置培養(yǎng)。瓊脂糖濃度：1.2%碳源：1%的纖維二糖菌液稀釋倍數(shù)：105培養(yǎng)四天后，挑取單克隆，轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，共得到三株菌。倒置小管實驗，篩選高溫產(chǎn)氫菌結(jié)果如上圖，圖中從左到右分別為：對照試驗（不接種），分離得到的菌種1,2,3從上述結(jié)果可以看到試管4的產(chǎn)氣量最高，命名為CBS-Z.1234多相分類學(xué)鑒定基因型分析形態(tài)學(xué)特征生理生化特征16SrRNA及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析脂肪酸成分分析形態(tài)學(xué)特征Scanningelectronmicroscopyat×10,000(A)andTransmissionelectronmicrographsofpositivelystainedcellsofstrainCBS-ZT(B).

1）CBS-Z革蘭氏染色呈陽性。2）透射電鏡觀察結(jié)果顯示CBS-Z細(xì)胞呈短桿狀，CBS-Z大小約2~3×0.5–0.7μm，沒有鞭毛。3）菌斑呈白色，圓形，凸起于培養(yǎng)基表面，邊緣光滑。AB生理生化特征碳源是否生長Acetate–Arabinogalactan+Avicel+Arabinose+Carboxymethylcellulose+Casein–Cellobiose+Filterpaper+Fructose+Galactose+Glucose+Lactose+Maltose+Pectin+Sorbitol+Starch+Sucrose+Trehalose+Xylan+Xylose+Yeastextract+CBS-Z碳源利用情況

抗生素敏感測定抗生素

生長情況（10ug/ml）生長情況（100ug/ml）新霉素－－四環(huán)素

+－氯霉素++紅霉素－－羧芐青霉素+－氨芐青霉素

+－硫酸鏈霉素++硫酸卡那霉素+－生長因子測定脂肪酸成分分析FattyacidscompositionofstrainCBS-Ziso-C17:0（54.78%）、iso-C14:0

3-OH(12.93%)和C16:0(9.63%)，占脂肪酸含量的77.34%。。占脂肪酸總含量的90%以上，與嗜熱菌中飽和脂肪酸所占比例高這一事實相符，能充分說明細(xì)胞壁的耐熱性機制，這一點也與CBS-Z的最適溫度較高相符。脂肪酸百分含量13:0ISO0.3314:0ISO3OH12.9314:00.5815:0ISO5.3916:0Nalcohol0.4116:0ISO2.5316:09.63SumInFeature44.2817:0ISO54.7817:0ANTEISO1.0717:0CYCLO0.5518:00.6719:0ISO0.4519:02.6120:4w6,9,12,15c1.10基因組DNA的提取和GC含量測定Tm值為68.5℃（G+C）mol%含量為36.08mol％ 參比菌株Caldicellulosiruptorbescii(=DSMZ6725T)基因組DNA的G+C含量測定值為38.3mol％，與文獻(xiàn)報道的36.7mol％相差1.6mol％，證明了本實驗所使用的儀器和方法的有效性。ThedenaturalizationcurveofCBS-ZgenomicDNA.T