高分辨率溶解曲線

高分辨率溶解曲線第1頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第2頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四內(nèi)容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）高分辨熔解曲線在遺傳育種中的應(yīng)用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內(nèi)標(biāo)法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標(biāo)記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測(cè)甲基化HRM儀器第3頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第4頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四HighResolutionDNAMelting（HRM)是基于有序列變化的Amplicon之間微弱的Tm值差異，通過DNA片段熔解曲線的差異進(jìn)行突變檢測(cè)，比如：第5頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PCRTube1Tube2Tube3WildtypeHomozygoteHeterozygoteLightScanner突變檢測(cè)原理第6頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Lightscanner高分辨溶解曲線結(jié)果第7頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四SaturatingdyeLCGreenplus——高分辨溶解曲線專用熒光染料第8頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四內(nèi)容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內(nèi)標(biāo)法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標(biāo)記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測(cè)甲基化HRM儀器第9頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四MutationScanning未知SNP掃描第10頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四M.H.Ye等對(duì)北京油雞CAPN1基因外顯子進(jìn)行掃描，篩查其潛在SNPs。第11頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四BernhardJ.HoWnger·Hai-ChunJing·KimE.Hammond-Kosack·KostyaKanyuka(BarleyApplication)TheorApplGenet(2009)119:851–865DOI10.1007/s00122-009-1094-2數(shù)據(jù)來(lái)自英國(guó)洛桑農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站Bernhard等對(duì)Barley的eukaryotictranslationinitiationfactor4E(eIF4E)gene基因外顯子進(jìn)行突變掃描結(jié)果第12頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第13頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四內(nèi)容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內(nèi)標(biāo)法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標(biāo)記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測(cè)甲基化HRM儀器第14頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四SmallAmpliconGenotyping擴(kuò)增小片段直接進(jìn)行基因型鑒定第15頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四使用已知Tm值的雙鏈DNA做溫度內(nèi)標(biāo)，低溫內(nèi)標(biāo)Tm(~61℃),高溫內(nèi)標(biāo)Tm(~92℃)內(nèi)標(biāo)能夠?qū)崿F(xiàn)96/384孔板的溫度均一矯正。PCR片段的Tm值范圍：70-88℃優(yōu)點(diǎn)：不需要探針，直接利用PCR產(chǎn)物針對(duì)已知突變位點(diǎn)進(jìn)行基因分型第16頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第17頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第18頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第19頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四為何要使用溫度內(nèi)標(biāo)第20頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四A>TSNPwithoutCalibration–72bp第21頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ApplyTemperatureCalibration第22頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四A>TSNPwithCalibration第23頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四SmallAmpliconGenotypingM.H.Ye等對(duì)北京油雞A-FABP基因進(jìn)行小片段法基因分型，擴(kuò)增片段為56bp，灰色曲線顯示的是雜合型（CT），藍(lán)顏色和紅顏色曲線分別代表純合型CC和TT。第24頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四內(nèi)容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內(nèi)標(biāo)法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標(biāo)記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測(cè)甲基化HRM儀器第25頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四HRM–Lunaprobegenotyping第26頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四HRM–Lunaprobegenotyping第27頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1Probe–1SNP,AllPossibleSNPs第28頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1Probe–1SNP,AllPossibleSNPsClass1C:T,G:AClass2C:A,G:TClass3C:GClass4A:T第29頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1Probe,2SNPs,1Amplicon第30頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2Probes,2SNPs,1Amplicon-ApoE第31頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2Probes,2SNPs,2Amplicons-HFE第32頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四AmpliconScanning–發(fā)現(xiàn)新的突變第33頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DavidDe，YongSongatel.Applicationoghigh-resolutionDNAmeltingforgenotypingandvariantscanningofdiploidandautotetraploidpotatoMolBreeding(2010)25:67–90rrRRRrMixRr:rrby1:1RrrrMixRR:Rrby1:1RRRr第34頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四內(nèi)容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內(nèi)標(biāo)法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標(biāo)記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測(cè)甲基化HRM儀器第35頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四RosarioMuleo（2009）等用HRM方法對(duì)三個(gè)品種的SSRDCA4進(jìn)行分析，DCA4的等位基因有131bp的重復(fù)序列，雜合等位基因的序列為131-133bp，分析結(jié)果如圖8所示，HRM曲線可以將純合樣品和雜合樣品明顯的區(qū)分，其中一個(gè)等位基因只相差2bp。

三種顏色（淺灰，深灰、黑色）表明3種不同的品種。

RosarioMuleo等得出結(jié)論：HRM是一種快速、重復(fù)性高、成本低，操作簡(jiǎn)單，且可以應(yīng)用于其他物種的SNP檢測(cè)及SSR基因分型的方法。RosarioMuleo,MarirChiaraColao,DarioMianoatel.2009Genome52:252-260第36頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四內(nèi)容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內(nèi)標(biāo)法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標(biāo)記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測(cè)甲基化HRM儀器第37頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第38頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第39頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第40頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四內(nèi)容提示高分辨熔解曲線（HighResolutionMelting）的定義高分辨熔解曲線在蠶的遺傳育種中的應(yīng)用

—篩查突變（mutationscanning）

—基因分型（MutationGenotyping）

—小片段+內(nèi)標(biāo)法（SmallAmpliconGenotyping）

—非標(biāo)記探針法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）

—SSR分析

—檢測(cè)甲基化HRM儀器第41頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2005LightScanner96/38496/384孔板~8分鐘/板~2-6秒/樣品溫度均一性：

0.15oC數(shù)據(jù)采集速度：大于100pts/秒升溫速度：0.1oC/秒2010LS3232樣品轉(zhuǎn)盤,玻璃毛細(xì)管HRM檢測(cè)60分鐘內(nèi)完成定量PCR和HRM檢測(cè)HRM檢測(cè)升溫速度可以在0.05～0.90oC/秒之間調(diào)節(jié)在升溫速度小于≤0.3℃/秒時(shí)，溫度均一性：±0.05oC

數(shù)據(jù)采集速度：20pts/秒～400pts/秒（與升溫速度有關(guān)）0.3oC/秒升溫速度=67pts/℃0.05oC/秒升溫速度=400pts/℃第42頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四LightScanner高分辨溶解曲線應(yīng)用LunaProbes非標(biāo)記探針基因分型未知SNP掃描SmallAmplicon小片段基因分型第43頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四HRM分析流程在PCR反應(yīng)前加入LCGreen熒光染料時(shí)間大約2小時(shí)（包含試劑準(zhǔn)備）在LightScanner上進(jìn)行高分辨溶解曲線分析大約需要5-10分鐘數(shù)據(jù)分析和處理大約需要5-10分鐘

PCR產(chǎn)物可以直接進(jìn)行下游的測(cè)序分析等（如需要）大約需要30-60分鐘第44頁(yè)，共46頁(yè)，2023年，2月20日，星期四LightScanner適于SNP分析速度、通量—