高效液相色譜法測(cè)定甲硝唑的含量

高效液相色譜法測(cè)定甲硝唑的含量第1頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目一高效液相色譜法測(cè)定甲硝唑的含量二氨茶堿加樣回收率實(shí)驗(yàn)三氨茶堿溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)四紫外分光光度計(jì)法測(cè)定氨茶堿含量五氨茶堿原料藥穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)六五味子散劑的制備七SOD的含量測(cè)定八蘆丁的提取和鑒別第2頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)要求1．課前認(rèn)真預(yù)習(xí)，明確本次實(shí)驗(yàn)的目的、要求、內(nèi)容、方法及步驟2．提前5-10min進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，檢查實(shí)驗(yàn)所需物品是否齊全，做好實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作。3．實(shí)驗(yàn)時(shí)嚴(yán)肅認(rèn)真，根據(jù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)要求進(jìn)行操作，仔細(xì)觀察和記錄，并進(jìn)行獨(dú)立思考，按時(shí)完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)報(bào)告。4．保持實(shí)驗(yàn)室安靜，實(shí)驗(yàn)時(shí)不得隨意走動(dòng)和談笑。室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙、不允許在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)接聽手機(jī).第3頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四5．保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，書包、衣帽等應(yīng)放在指定位置，不能置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上；一切實(shí)驗(yàn)用具用完后擦洗干凈，放回原處。6．愛護(hù)實(shí)驗(yàn)室一切儀器設(shè)備，珍惜藥品及一切消耗用品(如紗布、拭鏡紙、載玻片等)，節(jié)約水、電。按操作規(guī)程使用顯微鏡、解剖鏡等，使用前要檢查，使用后要擦拭整理，如發(fā)現(xiàn)損壞或故障應(yīng)及時(shí)報(bào)告指導(dǎo)教師。7．實(shí)驗(yàn)完畢后，值日生值日。值日工作范圍包括：關(guān)閉水、電、門、窗；檢查儀器，顯微鏡是否完好；查看水池，實(shí)驗(yàn)臺(tái)，桌椅，地面是否干凈整齊；最后在值日生記錄本上登記值日情況，再交于老師簽字后方可離開。第4頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四考核辦法實(shí)驗(yàn)習(xí)慣10％：遲到1次扣1分，曠課一次扣3分，值日生必須最后走，早走者扣1分。預(yù)習(xí)報(bào)告10%：不能簡(jiǎn)單抄書，要學(xué)會(huì)總結(jié)歸納。實(shí)驗(yàn)報(bào)告20％：當(dāng)堂繪圖，當(dāng)堂交報(bào)告，遲交報(bào)告者要扣分。實(shí)驗(yàn)操作30%：要能獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須交老師檢查；出現(xiàn)重大失誤者要扣分實(shí)驗(yàn)考試成績(jī)30％：操作10%，筆試20%遲到、早退、缺一次實(shí)驗(yàn)以上者或考試不及格者均不能得優(yōu)秀，缺兩次實(shí)驗(yàn)的不能得良好，缺該課程1/3以上者或不參加實(shí)驗(yàn)考試者，均沒有實(shí)驗(yàn)成績(jī)。第5頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫格式：（1）實(shí)驗(yàn)名稱（2）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟（4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果第6頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)一高效液相色譜法測(cè)定

甲硝唑的含量第7頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四高效液相色譜儀的主要結(jié)構(gòu)及功能簡(jiǎn)介1.高壓輸液泵2.進(jìn)樣器3.高效分離柱4.液相色譜檢測(cè)器5.記錄儀第8頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。注意排氣泡：purge流速設(shè)置第9頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四（2）進(jìn)樣器樣品液吸取方法：上下反復(fù)抽取液體，速度稍快，直到肉眼看不見氣泡為止，水平持進(jìn)樣針（液體吸取數(shù)量可多余20μL），注入進(jìn)樣器。進(jìn)樣器存在的兩個(gè)位置：load（右上）和inject。第10頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四(2)高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，C18柱標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)徑及柱長(zhǎng)為4.6*150mm或4.6*250mm，填料顆粒粒度5μm。

色譜柱pH值范圍不同：酸性柱、堿性柱、中性柱。安裝方向柱溫箱：保持溫度穩(wěn)定。第11頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四(3)液相色譜檢測(cè)器a.紫外檢測(cè)器

b.光電二極管陣列檢測(cè)器c.示差折光檢測(cè)器d.熒光檢測(cè)器e.電導(dǎo)檢測(cè)器第12頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四

紫外檢測(cè)器

紫外檢測(cè)器對(duì)占物質(zhì)總數(shù)約80%的物質(zhì)（有機(jī)和部分無機(jī)物質(zhì)）均可檢測(cè)，既可測(cè)190--350nm范圍的光吸收變化，也可向可見光范圍350---700nm延伸。優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用最廣，靈敏度高，線性范圍寬。是高效液相色譜儀的標(biāo)準(zhǔn)配置。它的最重要特征是對(duì)流動(dòng)相的流速（脈沖）和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫。缺點(diǎn)：對(duì)無紫外吸收的組分不響應(yīng)，而對(duì)紫外吸收較大的溶劑如苯不能作流動(dòng)相使用。

第13頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四高效液相色譜的主要分離方法液相色譜根據(jù)固定相性質(zhì)可分為以下幾種：●吸附色譜(AdsorptionChromatography)●鍵合相色譜（Bondedphasechromatography）●離子交換色譜（IonExchangerChromatogr.）●空間排阻色譜（SizeExclusionChromatogr.）●親合色譜（AffinityChromatography）第14頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四在以上五種分離方式中，反相鍵合相色譜應(yīng)用最廣，因?yàn)樗捎么肌螂妗w系作流動(dòng)相。純水易得廉價(jià)，它的紫外吸收極小。在純水中添加各種物質(zhì)可改變流動(dòng)相選擇性。使用最廣的反相鍵合相是十八烷基鍵合相，即讓十八烷基（C18H37—）鍵合到硅膠表面。這種鍵合相又稱ODS（Octadecylsilyl）鍵合相，如國(guó)外的partisil5-ODS、Zorbax-ODS、Shim-packCLC-ODS，國(guó)產(chǎn)的YWG-C18等。第15頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜じ咝б合嗌V儀主要結(jié)構(gòu)組成及功能；

了解反相色譜法的原理、優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用。了解流動(dòng)相的選擇依據(jù)及配制方法；

掌握高效液相色譜法進(jìn)行定性和定量分析的基本方法。第16頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)原理高效液相色譜法是采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)以甲硝唑?yàn)闇y(cè)定對(duì)象，以反相HPLC來分離檢測(cè)未知樣中甲硝唑的含量。以甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的色譜峰面積對(duì)其濃度進(jìn)行線性回歸，再根據(jù)樣品中甲硝唑的峰面積，由線性方程計(jì)算其濃度。第17頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)器材與材料實(shí)驗(yàn)器材：高效液相色譜儀、精密天平、50ml燒杯、玻璃棒、稱量紙、10ml容量瓶、50ml容量瓶、注射器、洗瓶、EP管、濾膜。實(shí)驗(yàn)材料：甲硝唑原料、蒸餾水、HCl、乙腈、三氟乙酸、超純水。

0.1MHCl溶液配制：準(zhǔn)確量取HCl溶液8.3ml,用蒸餾水定容至1000ml，即得。第18頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四實(shí)驗(yàn)步驟色譜操作條件;

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制；標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立；樣品溶液的配制；甲硝唑樣品含量測(cè)定。

第19頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四色譜柱：C18柱（150×4.6mm,5μm）；流動(dòng)相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80）流速：1mL/min檢測(cè)波長(zhǎng)：277nm柱溫：35℃進(jìn)樣量：20μL1.色譜操作條件：第20頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四2.標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取在105℃條件下干燥至恒重的甲硝唑?qū)φ掌?0mg，置于50mL容量瓶中，用0.1MHCl溶液溶解并定容至刻度，即得濃度為0.2mg/mL的甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，備用。第21頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精密量取甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別為0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml、1.1ml置于10ml的容量瓶中，然后用0.1MHCl溶液定容至刻度，得到濃度梯度為6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別過0.22μm的微孔濾膜過濾，濾液置于1.5ml的EP管中并標(biāo)號(hào)，各進(jìn)樣20μL檢測(cè)，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。第22頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四線性要求：色譜峰分離度大于1.5，濃度點(diǎn)n＝5。用濃度c對(duì)峰面積A作線性回歸處理，得一直線方程，r應(yīng)大于0.999，方程的截距應(yīng)近于零。第23頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四4.樣品溶液的配制精密稱取甲硝唑原料藥10mg，置于50ml容量瓶中，用0.1MHCl溶液溶解并定容至刻度，搖勻，再?gòu)闹腥〕?.7ml定容至10ml，即得甲硝唑樣品溶液。第24頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四5.甲硝唑樣品含量測(cè)定