微生物與免疫學(xué)04-實驗四-酶聯(lián)免疫吸附實驗-ELISA公開課課件

實驗五酶聯(lián)免疫吸附實驗免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效催化作用有機結(jié)合的一種方法。它以酶作為標記物，與抗體（或抗原）聯(lián)結(jié)，與相應(yīng)的抗原（或抗體）作用后，通過底物的顏色反應(yīng)作抗原抗體的定性和定量，亦可用于組織中抗原或抗體的定位研究，即酶免疫組織化學(xué)技術(shù)。目前應(yīng)用最多的免疫酶技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）。ELISA簡介1971年瑞典學(xué)者Engvall和Perlmann，荷蘭學(xué)者VanWeeman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）ELISA基本的實驗過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色ELISA檢測抗原

Ag+ Ab*Ag-Ab*由于結(jié)合在抗原—抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細胞抗原上每個分子結(jié)合3～5個分子抗體，當此抗體作為抗原時又可結(jié)合3—5分子的熒光抗體，所以和直接法相比熒光亮度可增強3或4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標記顯示，這是現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。間接法比直接法靈敏酶標板酶標儀一、ELISA法間接法檢測血清中HBsAb【實驗?zāi)康摹?．熟悉ELISA的原理。2．了解免疫標記技術(shù)的原理?！緦嶒炘怼?/p>

采用純化HBsAg包被反應(yīng)板，加入待測標本，同時加入HBsAg-HRP。當標本中存在HBsAb時，就會形成HBsAg-HBsAb-HBsAg-HRP復(fù)合物，加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之就無顯色反應(yīng)。將抗原HBsAg吸附于載體表面（廠家已經(jīng)完成）將待測血清加入，溫育，血清中如有HBsAb，則抗原抗體結(jié)合加入酶復(fù)合物，(HBsAg-HRP),酶復(fù)合物與表面抗體結(jié)合加入酶的底物，酶與底物反應(yīng)，顯色二、ELISA間接法檢測血清中HBsAg原理同檢測抗體,但小孔底部包被的為HBsAb酶復(fù)合物為:HBsAb-HRP當標本中存在HBsAg時，就會形成HBsAb-HBsAg-HBsAb-HRP復(fù)合物，加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之就無顯色反應(yīng)?！緦嶒灢牧稀?．乙肝病毒HBsAg（或HBsAb）酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。

預(yù)包被微孔條（用純化的單抗-HBs或純化HBsAg包被）酶結(jié)合物（多克隆抗-HBs-HRP或HBsAg-HRP）陽性對照陰性對照洗滌液(濃縮液，用前以蒸餾水稀釋25倍)顯色劑A、B（一般為四甲基聯(lián)苯胺和H2O2）終止液（2mol/LH2SO4）。2．微量加樣器，吸水紙等。①檢測HBsAg或HBsAb的反應(yīng)條②酶標抗體③陰性對照血清④陽性對照血清⑤洗滌液⑥顯色液(A,B)ELISA試劑盒包含以下各組分：待測血清1號、2號、3號、4號注意：待測血清是從醫(yī)院采集的正常血清(人為加進去乙肝表面抗原或者抗體)，但是并不表示血清中不含有可傳染的疾病，所以實驗中要注意安全。實驗步驟每4人一組，每組有檢測HBsAg和檢測HBsAb的反應(yīng)條各一條,每條含6個反應(yīng)孔。每組有2種試劑盒(黃色測HBsAg,粉紅色測HBsAb),黃色試劑盒用黃色反應(yīng)條,粉紅色試劑盒用紅色反應(yīng)條。3、檢測方法每孔加待檢血清50ul,每次實驗各做1個陰性對照和陽性對照;本實驗空白對照孔不設(shè)，前面講臺上有空白的反應(yīng)條，可以作為空白對照。注意：每位同學(xué)選擇一種待測血清進行檢測（見下圖）。陰性陽性待檢血清甲,乙,丙………….對照對照1號同學(xué)取待測血清1號…………..陰性陽性待檢血清甲,乙,丙………….對照對照1號同學(xué)取待測血清1號2號同學(xué)取待測血清2號…………..2號同學(xué)取待測血清2號(2)每孔加1滴酶結(jié)合物,充分混勻，37℃孵育30min(3)甩棄孔內(nèi)液體（在水池中甩棄，不要在實驗室中隨地甩棄）；(4)每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩干。同上洗滌重復(fù)5次，拍干。(6)每孔加顯色液A,B各1滴,充分混勻，置37℃15min.按以下方法,進行肉眼觀察結(jié)果:

陰性對照孔無色,陽性對照孔藍色;

待測孔顯藍色,為陽性,否則為陰性。(7)加終止液（本實驗不加終止液）4結(jié)果記錄及結(jié)論陰性對照孔陽性對照孔空白對照孔待測1待測2結(jié)果結(jié)論待測3待測4HBV屬于嗜肝DNA病毒科，是乙型肝炎的病原體。在中國，HBV感染或攜帶者已超過1.3億，發(fā)病人數(shù)超過3000萬人。HBV基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，其中有一個單鏈區(qū)。HBV的抗原組成由表面抗原（HBsAg）、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)組成。三種抗原具有其相應(yīng)抗體：HBsAb（抗表面抗原抗體）、HBeAb（抗e抗原抗體）、HBcAb（抗核心抗原抗體）。HBsAg為二聚體糖蛋白，大量存在于感染者血液中，為HBV感染的主要標志；HBcAg存在于Dane顆粒核心結(jié)構(gòu)表面，為內(nèi)殼成分，其外被HBsAg覆蓋，不易在血循環(huán)中檢出，但能刺激機體產(chǎn)生抗-HBc，抗-HBcIgM的存在提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)；HBeAg游離于血中，其消長與病毒體消長及DNA多聚酶消長基本一致，故HBeAg為HBV復(fù)制及具有強感染性的一個指標；HBeAg刺激機體產(chǎn)生的抗-HBe能與受染肝細胞表面的HBeAg結(jié)合，通過補體介導(dǎo)破壞受染肝細胞，抗-HBe的出現(xiàn)是預(yù)防后良好的象征。HBV的主要感染源是患者或無癥狀的HBsAg攜帶者，通過血液、體液、母嬰傳播。本實驗只檢測HBsAg及其抗體HBsAbHBsAg（本實驗測）HBeAg抗-HBs（本實驗測）抗-HBe抗-HBc結(jié)果分析+----HBV感染或無癥狀攜帶者++---急慢性乙肝或攜帶者++--+“大三陽”急慢性乙肝患者（傳染性強）+--++“小三陽”急慢性乙肝感染，趨向于恢復(fù)--+++既往感染恢復(fù)期----+既往感染或“窗口期”--+--既往感染或接種過疫苗乙肝兩對半檢測的結(jié)果判斷方法【注意事項】1．試劑盒應(yīng)于4℃存放，在有效期內(nèi)使用。2．微孔條須密封防潮，從冷藏環(huán)境中取出時,應(yīng)在室溫中平衡至潮氣盡干后方可開封啟用，余者及時封存。3．滴加試劑前應(yīng)將瓶搖勻，使液體混勻。滴加時瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準確，注意勿將試劑滴在孔壁上。4．洗滌時各孔均須加滿，防止孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈。5．待測標本不可用NaN3防腐。所有樣品都應(yīng)按傳染源處理。觀看實驗錄像臨床ELISA測定中可能會出現(xiàn)的問題及可能的原因

（非試劑盒本身的原因）

1．弱陽性樣本檢測不出

溫育的時間或溫度不夠；顯色反應(yīng)時間太短；所用配制緩沖液的蒸餾水有問題

2．測定的重復(fù)性差

（相同樣本兩次測定結(jié)果不一致）

這是典型的由測定操作引起的問題，包括

（1）加樣本及試劑量不準；孔間不一致；

（2）加樣過快，孔間發(fā)生污染；

（3）加錯樣本；

（4）加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區(qū)；

（5）不同批號試劑盒中組分混用；

（6）溫育時間、洗板、顯色時間不一致；

（7）孔內(nèi)污染雜物；

（8）酶標儀濾光片不正確；

（9）血清標本未完全凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細胞，易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)