臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范

關(guān)于臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)操作規(guī)范第1頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置及其各室的功能二、各階段操作要求三、PCR污染與對策四、因操作欠規(guī)范導(dǎo)致的問題分析第2頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的

規(guī)范化設(shè)置及其各室的功能規(guī)范化設(shè)置：要求參照《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號文）附件《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》。第3頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有

專用的儀器設(shè)備。2.明確的標(biāo)記，如加樣器或試劑等。3.單一方向順序，從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)（簡稱擴(kuò)增區(qū)）至產(chǎn)物分析區(qū)。4.使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服。5.實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。6.各自的清潔用具。第4頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

各室功能：第5頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

功能：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。第6頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。戴手套。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。實(shí)驗(yàn)臺表面，使用可移動紫外燈（254nm波長）照射，一般照射過夜。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。第7頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）標(biāo)本制備區(qū)

功能：臨床標(biāo)本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。第8頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

要正確使用加樣器。正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒容器內(nèi)。用于RNA擴(kuò)增檢測的樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cDNA合成。

第9頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）擴(kuò)增區(qū)

功能：DNA或cDNA擴(kuò)增。第10頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

已制備的DNA模板和合成的cDNA的加入和主反應(yīng)混合液制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測定中，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行?？山档捅緟^(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。如有加樣則應(yīng)在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒。第11頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

功能：擴(kuò)增片段的測定。第12頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

膜上微孔板上探針雜交方法、Southern轉(zhuǎn)移、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、核酸測序方法等。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源。溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物質(zhì)，注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。

負(fù)壓條件。第13頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月二、各階段操作要求

測定分析前的標(biāo)本采集處理、測定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報告等。第14頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）標(biāo)本的采集

臨床標(biāo)本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。

EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq酶的強(qiáng)抑制劑。

玻璃器皿在使用前應(yīng)高壓處理，250°烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。

臨床用于RNA（如HCVRNA）擴(kuò)增檢測的血標(biāo)本應(yīng)盡快（3小時以內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解。第15頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）標(biāo)本的穩(wěn)定化處理DNA：不需特殊穩(wěn)定化處理。RNA：異硫氰酸胍鹽（GITC）可使DNA酶和RNA酶失活。第16頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）標(biāo)本的運(yùn)送

可在常溫下通過郵寄運(yùn)送，如用于DNA擴(kuò)增檢測的EDTA抗凝全血及用于RNA擴(kuò)增檢測的GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。

第17頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）標(biāo)本的貯存1.血清/血漿等—-70℃2.用于DNA測定的已純化核酸樣本—4℃3.用于RNA測定的已純化核酸樣本—-80℃4.用乙醇沉淀的核酸樣本—-20℃5.GITC處理的RNA標(biāo)本在室溫可保存7天

第18頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）標(biāo)本的處理（核酸提取）

抑制物可能來源于：標(biāo)本本身（如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物）。核酸提取過程中殘留的有機(jī)溶劑（如酚、氯仿等）。

痰須液化處理。

第19頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月操作時（加裂解液后充分混勻，沸水?。┳⒁猓孩匐x心管不能插得過低，以防進(jìn)水；②水浴時不能加蓋，防管蓋爆開；③水浴時間須準(zhǔn)確，10±1min；④水浴時不能走開；⑤左右手分開，左手只接觸樣本，右手只接觸加樣器及操作儀器。第20頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（六）靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和擴(kuò)增

有多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測假陰性結(jié)果，如擴(kuò)增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg++濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要。第21頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月RT-PCR操作注意：①標(biāo)本必須新鮮；②做RNA標(biāo)本的槍頭離心管必須無菌；③冰上操作；④處理完后須立即上機(jī)，不能放置；⑤注意左右手分開。第22頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（七）擴(kuò)增產(chǎn)物的分析擴(kuò)增產(chǎn)物的測定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等。第23頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)時熒光定量PCR在熒光定量PCR基礎(chǔ)上實(shí)時監(jiān)測PCR全過程，最后通過曲線進(jìn)行定量分析。與一般熒光定量PCR使用熒光強(qiáng)度定量不同，實(shí)時熒光PCR一般使用Ct（每個反應(yīng)熒光信號達(dá)到設(shè)定域值所經(jīng)的循環(huán)數(shù)）定量，Ct與模板初始拷貝數(shù)的對數(shù)成線性關(guān)系。實(shí)時熒光PCR的優(yōu)點(diǎn)：精密度高，重復(fù)性能好。第24頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月TaqMan熒光定量PCR原理

探針兩端分別用熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)標(biāo)記，因?yàn)榫嚯x相近，基團(tuán)相互作用，不產(chǎn)生熒光；探針與模板雜交在引物區(qū)間內(nèi)，當(dāng)擴(kuò)增進(jìn)行時，TaqDNA聚合酶的5’-3’外切酶活性降解探針，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開，受激產(chǎn)生熒光信號；熒光信號強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比；第25頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月第26頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月第27頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月三、PCR污染與對策PCR污染分環(huán)境污染與反應(yīng)液污染二種。常見PCR污染源有三個：第一、標(biāo)本間的交叉污染；第二、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染；第三、PCR產(chǎn)物的污染（Carryover）。第28頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月要防止PCR污染，必須做好以下3個環(huán)節(jié)的工作：（一）污染的預(yù)防（二）污染源的追蹤（三）污染源的處理第29頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）污染的預(yù)防操作PCR時，按照下述規(guī)則可有效地預(yù)防PCR的污染。1、PCR的前處理及后處理要在不同的隔離工作臺上或房間內(nèi)進(jìn)行。2、分裝試劑，標(biāo)記批號第30頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月3、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作：

(1)帶一次性手套；(2)避免反應(yīng)液的飛濺；(3)用一次性移液器或吸頭，吸頭不要暴露于空氣，以免產(chǎn)物氣溶膠污染；(4)操作多份樣品時，要先將可混勻的成分(dNTPs，緩沖液，引物等)一起制備標(biāo)準(zhǔn)混合液(Mastermix)；(5)制備反應(yīng)混合液時，最后加入樣品DNA，加入DNA后，在進(jìn)行下一步操作前要蓋緊反應(yīng)管。4、檢查結(jié)果的可重復(fù)性。第31頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）污染源的追蹤第32頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月1、陽、陰性對照

選擇陽性對照時，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣品。

陰性對照的選擇一定要小心。

不含模板DNA的PCR試劑對照。第33頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月2、常見的環(huán)境污染源有(1)點(diǎn)雜交的點(diǎn)樣器；(2)切片機(jī)；(3)離心機(jī)；(4)切膠用刀或微解剖刀；(5)濃縮用具，真空瓶；(6)電泳裝置和紫外燈箱；(7)干冰/乙醇或水溶鍋；(8)冰箱門把手、冷凍架和門把手。第34頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月追蹤可疑的環(huán)境污染源①用去離子浸濕的滅菌棉簽擦試可疑部分②在0.1ml去離子水中浸泡；③取5μl作PCR反應(yīng)；④電泳檢查結(jié)果。第35頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）污染源的處理第36頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月1.環(huán)境污染處理法（1）稀酸處理法。對擦試實(shí)驗(yàn)陽性部位或器件可用1mol/LHCl擦洗或浸泡殘留DNA。（2）紫外法：UV照射波長一般選擇254/300nm，需考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布。UV對長片段（500bp以上）有效，而對短片段效果不大。第37頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月2.反應(yīng)液的污染處理法(1)DNaseI法：PCR混合液（不加模板和Taq酶）中加入0.5UDNaseI，室溫下作用30min后，加熱滅活，加入模板和Taq酶后即可進(jìn)行正常PCR。

優(yōu)點(diǎn)：便宜，不需知道擴(kuò)增DNA序列。第38頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)內(nèi)切酶法：選擇識別四個堿基的內(nèi)切酶（如MspI等），最好幾種合用，可克服其識別序列特異的缺陷。方法同上，只是DnaseI由內(nèi)切酶（MspI10U）代替，作用時間延長到1.0～1.5h。(3)紫外照射法：反應(yīng)中不加模板與Taq酶。第39頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月(4)尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法：dUTP代替反應(yīng)中的dTTP，使產(chǎn)物中含大量dU，UNG可去除dU，使失去dU的位置，阻止Taq酶的延伸。PCR正常循環(huán)前，用UNG處理PCR反應(yīng)混合液可消除PCR產(chǎn)物的污染，而UNG在正常PCR循環(huán)變性一步就會失活，所以，對含dU的新合成PCR產(chǎn)物沒有影響。第40頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

TATATATATA

PCRAUAUAU

UNGAAA

加熱

AAA

×

PCR第41頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月該法優(yōu)點(diǎn)：①去除任河來源（包括引物在內(nèi)）的污染；②由于污染的產(chǎn)物有大量dU存在，因此，UNG處理會徹底消除污染。③UNG處理與PCR擴(kuò)增可在同一試管內(nèi)進(jìn)行。第42頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月四、因操作欠規(guī)范導(dǎo)致的問題分析第43頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備1、設(shè)備不齊全、不配套，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，引起假性結(jié)果。

旋渦混合器，微量加樣器，正規(guī)的紫外透射儀。RNAPCR樣品處理時，血清（或血漿）中加入強(qiáng)烈變性劑后，血樣中的蛋白變性、結(jié)塊。吸頭與微量加樣器不配套。2、PCR熱循環(huán)儀的差異或質(zhì)量問題。第44頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月移液器：①嚴(yán)禁大力來回擰動；②嚴(yán)禁調(diào)至容量之外使用；③第二檔為排空檔，不得作吸取之用；④吸頭應(yīng)浸入液面2—3mm處吸??；⑤嚴(yán)禁將有液體的移液器平放或倒置；⑥混勻沉淀時，將吸頭緊貼于沉淀上方管壁，反復(fù)吸取液體，將沉淀反復(fù)混勻，溶解；⑦每周用75%乙醇清洗一次，若有污染隨時清洗。第45頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月離心機(jī)：①離心前，離心管須配平；②將調(diào)速檔打至0檔位，才能打開電源開關(guān)，逐漸升高轉(zhuǎn)速，直至即定轉(zhuǎn)速；③定時旋鈕不能強(qiáng)行歸零；④轉(zhuǎn)頭未停止時，嚴(yán)禁打開蓋板。第46頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）實(shí)驗(yàn)室布局不合理引起的污染問題1、樣品處理不進(jìn)行隔離，樣品中各種核酸片段均會通過空氣進(jìn)行傳播。2、PCR結(jié)果檢測實(shí)驗(yàn)室和其它實(shí)驗(yàn)室在一起，會出現(xiàn)嚴(yán)重的擴(kuò)增子污染。3、儀器設(shè)備及工作服等（尤其是加樣器）公用，也會造成嚴(yán)重污染。4、實(shí)驗(yàn)室操作垃圾（吸頭、離心管、樣品杯等）亂放，飄散在空氣中的核酸片段、病原微生物可造成實(shí)驗(yàn)室污染。

第47頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）PCR操作中存在問題分析1.陽性變陰性2.陰性變陽性3.PCR結(jié)果不穩(wěn)定第48頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月1.陽性變陰性

(1)有些陽性病人，經(jīng)過PCR檢測后為陰性，可能有兩種情況：一是采集標(biāo)本方法或部位不正確，二是如果病人取樣部位病原體消失，需根據(jù)病人的病理情況采樣。第49頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)標(biāo)本保存不當(dāng)，可引起PCR失敗。收集的標(biāo)本亂放（未放冰箱），病原體的破裂，檢測的核酸降解，失去了PCR檢測的模板或造成標(biāo)本污染。第50頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月2.陰性變陽性

常見的原因有以下6點(diǎn)：

第51頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月①加入試劑或樣品時引起的交叉污染

（最好在加完所有其他反應(yīng)成分，包括防止蒸發(fā)用的礦物油后才吸加模板DNA，將模板加入微量離心管后，蓋好離心管并用戴有手套的手指輕輕單擊管側(cè)壁，以搖勻液體，再作瞬時離心[10秒]，使水相和有機(jī)相分開）。第52頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月②加樣器通道易形成氣溶膠，造成加樣器通道污染，可通過使用有濾篩的吸頭避免污染

（將模板DNA加入PCR系統(tǒng)時，注意切勿形成噴霧，后者有可能污染別的反應(yīng)，所有并非即用管都應(yīng)蓋嚴(yán)）。

第53頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月③打開標(biāo)本管蓋引起樣品飛濺

（打開前須瞬間離心）④操作時手套引起的交叉污染

（拿過模板DNA管后應(yīng)更換手套）第54頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月⑤不明原因引起公用試劑如液體石蠟等污染

（必須設(shè)置一個不含模板DNA但含PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對照反應(yīng)。這一對照管須在準(zhǔn)備好所有其他PCR以后才進(jìn)行吸加）。⑥實(shí)驗(yàn)室污染

第55頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月3.PCR檢測結(jié)果不穩(wěn)定（1）樣品處理方法不當(dāng)，標(biāo)本中雜質(zhì)很多，血清標(biāo)本有蛋白質(zhì)、血紅素、代謝產(chǎn)物等。蛋白質(zhì)——DNA電泳帶拖尾血紅素中的卟啉化合物——抑制Taq酶活性代謝產(chǎn)物——干擾引物配對

第56頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）操作不當(dāng)帶來的后果

主要指不能嚴(yán)格按照說明進(jìn)行操作造成PCR檢測失敗。如HCVRNAPCR樣品處理試劑A、B、C和75%乙醇的操作過程。

第57頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月50μl血清標(biāo)本

(標(biāo)本可用血清或血漿，盡量避免使用肝素做抗凝劑，避免反復(fù)凍融)

加200μl試劑A后立即混勻

(試劑A是強(qiáng)烈的變性劑，不僅要將病毒