蛋白表達技術

蛋白表達技術蛋白表達技術蛋白表達涵義蛋白表達系統(tǒng)組成原核表達真核表達無細胞表達蛋白表達的涵義

蛋白表達是指用模式生物如細菌、酵母、動物細胞或者植物細胞表達外源基因蛋白的一種分子生物學技術,在基因工程技術中占有核心地位。宿主載體輔助成分蛋白表達體系的組成一、原核表達系統(tǒng)

大腸桿菌是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。1977年，Itakura等成功地在E.coli中表達了一種哺乳動物的肽類激素－生長激素抑制素，從而首次實現(xiàn)了外源基因在原核細胞中的體外表達。這被認為是基因工程發(fā)展史上的一座里程碑。優(yōu)越性：①對大腸桿菌的基礎生物學、分子遺傳學等背景知識和基因表達的調控機理已有了深刻了解；②商品化的載體和菌株種類非常齊全；③表達效率高；④易培養(yǎng)，成本低。缺點：①因分泌能力不足，真核蛋白質常形成不溶性的包含體；②蛋白質不能糖基化；③其內毒素很難除去。

StrainvectorgrowthconditionsFactorsinE.coli

proteinexpression

一個蛋白要成功的在E.coli系統(tǒng)表達，就是要根據(jù)表達目的在載體，菌株和培養(yǎng)條件三個主要因素之間找到一個理想的結合點。表達載體表達系統(tǒng)中最重要的元件是表達載體，表達載體應當具有表達量高、穩(wěn)定性好、適用范圍廣等優(yōu)點。表達載體主要包括啟動子、表達閱讀框、終止子、復制起點以及抗性篩選標記等重要元件近年來的研究表明，在科研和工業(yè)上被廣泛應用的大腸桿菌表達載體主要有pGE系列、pQE系和pET系列，其中目前被廣泛應用的高效表達載體是pET。復制起始點：保證載體可以正確復制和增殖，決定質粒載體在宿主中的拷貝數(shù)?？寺≥d體常采用拷貝數(shù)低、嚴謹復制的復制子通常表達載體都會選用高拷貝的復制子選擇性基因-篩選標記：藍白斑篩選（主要用于克隆）、營養(yǎng)缺陷性篩選、抗生素篩選（青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四環(huán)素抗性等）。復制起始點：保證載體可以正確復制和增殖，決定質粒載體在宿主中的拷貝數(shù)?？寺≥d體常采用拷貝數(shù)低、嚴謹復制的復制子通常表達載體都會選用高拷貝的復制子選擇性基因-篩選標記：藍白斑篩選（主要用于克隆）、營養(yǎng)缺陷性篩選、抗生素篩選（青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四環(huán)素抗性等）。多克隆位點：DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個限制內切酶識別位點。能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案。啟動子：能被RNA聚合酶識別、結合并啟動基因轉錄的一段DNA序列轉錄形式：組成型、誘導型強弱：取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列?！磉_載體通常選用強啟動子以提高表達量，但弱啟動子也有其優(yōu)點，如降低本底表達、增加可溶表達、表達小量伴侶蛋白等。

T7啟動子----最常用啟動子基于T7RNA聚合酶及其強啟動子之間的特異性和轉錄的高效性建立的pET系統(tǒng)(No-vagen)是最常用的E.coli表達系統(tǒng)。T7NAP機制在誘導蛋白表達時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白，而且表達產物產量也特別高。終止子：終止點前含有一段7-20bp的回文序列，可以保護mRNA在核外不被降解，顯著延長mRNA的壽命，由此提高重組蛋白的表達量。融合標簽：利用DNA體外重組技術，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和純化等。標簽位置的選擇：----N端融合：易于構建。終止密碼子來自載體基因，表達量高提前終止會干擾純化二級翻譯起始，不影響純化----C端融合：構建時注意避免移碼，基因不能自帶終止密碼子，提前終止不影響純化，二級翻譯起始會干擾純化常用融合標簽

His·Tag

pET系統(tǒng)

GST·Tag

pGEX系統(tǒng)

MBP·Tag

pMal系統(tǒng)TrxHISHis6是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。組氨酸殘基側鏈與固態(tài)的鎳有強烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對重組蛋白進行分離純化。優(yōu)點：標簽的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，一般不影響目標蛋白的功能；His標簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下（純化疏水性強的蛋白）或變性條件（純化包涵體蛋白）下純化，用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復性不受其它蛋白的干擾，或進行金屬螯和親和層析復性；His標簽融合蛋白也被用于蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA相互作用研究；His標簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫并制備抗體?？蓱糜诙喾N表達系統(tǒng)，純化的條件溫和；可以和其它的親和標簽一起構建雙親和標簽。Flag標簽蛋白Flag標簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時載體中構建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統(tǒng)中表達效率更高。優(yōu)點：FLAG作為融合表達標簽，其通常不會與目的蛋白相互作用并且通常不會影響目的蛋白的功能、性質，這樣就有利用研究人員對融合蛋白進行下游研究。融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過FLAG進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高。FLAG作為標簽蛋白，其可以被抗FLAG的抗體識別，這樣就方便通過WesternBlot、ELISA等方法對含有FLAG的融合蛋白進行檢測、鑒定。融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現(xiàn)FLAG標簽已廣泛的應用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關領域。MBP（麥芽糖結合蛋白）MBP（麥芽糖結合蛋白）標簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。優(yōu)點：MBP可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP標簽可通過免疫分析很方便地檢測。有必要用位點專一的蛋白酶切割標簽如果蛋白在細菌中表達，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。純化：融合蛋白可通過交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。結合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進行洗脫。結合親和力在微摩爾范圍?？捎肕BP抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。GST(谷胱甘肽巰基轉移酶)GST(谷胱甘肽巰基轉移酶)標簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶，它的天然大小為26KD?？芍苯訌募毦呀庖褐欣煤羞€原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹脂進行純化。優(yōu)點：作為高度可溶的蛋白，可增加外源蛋白的可溶性；在大多數(shù)情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的?？稍诖竽c桿菌中大量表達，起到提高表達量的作用。標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。GST標簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強變性劑如：鹽酸胍或尿素等。如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。檢測：可用GST抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。系統(tǒng)名稱公司啟動子抗性常用標簽特點pGEXGE

(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表達，純化難以控制，谷胱甘肽一步洗脫，得到的蛋白純度較低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表達，純化難以控制，麥芽糖一步洗脫，得到的蛋白純度較低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck

(Novagen)T7

T7lacAmp

KanHis·Tag種類豐富。標簽小，無需切割，一般來說，對蛋白活性無影響。純化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系統(tǒng)常用表達載體系統(tǒng)目的蛋白表達形式及在細胞中的定位蛋白表達形式分泌蛋白:采用信號肽序列可以將蛋白直接分泌到細菌的周質腔去。可溶性蛋白:目的蛋白與一段融合標簽序列（FLAG、His－Tag、GFP等)融合表達而形成包涵體蛋白:包涵體蛋白的形成是由于肽鏈折疊過程中，部分折疊中間態(tài)發(fā)生特異性錯誤聚合，不能形成成熟的天然或完全解鏈的蛋白所致宿主菌的選擇用于克隆的宿主菌

K12系列NovaBlue，JM109以及DH5a。特點：recA–endA–型，轉化效率很高，且質粒產量高，適合用于保存帶有克隆目的基因的pET載體。用于表達的宿主菌所有B型菌株，B834，BL21，BLR，OrigamiB，Rosetta及Tuner特點：都缺乏純化過程中降解蛋白的lon蛋白酶及ompT外膜蛋白酶。目的蛋白在這些菌株中的穩(wěn)定性要高于帶有這些蛋白酶的菌株，BL21(DE3)是用得最多的表達菌

E.coli宿主菌名稱特征用途抗性DH5α帶有recAendA突變的克隆菌株，由于DH5α具有deoR變異，可以作為較大質粒的宿主菌使用。常用的質粒抽提工程菌株,可用于藍白斑篩選鑒別重組菌株。無BL21lon和ompT蛋白酶缺陷型用于PGEX載體構建質粒的蛋白表達無BL21(DE3)lon和ompT蛋白酶缺陷型，含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動子下的T7RNA聚合酶基因用于含有T7的pET系列載體構建質粒的蛋白表達無BL21(DE3)-RP在BL21(DE3)細胞的基礎上，具有額外拷貝的argU和proL基因解決了表達富含AT的基因組蛋白密碼子偏倚性問題氯霉素BL21(DE3)-RIL在BL21(DE3)細胞的基礎上，具有額外拷貝的argU、ileY和leuWtRNA基因解決了表達富含AT的基因組蛋白密碼子偏倚性問題氯霉素BL21(DE3)-plysS帶有可以與pET共存的、編碼T7溶菌酶（T7RNA聚合酶的天然抑制物）的質粒。pLysS菌株在被誘導前T7RNA聚合酶的基礎表達被抑制，這樣可以使表達會影響宿主細胞生長和活力的重組體在宿主中更穩(wěn)定。帶有pLacI質粒的宿主菌產生額外的抑制pETBlue和pTriEx載體基礎表達的lac阻遏蛋白更嚴格的本底表達控制，適合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表達。氯霉素BL21(DE3)-Rosetta-gami（Rosetta-gami）攜帶pRARE2質粒的BL21衍生菌，補充大腸桿菌缺乏的七種（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG）稀有密碼子對應的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平，又具有thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase(gor)兩條主要還原途徑雙突變菌株，顯著提高細胞中二硫鍵形成幾率，促進蛋白可溶性及活性表達補充7種稀有密碼子，促進蛋白可溶性及表達活性卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素Rosetta-Blue帶有recAendAlacIq突變的克隆菌株,高蛋白表達,補充大腸桿菌缺乏的AGG,AGA,AUA,CUA,CCC,GGA六種稀有密碼子對應的tRNA。補充稀有密碼子，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平氯霉素表達條件優(yōu)化增加可溶性和折疊選擇大腸桿菌偏愛密碼子毒性基因及質粒穩(wěn)定性合適載體與宿主菌組合表達條件優(yōu)化菌株適合啟動子特性BL21tac、trc……(pGEX、pMal)適用于非T7啟動子的表達系統(tǒng)BL21(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)適用于T7、T7lac的表達系統(tǒng)，適用于非毒基因的表達BL21(DE3)pLysST7/T7lac(pET，pEASY)質粒pLysS含有表達T7溶菌酶的基因，可結合T7RNA聚合酶，降低本底表達水平。適用于嚴謹調控毒基因的表達Rosetta(DE3)

Transetta(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)補充6種稀有密碼子對應的tRNA，提高外源基因，特別是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平OrigamiB(DE3)

TransB(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)具有thioredoxinreductase/glutathionereductase雙突變，有助于形成更多的二硫鍵，增加蛋白的可溶性。毒基因：基因表達產物——即目的蛋白，影響宿主生長（“毒性”）

例1:載體對表達的影響pET32,BL21(DE3),表達的蛋白:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD)pET43,BL21(DE3),表達的蛋白:Nus-His6-STag-EK-IFN(MW78KD)誘導后破菌上清破菌沉淀誘導前誘導前誘導后破菌沉淀破菌上清破菌上清

例2:宿主菌對表達的影響B(tài)L21(DE3)trxB-trxB-

gor

-Tissueplasminogenactivator(tPA,9disulfidebonds)wasexpressedinthreedifferenthosts.10mgofsolubleproteinwasspottedontofibrinagaroseplatesandincubatedfor24hat37°C.ZoneofclearingmeasuresbiologicalactivityoftPA.pET32

例3:表達條件對表達的影響pET21,BL21(DE3)-RIL,表達的蛋白:His6-REIIBP(MW67KD)0.1mMIPTG,incubatefor16hat16℃0.1mMIPTG,incubatefor3hat37℃

NISP

NISPU:UninducedcrudeextractI:CrudeextractafterinducedS:Lysis

supertanantP:Lysisprecipitation大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究新進展近幾年來，對大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究，已經(jīng)從最初的構建不同的表達載體建立新的表達系統(tǒng)轉移為完善現(xiàn)有的表達系統(tǒng)，解決表達系統(tǒng)中的各種缺陷，包括:采用RosettaTM(No-vagen)代替BL21菌株來增強含有E.coli稀有密碼子的重組蛋白的表達水平;采用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS以及BL21(DE3)pLysE(Invitrogen)彌補高濃度的胞內酶環(huán)境對具有生物活性的目的蛋白在E.coli中表達的抑制等。最近幾年來，研究人員逐步將研究重點放在通過將一些具有活性的小蛋白與目的蛋白融合，進而促進目的蛋白在E.coli中的表達，或者通過改造某種現(xiàn)有的表達載體，通過將各種促溶標簽與載體融合，進而使得某些在E.coli中不表達的蛋白得以表達或使原本以包涵體形式表達的蛋白以可溶性形式表達。這些標簽包括FLAG、MBP、GST、thioredoxin等。其他原核表達式系統(tǒng)乳酸乳球菌表達系統(tǒng)

乳酸菌是革蘭氏陽性菌，膜單一，在大量膜蛋白的表達方而提供了革蘭氏陰性菌無法比擬的優(yōu)勢，原因是革蘭氏陰性菌具有內外膜并覆蓋著厚厚的、剛性的肚聚糖層的內表而周質空間影響蛋白質的表達，而蛋白在乳酸乳球菌中的表達是通過融合Mistic到目標膜蛋白而加以改善，提高其表達量。芽袍桿菌表達系統(tǒng)

芽抱桿菌(Bacillus)也屬于革蘭氏陽性菌。橋石短芽抱桿菌和枯草芽抱桿菌表達系統(tǒng)由Takara,MoBiTec公司開發(fā)與提供。芽抱桿菌能過表達并且能分泌外源蛋白到培養(yǎng)基中，這適合分泌型蛋白的生產，如細胞因子或需要形成復雜二硫鍵的外源蛋白。真核細胞表達系統(tǒng)為了克服原核表達系統(tǒng)的不足，許多學者將原核基因調控系統(tǒng)引入到真核基因調控領域?；蚬こ坛Ｓ玫恼婧吮磉_系統(tǒng)有:酵母、昆蟲細胞、動物細胞、植物細胞酵母表達系統(tǒng)

酵母是一種低等的單細胞真核生物，它既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作等特點，同時又具有真核生物蛋白質加工、折疊、翻譯后飾等的功能。目前工業(yè)生產中最重要的外源蛋白表達系統(tǒng)是酵母表達系統(tǒng)。優(yōu)越性：①蛋白可糖基化，有相對正確的天然結構，可很好的生產分泌型蛋白；②表達載體為整合型質粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中，實現(xiàn)高效率表達；③表達載體都為E.coli/PichiaPastoris的穿梭載體，可在獲得克隆后采用E.coli細胞大量擴增。④易培養(yǎng)，成本低,可高密度發(fā)酵。缺點：①糖基化與哺乳動物有所差別；②培養(yǎng)上清多糖濃度高，不利于純化。酵母表達系統(tǒng)發(fā)展第37

頁釀酒酵母甲基營養(yǎng)型酵母粟酒裂殖酵母長久以來被稱為真核生物中的“大腸桿菌”，最早應用于酵母基因的克隆和表達。目前利用釀酒酵母為宿主細胞表達了多種外源基因，如乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細胞集落刺激因子、人血管抑制素等。1983年，美國Wegner等人最先發(fā)展了以甲基營養(yǎng)型酵母為代表的第二代酵母表達系統(tǒng)。甲基營養(yǎng)型酵母包括:畢赤酵母、漢森酵母、假絲酵母。以畢赤巴斯德酵母為宿主的外源基因表達系統(tǒng)近年來發(fā)展最為迅速，應用也最為廣泛。酵母細胞中生理特性最接近高等生物的一種，其染色體結構和功能，細胞循環(huán)的控制，RNA剪接蛋白表達分泌機制及翻譯后修飾等都與哺乳動物細胞很相似。近年來，有學者提出它可能也是潛在的能有效表達真核膜蛋白的表達系統(tǒng).甲醇酵母表達系統(tǒng)是目前應用最廣泛的酵母表達系統(tǒng)，以PichiaPastoris應用最多。畢赤酵母表達系統(tǒng)模式載體甲醇氧化酶啟動子A、目前已發(fā)現(xiàn)的、最強的真核啟動子B、嚴謹調控型啟動子

AOX1：葡萄糖和甘油脫阻遏、甲醇誘導

MOX：葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏、甲醇誘導甲醇酵母的表達載體為整合型質粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導表達外源蛋白。這樣可以大大提高表達產量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質其產量往往可達克級。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細胞，不會發(fā)生超糖基化。

近年來，用該表達系統(tǒng)成功表達的蛋白達到了300多種，表達的蛋白主要包括基因工程疫苗，如乙肝疫苗及一些來自動植物和細菌的各種酶、膜受體蛋白、抗原和抗體及一些用來研究晶體結構的蛋白等。同時，該系統(tǒng)作為一種基礎研究的模型系統(tǒng)在分子生物學領域也發(fā)揮了越來越重要的作用，如用該系統(tǒng)進行過氧化物酶體的輸入和組裝及真核細胞的分泌途徑和功能等方面的研究。目前國內也有多種蛋白在該系統(tǒng)中獲得了高效表達，如人白蛋白、人胰島素、干擾素、乙肝表面抗原、集落刺激因子等幾十種蛋白質。昆蟲細胞表達系統(tǒng)是目前國內外很推崇的真核表達系統(tǒng)。依托桿狀病毒結構基因中多角體蛋白的強啟動子而構建的表達載體，有效甚至高水平地使很多真核目的基因得到表達。利用重組桿狀病毒在昆蟲細胞體系中表達外源蛋白是目前較為流行的表達方式。優(yōu)越性：①重組蛋白具有完整的生物學功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配；②可容納較大片段的外源DNA插入，因此是表達大片段DNA的理想載體；③可進行分泌表達。缺點：①糖基化與哺乳動物有所差別；②表達量有限；③作為藥物宿主細胞未被FDA認可；

④培養(yǎng)成本高。2.昆蟲表達系統(tǒng)桿狀病毒基因組：閉環(huán)雙鏈DNA，88-166kb表達系統(tǒng)桿狀病毒表達系統(tǒng)（BEVS）家蠶核型多角體病毒-家蠶表達系統(tǒng)宿主：鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、脈翅目、毛翅目的600多種昆蟲克隆基因方法：轉移載體→共轉染→同源重組→空斑篩選→純化→重組病毒桿狀病毒載體的構建發(fā)展3.哺乳動物細胞表達表達系統(tǒng)

當前，哺乳動物細胞表達已成為生物藥物生產的重要技術。哺乳動物細胞常用于表達高活性的人源重組蛋白。優(yōu)越性：①糖基化與人源蛋白一致；②能表達天然結構的完整蛋白，活性很高；③可進行分泌表達。缺點：①表達量低；②培養(yǎng)成本很高，操作繁瑣。常用宿主細胞細胞名稱來源已投放產品BHK-21地鼠幼鼠腎凝血Ⅷ因子CHO-K1中國倉鼠卵巢tPA，Ⅷ因子，EPO，G-CSF等C127小鼠乳腺腫瘤GHMDCK長耳狗腎臟獸用疫苗NamalwaBurkitt淋巴瘤病人的類淋巴母細胞EPO，LT，tPA，IFNVero成年非洲綠猴腎HBsAg，GH鼠骨髓瘤細胞骨髓瘤tPA，抗體COSSV40轉化的綠猴腎細胞CD34，CD69，TGF表達栽體哺乳動物細胞表達外源重組蛋白可利用質粒轉染和病毒載體的感染。哺乳動物細胞表達載體必須包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等控制元件根據(jù)進入宿主細胞的方式，可將表達載體分為病毒載體與質粒載體。病毒載體:是以病毒顆粒的方式，通過病毒包膜蛋白與宿主細胞膜的相互作用使外源基因進入到細胞內。常用的病毒載體有SV40病毒、腺病毒、反轉錄病毒、痘苗病毒桿狀病毒載體應用于哺乳動物細胞的表達在近幾年頗受重視，這是因為它與其它病毒載體相比有特有優(yōu)勢，如可通過昆蟲細胞大量制備病毒顆粒；可感染多種哺乳動物細胞，但在細胞內無復制能力，生物安全度高；可插入高達38kb的外源基因等。

質粒載體則是借助于物理或化學的作用導人細胞內。依據(jù)質粒在宿主細胞內是否具有自我復制能力，可將質粒載體分為整合型和附加體型載體兩類。整合型載體無復制能力，需整合于宿主細胞染色體內方能穩(wěn)定存在，如SV40病毒載體、反轉錄病毒載體和游離型如痘苗病毒、腺病毒載體。利用Sindbisvirus(SV)、ScmlikiForestvirus(sFV)和痘苗病毒載體感染哺乳動物細胞表達的蛋白在結構與功能上與天然哺乳動物來源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒載體感染哺乳動物細胞獲得的外源蛋白占細胞總蛋白的；附加體型載體則是在細胞內以染色體外可自我復制的附加體形式存在。整合型載體一般是隨機整合入染色體，其外源基因的表達受插入位點的影響，同時還可能會改變宿主細胞的生長特性。相比之下，附加體型載體不存在這方面的問題，但載體DNA在復制中容易發(fā)生突變或重排。 猴多瘤病毒DNA（SV40）

SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNASV40可以與所有哺乳動物宿主細胞中的組蛋白H2、H3、H4結合，從而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結構。

SV40感染猴細胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。SV40在裂解宿主細胞前的晚期狀態(tài)時，每個宿主細胞含有105個病毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效表達外源蛋白SV40的生物學特性SV40DNAoriVP2TVP3VP1tSV40DNA-質粒DNA雜合載體的構建

重組的SV40DNA分子必須經(jīng)過包裝后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。為了盡量提高SV40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。AproriviralgenegptSV40oripV2-GPTpBR322pBR322SV40

pV2-GPT是一種SV40DNA與大腸桿菌質粒DNA雜合的載體，其中gpt為細菌來源的谷氨酸-丙氨酸轉氨酶基因，用于篩選重組子。該載體曾被成功地用于在猴腎細胞中表達有生物活性的兔b-珠蛋白.人乳多瘤病毒DNA（BKV）

人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈DNA，感染宿主細胞后基因不發(fā)生整合，獨立于染色體而自主復制，每個宿主細胞最高可達500個拷貝人乳多瘤病毒的生物學特性人乳多瘤病毒表達載體的構建BKV-E.coli

穿梭載體BKV

oriBKVgeneDREMMTPAp

rE.coli

oriSV40PNeor刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因，并與大腸桿菌質粒拼接，構成穿梭載體，它不能整合，同時也不能形成成熟的病毒顆粒裂解受體細胞。安裝細胞色素P450dioxin介導的增強子DRE，控制小鼠乳腺癌啟動子MMTP，由其帶動外源基因的表達。SV40來源的啟動子控制Neor

標記基因，以G418篩選重組子。以此載體在人細胞系中表達b1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。利用SV40DNA載體表達外源基因的程序SV40載體病毒晚期基因啟動子篩選標記ori缺陷的SV40輔助病毒去除細菌序列插入外源基因重組分子分離病毒DNA轉化篩選增殖感染通過強化基因轉錄高效表達外源基因

在載體上安裝病毒或細胞來源的強啟Ap

rM13oriColE1oriCMVPPolylinkerGeneIntronSV40TPolyAsignal高效表達載體mRNA前體AAAAAAAAAmRNA動子以及有效的翻譯元件，是使外源基因高效表達的一種手段，如：

細胞巨化病毒CMV的啟動子

動物珠蛋白基因的內含子

SV40的終止子和polyA化信號序列

絕大多數(shù)哺乳動物細胞的表達型載體上攜帶內含子結構，因為mRNA前體的剪切能促進成熟mRNA向胞質的運輸，有利于翻譯。有的還含有各種信號肽序列。瞬時轉染與穩(wěn)定轉染哺乳動物細胞生產蛋白的方式有兩種：瞬時轉染和穩(wěn)定轉染。瞬時轉染的特點是短期快速表達，滿足蛋白的小量制備。細胞瞬時轉染表達能夠快速靈活的制備重組蛋白，細胞在轉染后1-4天內即可收獲并進行分析。穩(wěn)定轉染通過穩(wěn)定細胞系能夠滿足蛋白的大量、長期生產。穩(wěn)定轉染的是將外源基因整合到細胞自身基因組上，隨著細胞的生長分裂外源基因可以穩(wěn)定轉染表達，同時經(jīng)過抗生素加壓篩選，最終得到能夠穩(wěn)定轉染表達蛋白的細胞株。發(fā)展歷史1987年FDA批準了基因泰克公司生產的組織型纖溶酶原激活劑（tPA）,世界上第一個哺乳動物細胞制備的重組蛋白質藥物標志著哺乳動物細胞制備重組蛋門時代的到來。經(jīng)過20多年的發(fā)展，哺乳動物細胞制備重組蛋白技術發(fā)生了巨大的變化。主要表現(xiàn)在:(1)細胞培養(yǎng)時間延長，由過去的7天延長至21天；(2)細胞密度增加，過去：1-2X106細胞／毫升，現(xiàn)在：1-1.5X107細胞／毫升；

(3)產量增加，過去：10—20pg重組蛋白／細胞／天，50一100mg重組蛋白／升，現(xiàn)在：50-90pg重組蛋白／細胞／天，1-5g重組蛋白／升。

迄今為止，已有大約300種重組蛋白藥物正在進行臨床試驗，但在哺乳動物工程細胞中大規(guī)模生產的只有少數(shù)幾種：b

干擾素

g

干擾素凝血因子VIII 凝血因子IX促紅細胞生成素（EPO）

生長因子（hGH）白介素2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原單克隆抗體 CD4受體組織型纖溶酶原激活劑（tPA）

利用哺乳動物工程細胞生產人源化的小鼠抗體大多數(shù)惡性淋巴瘤細胞表面上都有一種特異性的糖蛋白campath，用人源化的小鼠抗campath抗體治療非霍金淋巴細胞瘤患者，效果良好。重組抗體采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達。Neor鼠金屬硫蛋白啟動子b

肌動蛋白啟動子抗體輕鏈cDNAb

肌動蛋白終止子pLdhfrSV40啟動子b

肌動蛋白啟動子抗體重鏈cDNAb

肌動蛋白終止子pH利用哺乳動物工程細胞生產人組織纖溶酶原激活劑

第一個由重組哺乳動物dhfr啟動子人tPA

cDNA終止子細胞規(guī)模化生產的醫(yī)用蛋白是治療急性心肌梗塞的溶血栓藥物：人組織纖溶酶原激活劑（tPA）。同樣采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達，受體細胞選用CHO系統(tǒng)。目前，用該工藝路線生產的重組人tPA已經(jīng)商品化。信號肽編碼序列

此外，人tPA也可由重組大腸桿菌生產，但蛋白的重折疊效率低。利用哺乳動物工程細胞生產人凝血因子VIII

凝血因子VIII編碼基因的缺陷與血友病密切相關。多年來，血友病病人都是使用從人血中分離純化的凝血因子VIII生物制品進行治療，然而由于人的血源污染乙肝病毒或愛滋病病毒，數(shù)千名使用這種血液制品的血友病人慘遭感染，其中10%的病人最終死于愛滋病而非血友病。早在上述情況發(fā)生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鑒定，血源的污染則加速了利用基因工程技術生產該藥物的進程。與tPA相似，人凝血因子VIII也是一種結構復雜的大分子，必須通過重組哺乳動物細胞生產，但目前商品化了的重組人凝血因子VIII尚不能滿足幾代血友病人的大量需求。轉基因動物以動物個體為基因受體的基因表達技術，并由于這種外源基因的導入而產生可以遺傳的變異.這些遺傳改變包括：外源DNA至少整合到一條染色體上由于外源DNA的插入使任一基因發(fā)生改變由于外源DNA的插入使染色體發(fā)生重排有意識的導入可以持久存在的遺傳實體在各種器官和細胞中，乳腺組織可以進行大規(guī)模的翻譯后修飾，并具有良好的滲透屏障。近年來，轉基因動物乳腺生物反應器的研究已經(jīng)成為生物工程領域研究的熱點，一般用來高效、高質量生產具有生物活性的蛋白。但多數(shù)研究表明，乳腺特異性表達的成功率很低，蛋白在乳汁中的表達水平較低。植物生物表達系統(tǒng)外源基因可以使用帶有分泌信號肽序列的植物體使重組蛋白分泌表達。利用植物做為生物反應器生產的重組蛋白在折疊和組裝上與動物細胞更為相似，從而具有與高等動物細胞表達的產物基本一致的免疫原性和生物活性，并且不會存在被動物、病原體污染的可能性。植物能夠表達來自動物、細菌、病毒以及植物本身的蛋白質易于大規(guī)模培