血紅蛋白電泳的意義和判斷

ADULTANDNEWBORNHemoglobinscreeningwithcapillarys2021/10/101目的血紅蛋白結(jié)構(gòu)和功能的回顧SebiaCAPILLARYS2/Minicap血紅蛋白檢測說明血紅蛋白臨床結(jié)果說明2021/10/102血紅蛋白的結(jié)構(gòu)血紅蛋白分子是由4條多肽鏈(2對)和4個可以結(jié)合鐵和氧氣的血紅素.Normalhemoglobins,contain

alpha,beta,delta,andgammaglobinchains.2021/10/103三維結(jié)構(gòu)4亞單位

2alpha鏈2alphagenes3?

非

?alpha鏈:beta,delta,gamma1bgene,1dgene,2ggenes2021/10/104正常結(jié)果HbA:a2b2HbF:a2g2HbA2:a2d2

+-瓊脂糖凝膠Hydrasys?(Sebia)堿性緩沖液成人新生兒2021/10/105血紅蛋白遺傳病類型(HEMOGLOBINOPATHIES)?血紅蛋白疾病血紅蛋白性質(zhì)變化:血紅蛋白分子病結(jié)構(gòu)異常,一個或數(shù)個氨基酸變異或缺失,都將會導(dǎo)致血紅蛋白分子的電性發(fā)生改變常見血紅蛋白變異體b-globin:S–C–DPunjab–E…血紅蛋白含量變化:地中海貧血合成或合成調(diào)控異常:bglobinbThalassemiasaglobinaThalassemias合并型:血紅蛋白分子病Hemoglobinopathies/地貧Thalassemias2021/10/106血紅蛋白遺傳病遺傳性疾病基因?qū)W圖譜正常基因異?；?021/10/107異常血紅蛋白類型目前,已經(jīng)證實的有超過1000種以上的變異體(a,b,gandd)大部分變異體出現(xiàn)頻率較低,并且沒有明顯臨床癥狀4種主要變異體(HbS,HbC,HbEandHbDPunjab)出現(xiàn)頻率較高(特定人群)攜帶者會出現(xiàn)健康問題兒童可能在出生時即伴隨有嚴重癥狀2021/10/108血紅蛋白疾病的區(qū)域分布圖Thalassemias2021/10/109

常見與地中海區(qū)域:意大利,西班牙,希臘,近東地區(qū),非洲北部.

同樣常見于東南亞:泰國,印度,越南,中國,印尼.

臨床癥狀

*Beta地貧重癥型-嚴重貧血(需要長期輸血治療) *Beta地貧中間型 *Beta地貧輕微型-無臨床癥狀Beta地中海貧血

常見區(qū)域bo沒有Beta鏈合成b+

合成能力下降2021/10/1010Alpha地中海貧血

臨床癥狀:根據(jù)Alpha基因的表達狀態(tài),有4個不同程度的Alpha地貧癥狀 *1個基因表達沉默:靜止型(非常難檢測到,在出生會測到HbBart’s1-2%) *2個基因表達沉默:輕型alpha地貧,在出生會測到Bart’s2-10% *3個基因表達沉默:血紅蛋白HbH病,出生時出現(xiàn)2-30%Bart’s,兒童-成人出現(xiàn)10-15%HbH *4個基因表達沉默:HbBart’s胎兒水腫綜合征(死胎)常見區(qū)域

常見與遠東地區(qū),非洲和地中海區(qū)國家

2021/10/1011其他特征HbHHbA2HbF貧血小紅細胞靶細胞異常出生時少量的(~2%)HbBart’s0正常正常000一條鏈缺失出身時HbBart’s(~5%)0正?；驕p少正常0002條鏈缺失不穩(wěn)定血紅蛋白溶血性貧血(HbH)10-15%減少也許增加輕微的到嚴重的++3條鏈缺失胎兒水腫綜合癥(hydropsfetalis)00100%HbBart’s嚴重的--4條鏈缺失2021/10/1012基因型診斷血常規(guī)臨床癥狀檢測結(jié)果aa/aa無HbA

:NHbA2

:N(2-3.5%)-a/aaa-Thalassaemia

2雜合體(靜止型)輕微小紅細胞癥MCV

:75-80fLMCH:20-24無HbAandHbA2:NHbBart’s0-3%atbirthConfirmationbymolecularbiology-a/-aa-Thalassaemia

2純合體小紅細胞癥血紅蛋白減少Hb:11-12g/dL無明顯臨床癥狀HbAandHbA2:NHbBart’s2-8%atbirth--/aaa-Thalassaemia

1雜合體MCV:65-75

MCH:20-24需要分析序列分析或DNA序列分析

--/-aHbH小紅細胞癥血紅蛋白減少Hb:8-11g/dLMCV

:55-65MCH:20-24出現(xiàn)溶血

脾臟腫大HbA2NorHbBart’s<5%HbH10-20%--/--a-Thalassaemia

1純合體(死胎)嚴重貧血水腫胎Hb:8-11g/dLMCV100-110MCH無法存活死胎AbsenceofHbAandHbFHbBart’s80-100%HbPortland<5%2021/10/1013鐮刀型紅細胞血癥變異體出現(xiàn)在6GAG(谷氨酸)GTG(纈氨酸)NSSASabnormalgenenormalgeneNHbSNNHbSASNHbAHbSNNSSHbAHbSChromosomes16a2a1a2a1HomozygoteChromosomes11HétérozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGgChromosomes16a2a1a2a1HomozygoteChromosomes11HeterozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGg2021/10/1014C型血紅蛋白分子病

變異體位置:AA6:GAG(谷氨酸)AAG(Lys)HbAHeterozygoteACHbAHbCNHbASCCompoundheterozygotyHbAHbCNHbSHétérozygotecompositeACSCChromosomes16a2a1a2a1HomozygoteChromosomes11HétérozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGgChromosomes16a2a1a2a1SCheterozygotecompoundChromosomes11HeterozygotedbdbAgAgGgGgdbdbAgAgGgGg2021/10/1015D型血紅蛋白分子病常見區(qū)域:常見于印度.特點:變異體位置b121Glu(谷氨酸,負電荷)

→Gln(谷氨酰胺,不帶電荷)

(D-LosAngeles=D-Punjab)(6differentHbDaccordingtothepositionofthemutation)堿性緩沖液中:電荷下降

→M電泳速度變度變慢,靠近HbS臨床癥狀:基因雜合體:無癥狀(僅在電泳中發(fā)現(xiàn)D區(qū)帶)HbAfraction:65–70%HbDfraction:30–35%基因純合體:輕微貧血HbAfraction:absenceHbDfraction:100%2021/10/1016E型血紅蛋白分子病常見區(qū)域:常見與東南亞地區(qū).特點:變異位點b26Glu(谷氨酸,負電荷)

→Lys(賴氨酸,正電荷)堿性緩沖液:總體帶電荷下降→凝膠電泳中,出現(xiàn)在HbC附近臨床癥狀:雜合體:無癥狀HbAfraction:65–70%HbEfraction:30–35%基因純合體:輕微貧血HbAfraction:absenceHbEfraction:100%2021/10/1017下列情況下,需要進行血紅蛋白檢測

臨床和遺傳問題(產(chǎn)前診斷)

貧血,小紅細胞癥

新生兒篩查

對來自地貧高發(fā)區(qū)人口,進行篩查

…

對診斷有幫助的其他信息

患者臨床癥狀,年齡,籍貫和其他相關(guān)的背景 (輸血記錄)

血液全套檢測,網(wǎng)狀細胞級別和進行細胞形態(tài)鏡檢

Hb電泳(EDTA抗凝管)

離子平衡和溶血情況

2021/10/1018血紅蛋白檢測的幾種方法目前,血紅蛋白檢測步驟如下: -電泳法對Hb進行檢測

或者使用等電聚焦電泳法 -使用HPLC法進行確認.2021/10/1019凝膠電泳結(jié)果識別表

2021/10/1020在pH梯度的凝膠片上,根據(jù)蛋白不同的等電點,對蛋白進行分離Hb電泳位置取決于緩沖液PH值蛋白電泳至其等電點位置后,停止泳動AtpI=pH,Hbdoesnothaveanetchargeandstopsmigrating電泳分離效果好,但時間長.需要經(jīng)驗豐富才能獲得良好結(jié)果及進行結(jié)果判斷等電聚焦電泳法2021/10/1021介于普通電泳和等電聚焦電泳之間的新方法: -通過毛細管電泳法,即可以獲得與IEF方法一樣的分辨率,同時檢測結(jié)果量值HbA2/HbF同樣精確. -出現(xiàn)異常變異體后:

使用下列方法確認: *ITANOtest(solubilitytest) *HPLC液相色譜 *Genotyping基因篩查2021/10/1022Capillarys2Minicap全自動毛細管電泳法進行血紅蛋白檢測Capillarys2/Minicap2021/10/1023毛細管電泳法原理

Peltier溫控橋Anode+Cathode-檢測器氘光燈電泳高電壓2021/10/1024此時,電滲力(EOF)遠遠強于電場力.因此,蛋白被動從正極向負極端移動.正電極+EOF負電極-Electro

migration蛋白電泳DETECTIONINJECTION帶正電荷的緩沖液毛細管壁負離子鞘2021/10/1025Capillarys/Minicap血紅蛋白電泳血紅蛋白條帶,在電滲力的作用下,8分鐘即完成電泳過程,然后,在415nm紫外光下被檢測并顯示出來.正常質(zhì)控品必須在每天檢測前使用Capillarys:-檢測速度:40樣品/小時試管架1至7號位放置樣品,8號位放4ml溶血素Minicap:-檢測速度:10樣品/小時試管架1至26號位放置樣品,27號位放溶血素(8個樣品消耗5ml溶血素)2021/10/1026Capillarys/Minicap血紅蛋白檢測標本要求抗凝管采血(EDTA,heparin,citrate).如果需要對輸血患者采血,需要在輸血前采集血液.使用去除血漿后的紅細胞(隔夜或5000rpm,5分鐘離心后樣品)+4°C以上,標本最多存放7天.需要長期存放,可以洗滌紅細胞后,放置于-80°C(可存放至少3個月)2021/10/1027CapillarysMinicap血紅蛋白條帶識別表Capillarys/Minicap區(qū)帶識別表Z15:HbHZ14://Z13:Hb-JRovigo,HbN-Baltimore,J-KaoshiungZ12:HbBart’s,HbProvidence,HbJ-Mexico,HbJ-Baltimore….Z11:HbKaoshiung(NewYork),denaturatedHbAZ10:HbHope,HbM-IwateZ9:HbA,HbCamperdown,HbPhnomPenh……Z8:AcetylatedHbF,HbAltanta,HbAthens-GAZ7

:

HbF,denaturatedHbS,HbPorto-Allegre……..Z6:HbD-Punjab,HbPhiladelphia,HbKorle-Bu,HbLepore,HbK?ln,denaturatedHbE….Z5:HbS,HbHasharon,HbHandsworth,denaturatedHbO-Arab.Z4:HbE,denaturatedHbC,HbK?ln,HbA2variants,M-IwateHbA2variantsZ3:HbA2,HbO-ArabZ2:HbC,HbConstantSpring,SetifHbA2variantZ1:HbdA2HbaA2,HasharonHbA2variant,WinnipegHbA2variant……2021/10/1029正常HbA2

質(zhì)控品條帶結(jié)果可錄為QC2021/10/1030HbAFSC質(zhì)控品,可用來作為參照曲線,

便于異常結(jié)果的判斷2021/10/1031HbsA,F,A2

檢測結(jié)果可通過顏色進行區(qū)分

異常區(qū)帶顯示為灰色2021/10/1032主要異常血紅蛋白變異體Z15 ?HbHZ12 ?HbBartZ10 ?HbHopeZ9?HbA

Z7?HbFZ6?HbDPunjabZ5?HbSZ4?HbEZ3?HbA2Z2?HbCHbEHbSHbH2021/10/1033

HbS變異體,HbA2正常值

β6Glu→ValHbA=22HbS=2S2HbA2=222021/10/1034Capillarys/Minicap血紅蛋白試劑優(yōu)勢:無需前處理(不需要洗血和溶血)，直接檢測血紅蛋白C和E能從A2分離開根據(jù)S型和D型的細微電荷區(qū)別,進行區(qū)分.對于處于A和S之間的F給予個性化和聚焦的精確量化.對A2型血紅蛋白有很好的分辨率和分離效果HbBarts和HbH可以很好的檢測和量化糖化型血紅蛋白電泳出現(xiàn)在主體峰內(nèi),不影響檢測結(jié)果2021/10/1035異常結(jié)果分析2021/10/1036Case2:

31YFemale,血紅蛋白12.8,紅細胞壓積37.4(I)A=84.1%F=1.5%A2=5.5%2021/10/103731YFemale,Hgb12.8,Hematocrit37.4(II)AlkAcidFSCA2CSF?-thalassemia-輕型A2AAAACPCPA=93.4%,F=1.1%,A2=5.5%2021/10/1038HbA92.5%HbF2.6HbA24.9%HbFHbAHbA267YfemalefromTunisia,Hgb9.1,hematocrit28,MCV62小紅細胞癥;betathalassemia輕型2021/10/1039HbH4%HbA94.7%HbA21.3%HbAHbA2HbHChild9Y,fromLaos,Hgb8,hematocrit27.9,MCV54.1嚴重小紅細胞癥;血紅蛋白H病，需要基因篩查2021/10/1040HbHandBart’s-Alpha-thalassemia

HBarts

2021/10/1041Case1:

13YMale,Hgb8.1,Hct24.0(I)A2=6.1%S=82.8%2021/10/1042Case1:13YMale,Hgb8.1,Hematocrit24.0(II)AlkAcidFSCSA2+FCSFS

HgbF/S,A2=4.6%+betathalassemiaminorA2AFACPCP2021/10/1043Case2:

65YMale,Hgb9.4,Hematocrit27.3(I)Co-migrationwithA2A=62.1%A2=31.7%*2021/10/1044Case2:HbEMigratesSeparatelyFromHbA2

β26Glu→Lys2021/10/104521Y,pregnantwoman,Hgb13.1,hematocrit38.6HbA95%HbF2.1%HbA22.9%Normalpattern,HbFslightlyincreased(pregnancy)2021/10/1046Baby2monthsold,fatherfromMartinique,motherfromCentralAfrica,Hgb11,hematocrit29.8HbF49.5%HbS25.9%HbA21.8%HbC22.8%HbFHbSHbA2HbCSCcompoundheterozygoty2021/10/1047Diabeticpatient,54Y,Hgb14.5,hematocrit43.5,MCV88HbA1cmeasurement(HPLCTosoh)HbA54.7%HbX41.7%HbA23.6%HbAHbA2HbXNormalhemogram;compatiblewithheterozygoteA/D;Tobeidentifiedbygenotyping2021/10/1048HbA51.8%HbA22.9%HbC35.9%HbAHbA2HbCDiabeticpatient,61Y,Hgb11.6,hematocrit34.8,MCV85Slightanemia;compatiblewithheterozygoteA/CTobeidentifiedbygenotyping2021/10/1049Adoptedchild,4Y,originatedfromHaiti,Hgb10.9,Hematocrit31.3,MCV76.9HbA97.5%HbA21.4%HbX1.1%HbAHbA2HbXSlightanemia;heterozygousDeltamutation,asymptomatic2021/10/1050Diabeticpatient,73Y,Hgb10.2,hematocrit30.8,MCV87.3Alphachainmutation;genotypingconfirmation:HbWinnipega75AspTyrHbA-WiHbA2-WiHbAHbA22021/10/1051HbA90.3%HbF3.8%HbA25.9%HbAHbFHbA2HbA64%HbS33.1%HbA22.9%HbAHbSHbA2HbA2.2%HbF67.3%HbS29.1%HbA21.4%HbAHbFHbSHbA2Father:BetathalassemiaminorMother:HeterozygoteASBaby2monthsold:AssociationS-betathalassemia2021/10/1052HbLeporeonMinicap/CapillarysANAlc.A2LeporeNAc.A0+

LeporeA1HbA2HbAHbFHbLeporeAFSCcontroloverlaying2021/10/1053HbLeporeb和d鏈重新組合形成.在堿性緩沖液下電泳:總體帶電荷下降→電泳位置出現(xiàn)在S型血紅蛋白附近基因雜合體:HbLeporefraction:5–15%Clinicalsignsofminorbthalassemia基因純合體:HbLeporefraction:about30%Clinicalsignsofhomozygousbthalassemia常見區(qū)域:Lepore(-Boston–Washington):

常見于意大利人群;同樣常見于在羅馬尼亞,澳大利亞和墨西哥人群.特點:2021/10/1054a47Asp→HisHbHasharonHbAHbA2HbFHbHasharonHbHa-A2HbO-Arabb121Glu→LysHbA2+O-ArabHbFHbA2021/10/1056DIAGNOSTICFLOW-CHART2021/10/1057ANEWFASTHEMOGLOBINELECTROPHORESISMETHODFORDRIEDBLOODSPOTSONSEBIACAPILLARYS?AUTOMATEDSYSTEM

2021/10/1058現(xiàn)有的新生兒血紅蛋白篩查方法(SCD)

新生兒血紅蛋白檢測:

*等電聚焦

(IEF)

*高效離子交換液相色譜法(CE-HPLC).

毛細管電泳方法可取代常規(guī),操作復(fù)雜的等電聚焦方法2021/10/1059新生兒血紅蛋白快速檢測法取血板BSD600全自動打孔器全自動溶血,樣品稀釋和檢測溶血劑樣品條碼識別：取血板條碼＋樣品稀釋杯條碼使用純凈水洗脫樣品2021/10/1060與IEF方法比較,毛細管方法優(yōu)勢對于常見異常血紅蛋白變異體有100％區(qū)分能力(HbS,C,D,E)對其他非常見變異體有良好檢測能力對不同類型樣品擁有相同檢測能力：新生兒,早產(chǎn)兒或者進行過輸血患兒樣品全程檢測溯源性:取血板和樣品稀釋杯使用條碼高效性(48個樣品/小時),576樣品/天4小時人機分離操作,最多可進行3X192個樣品檢測可選擇使用與毛細管匹配的全自動打孔機,完全自動化處理樣品無需人工進行樣品轉(zhuǎn)移,避免交叉污染該項目檢測完全自動化:從前處理到檢測,直到結(jié)果分析,全程無需人工干預(yù).2021/10/1061使用標準取血板,在室溫下進行干燥.干燥的取血板可在2-8°C下,保存1個月.

新生兒血紅蛋白檢測的樣品要求通過顏色區(qū)分正常及異常樣品正常血樣:

withHbFandHbA

(+acetylatedHbF)異常血樣2021/10/1063提供樣品檢測完整溯源性通過樣品ID,試劑杯和全自動打孔器的數(shù)據(jù)記錄完成數(shù)據(jù)交換異常樣品自動顯示2021/10/1064電泳圖譜說明:*檢測到條帶的位置,圖譜會自動定位*鼠標經(jīng)過的區(qū)帶位置,會顯示出該區(qū)帶的所有可能出現(xiàn)的異常血紅蛋白名稱.(N1toN13).新生兒血紅蛋白檢測條帶名稱識別表N13:HbBart’sN12://N11:HbHope,Gammachainvariants,denaturedHbAN10:HbAN9:DenaturedHbFN8://N7:HbFN6://N5:HbD-Punjab,HbG-Philadelphia,HbKorle-BuN4:HbS,acetylatedgammachainvariantsN3:HbE,HbF-OuledRabah,gammachainvariants,MethemoglobinN2:HbA2,HbO-Arab,HbF-OuledRabah,gammachainvariantsN1:HbC2021/10/1066正常血樣HbFHbABirth:19/01/06Samplecollection:24/01/06Term:39w.Weight:3445g2021/10/1067輸血后檢測結(jié)果Birth:29/01/06Samplecollection:01/02/06Term:38w.Weight:3100g2021/10/1068F/ShomozygoteBirth:05/01/06Samplecollection:08/01/06Term:37w.Weight:3490gHbSHbFDenaturedHbF2021/10/1069早產(chǎn)兒體內(nèi)的F/SDenaturedHbFHbFHbSBirth:20/02/06Samplecollection:23/02/06Term:34w.Weight:1300g

2021/10/1070F/SCcompoundheterozygoteDenaturedHbFHbFHbSHbCBirth:30/01/06Samplecollection:02/02/06Term:40w.Weight:3900g2021/10/1071F/ASheterozygoteHbAHbFHbSBirth:16/12/06Samplecollection:19/12/06Term:36w.Weight:2780g2021/10/1072F/ChomozygoteHbFHbCDenaturedHbFBirth:20/12/05Samplecollection:24/12/05Term:39w.Weight:3160g2021/10/1073F/ACheterozygoteBirth:18/12/06Samplecollection:21/12/06Term:40w.Weight:3035g2021/10/1074F/ACinaprematurenewbornBirth:17/10/05Samplecollection:20/10/05Term:30w.Weight:2330g

2021/10/1075F/ADheterozygoteBirth:29/01/06Samplecollection:31/01/06Term:37w.Weight:3280g2021/10/1076