蛋白表達(dá)技術(shù)

蛋白表達(dá)技術(shù)蛋白表達(dá)技術(shù)蛋白表達(dá)涵義蛋白表達(dá)系統(tǒng)組成原核表達(dá)真核表達(dá)無(wú)細(xì)胞表達(dá)蛋白表達(dá)的涵義

蛋白表達(dá)是指用模式生物如細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或者植物細(xì)胞表達(dá)外源基因蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù),在基因工程技術(shù)中占有核心地位。宿主載體輔助成分蛋白表達(dá)體系的組成一、原核表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌是基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系。1977年，Itakura等成功地在E.coli中表達(dá)了一種哺乳動(dòng)物的肽類激素－生長(zhǎng)激素抑制素，從而首次實(shí)現(xiàn)了外源基因在原核細(xì)胞中的體外表達(dá)。這被認(rèn)為是基因工程發(fā)展史上的一座里程碑。優(yōu)越性：①對(duì)大腸桿菌的基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等背景知識(shí)和基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理已有了深刻了解；②商品化的載體和菌株種類非常齊全；③表達(dá)效率高；④易培養(yǎng)，成本低。缺點(diǎn)：①因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體；②蛋白質(zhì)不能糖基化；③其內(nèi)毒素很難除去。

StrainvectorgrowthconditionsFactorsinE.coli

proteinexpression

一個(gè)蛋白要成功的在E.coli系統(tǒng)表達(dá)，就是要根據(jù)表達(dá)目的在載體，菌株和培養(yǎng)條件三個(gè)主要因素之間找到一個(gè)理想的結(jié)合點(diǎn)。表達(dá)載體表達(dá)系統(tǒng)中最重要的元件是表達(dá)載體，表達(dá)載體應(yīng)當(dāng)具有表達(dá)量高、穩(wěn)定性好、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。表達(dá)載體主要包括啟動(dòng)子、表達(dá)閱讀框、終止子、復(fù)制起點(diǎn)以及抗性篩選標(biāo)記等重要元件近年來(lái)的研究表明，在科研和工業(yè)上被廣泛應(yīng)用的大腸桿菌表達(dá)載體主要有pGE系列、pQE系和pET系列，其中目前被廣泛應(yīng)用的高效表達(dá)載體是pET。復(fù)制起始點(diǎn)：保證載體可以正確復(fù)制和增殖，決定質(zhì)粒載體在宿主中的拷貝數(shù)?？寺≥d體常采用拷貝數(shù)低、嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)制的復(fù)制子通常表達(dá)載體都會(huì)選用高拷貝的復(fù)制子選擇性基因-篩選標(biāo)記：藍(lán)白斑篩選（主要用于克隆）、營(yíng)養(yǎng)缺陷性篩選、抗生素篩選（青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四環(huán)素抗性等）。復(fù)制起始點(diǎn)：保證載體可以正確復(fù)制和增殖，決定質(zhì)粒載體在宿主中的拷貝數(shù)?？寺≥d體常采用拷貝數(shù)低、嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)制的復(fù)制子通常表達(dá)載體都會(huì)選用高拷貝的復(fù)制子選擇性基因-篩選標(biāo)記：藍(lán)白斑篩選（主要用于克?。I(yíng)養(yǎng)缺陷性篩選、抗生素篩選（青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四環(huán)素抗性等）。多克隆位點(diǎn)：DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個(gè)限制內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案。啟動(dòng)子：能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列轉(zhuǎn)錄形式：組成型、誘導(dǎo)型強(qiáng)弱：取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列?！磉_(dá)載體通常選用強(qiáng)啟動(dòng)子以提高表達(dá)量，但弱啟動(dòng)子也有其優(yōu)點(diǎn)，如降低本底表達(dá)、增加可溶表達(dá)、表達(dá)小量伴侶蛋白等。

T7啟動(dòng)子----最常用啟動(dòng)子基于T7RNA聚合酶及其強(qiáng)啟動(dòng)子之間的特異性和轉(zhuǎn)錄的高效性建立的pET系統(tǒng)(No-vagen)是最常用的E.coli表達(dá)系統(tǒng)。T7NAP機(jī)制在誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白，而且表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量也特別高。終止子：終止點(diǎn)前含有一段7-20bp的回文序列，可以保護(hù)mRNA在核外不被降解，顯著延長(zhǎng)mRNA的壽命，由此提高重組蛋白的表達(dá)量。融合標(biāo)簽：利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和純化等。標(biāo)簽位置的選擇：----N端融合：易于構(gòu)建。終止密碼子來(lái)自載體基因，表達(dá)量高提前終止會(huì)干擾純化二級(jí)翻譯起始，不影響純化----C端融合：構(gòu)建時(shí)注意避免移碼，基因不能自帶終止密碼子，提前終止不影響純化，二級(jí)翻譯起始會(huì)干擾純化常用融合標(biāo)簽

His·Tag

pET系統(tǒng)

GST·Tag

pGEX系統(tǒng)

MBP·Tag

pMal系統(tǒng)TrxHISHis6是指六個(gè)組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)簽的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，一般不影響目標(biāo)蛋白的功能；His標(biāo)簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下（純化疏水性強(qiáng)的蛋白）或變性條件（純化包涵體蛋白）下純化，用高濃度的變性劑溶解后通過(guò)金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復(fù)性不受其它蛋白的干擾，或進(jìn)行金屬螯和親和層析復(fù)性；His標(biāo)簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究；His標(biāo)簽免疫原性相對(duì)較低，可將純化的蛋白直接注射動(dòng)物進(jìn)行免疫并制備抗體?？蓱?yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)，純化的條件溫和；可以和其它的親和標(biāo)簽一起構(gòu)建雙親和標(biāo)簽。Flag標(biāo)簽蛋白Flag標(biāo)簽蛋白為編碼8個(gè)氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時(shí)載體中構(gòu)建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。優(yōu)點(diǎn)：FLAG作為融合表達(dá)標(biāo)簽，其通常不會(huì)與目的蛋白相互作用并且通常不會(huì)影響目的蛋白的功能、性質(zhì)，這樣就有利用研究人員對(duì)融合蛋白進(jìn)行下游研究。融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過(guò)FLAG進(jìn)行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高。FLAG作為標(biāo)簽蛋白，其可以被抗FLAG的抗體識(shí)別，這樣就方便通過(guò)WesternBlot、ELISA等方法對(duì)含有FLAG的融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)、鑒定。融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現(xiàn)FLAG標(biāo)簽已廣泛的應(yīng)用于蛋白表達(dá)、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域。MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）標(biāo)簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。優(yōu)點(diǎn)：MBP可增加在細(xì)菌中過(guò)量表達(dá)的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP標(biāo)簽可通過(guò)免疫分析很方便地檢測(cè)。有必要用位點(diǎn)專一的蛋白酶切割標(biāo)簽如果蛋白在細(xì)菌中表達(dá)，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。純化：融合蛋白可通過(guò)交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。結(jié)合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進(jìn)行洗脫。結(jié)合親和力在微摩爾范圍?？捎肕BP抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測(cè)。GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽蛋白本身是一個(gè)在解毒過(guò)程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26KD。可直接從細(xì)菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹(shù)脂進(jìn)行純化。優(yōu)點(diǎn)：作為高度可溶的蛋白，可增加外源蛋白的可溶性；在大多數(shù)情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的?？稍诖竽c桿菌中大量表達(dá)，起到提高表達(dá)量的作用。標(biāo)簽有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。GST標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會(huì)失去對(duì)谷胱甘肽樹(shù)脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強(qiáng)變性劑如：鹽酸胍或尿素等。如果要去除GST融合部分，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。檢測(cè)：可用GST抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測(cè)。系統(tǒng)名稱公司啟動(dòng)子抗性常用標(biāo)簽特點(diǎn)pGEXGE

(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表達(dá)，純化難以控制，谷胱甘肽一步洗脫，得到的蛋白純度較低,通常需要去掉GST·TagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表達(dá)，純化難以控制，麥芽糖一步洗脫，得到的蛋白純度較低,通常需要去掉MBP·TagpETMerck

(Novagen)T7

T7lacAmp

KanHis·Tag種類豐富。標(biāo)簽小，無(wú)需切割，一般來(lái)說(shuō)，對(duì)蛋白活性無(wú)影響。純化及其方便。pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同pET系統(tǒng)常用表達(dá)載體系統(tǒng)目的蛋白表達(dá)形式及在細(xì)胞中的定位蛋白表達(dá)形式分泌蛋白:采用信號(hào)肽序列可以將蛋白直接分泌到細(xì)菌的周質(zhì)腔去?？扇苄缘鞍?目的蛋白與一段融合標(biāo)簽序列（FLAG、His－Tag、GFP等)融合表達(dá)而形成包涵體蛋白:包涵體蛋白的形成是由于肽鏈折疊過(guò)程中，部分折疊中間態(tài)發(fā)生特異性錯(cuò)誤聚合，不能形成成熟的天然或完全解鏈的蛋白所致宿主菌的選擇用于克隆的宿主菌

K12系列NovaBlue，JM109以及DH5a。特點(diǎn)：recA–endA–型，轉(zhuǎn)化效率很高，且質(zhì)粒產(chǎn)量高，適合用于保存帶有克隆目的基因的pET載體。用于表達(dá)的宿主菌所有B型菌株，B834，BL21，BLR，OrigamiB，Rosetta及Tuner特點(diǎn)：都缺乏純化過(guò)程中降解蛋白的lon蛋白酶及ompT外膜蛋白酶。目的蛋白在這些菌株中的穩(wěn)定性要高于帶有這些蛋白酶的菌株，BL21(DE3)是用得最多的表達(dá)菌

E.coli宿主菌名稱特征用途抗性DH5α帶有recAendA突變的克隆菌株，由于DH5α具有deoR變異，可以作為較大質(zhì)粒的宿主菌使用。常用的質(zhì)粒抽提工程菌株,可用于藍(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。無(wú)BL21lon和ompT蛋白酶缺陷型用于PGEX載體構(gòu)建質(zhì)粒的蛋白表達(dá)無(wú)BL21(DE3)lon和ompT蛋白酶缺陷型，含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動(dòng)子下的T7RNA聚合酶基因用于含有T7的pET系列載體構(gòu)建質(zhì)粒的蛋白表達(dá)無(wú)BL21(DE3)-RP在BL21(DE3)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，具有額外拷貝的argU和proL基因解決了表達(dá)富含AT的基因組蛋白密碼子偏倚性問(wèn)題氯霉素BL21(DE3)-RIL在BL21(DE3)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，具有額外拷貝的argU、ileY和leuWtRNA基因解決了表達(dá)富含AT的基因組蛋白密碼子偏倚性問(wèn)題氯霉素BL21(DE3)-plysS帶有可以與pET共存的、編碼T7溶菌酶（T7RNA聚合酶的天然抑制物）的質(zhì)粒。pLysS菌株在被誘導(dǎo)前T7RNA聚合酶的基礎(chǔ)表達(dá)被抑制，這樣可以使表達(dá)會(huì)影響宿主細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的重組體在宿主中更穩(wěn)定。帶有pLacI質(zhì)粒的宿主菌產(chǎn)生額外的抑制pETBlue和pTriEx載體基礎(chǔ)表達(dá)的lac阻遏蛋白更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制，適合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表達(dá)。氯霉素BL21(DE3)-Rosetta-gami（Rosetta-gami）攜帶pRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG）稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平，又具有thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase(gor)兩條主要還原途徑雙突變菌株，顯著提高細(xì)胞中二硫鍵形成幾率，促進(jìn)蛋白可溶性及活性表達(dá)補(bǔ)充7種稀有密碼子，促進(jìn)蛋白可溶性及表達(dá)活性卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素Rosetta-Blue帶有recAendAlacIq突變的克隆菌株,高蛋白表達(dá),補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的AGG,AGA,AUA,CUA,CCC,GGA六種稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA。補(bǔ)充稀有密碼子，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平氯霉素表達(dá)條件優(yōu)化增加可溶性和折疊選擇大腸桿菌偏愛(ài)密碼子毒性基因及質(zhì)粒穩(wěn)定性合適載體與宿主菌組合表達(dá)條件優(yōu)化菌株適合啟動(dòng)子特性BL21tac、trc……(pGEX、pMal)適用于非T7啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)適用于T7、T7lac的表達(dá)系統(tǒng)，適用于非毒基因的表達(dá)BL21(DE3)pLysST7/T7lac(pET，pEASY)質(zhì)粒pLysS含有表達(dá)T7溶菌酶的基因，可結(jié)合T7RNA聚合酶，降低本底表達(dá)水平。適用于嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控毒基因的表達(dá)Rosetta(DE3)

Transetta(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)補(bǔ)充6種稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因，特別是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平OrigamiB(DE3)

TransB(DE3)T7/T7lac(pET，pEASY)具有thioredoxinreductase/glutathionereductase雙突變，有助于形成更多的二硫鍵，增加蛋白的可溶性。毒基因：基因表達(dá)產(chǎn)物——即目的蛋白，影響宿主生長(zhǎng)（“毒性”）

例1:載體對(duì)表達(dá)的影響pET32,BL21(DE3),表達(dá)的蛋白:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD)pET43,BL21(DE3),表達(dá)的蛋白:Nus-His6-STag-EK-IFN(MW78KD)誘導(dǎo)后破菌上清破菌沉淀誘導(dǎo)前誘導(dǎo)前誘導(dǎo)后破菌沉淀破菌上清破菌上清

例2:宿主菌對(duì)表達(dá)的影響B(tài)L21(DE3)trxB-trxB-

gor

-Tissueplasminogenactivator(tPA,9disulfidebonds)wasexpressedinthreedifferenthosts.10mgofsolubleproteinwasspottedontofibrinagaroseplatesandincubatedfor24hat37°C.ZoneofclearingmeasuresbiologicalactivityoftPA.pET32

例3:表達(dá)條件對(duì)表達(dá)的影響pET21,BL21(DE3)-RIL,表達(dá)的蛋白:His6-REIIBP(MW67KD)0.1mMIPTG,incubatefor16hat16℃0.1mMIPTG,incubatefor3hat37℃

NISP

NISPU:UninducedcrudeextractI:CrudeextractafterinducedS:Lysis

supertanantP:Lysisprecipitation大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究新進(jìn)展近幾年來(lái)，對(duì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究，已經(jīng)從最初的構(gòu)建不同的表達(dá)載體建立新的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移為完善現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)，解決表達(dá)系統(tǒng)中的各種缺陷，包括:采用RosettaTM(No-vagen)代替BL21菌株來(lái)增強(qiáng)含有E.coli稀有密碼子的重組蛋白的表達(dá)水平;采用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS以及BL21(DE3)pLysE(Invitrogen)彌補(bǔ)高濃度的胞內(nèi)酶環(huán)境對(duì)具有生物活性的目的蛋白在E.coli中表達(dá)的抑制等。最近幾年來(lái)，研究人員逐步將研究重點(diǎn)放在通過(guò)將一些具有活性的小蛋白與目的蛋白融合，進(jìn)而促進(jìn)目的蛋白在E.coli中的表達(dá)，或者通過(guò)改造某種現(xiàn)有的表達(dá)載體，通過(guò)將各種促溶標(biāo)簽與載體融合，進(jìn)而使得某些在E.coli中不表達(dá)的蛋白得以表達(dá)或使原本以包涵體形式表達(dá)的蛋白以可溶性形式表達(dá)。這些標(biāo)簽包括FLAG、MBP、GST、thioredoxin等。其他原核表達(dá)式系統(tǒng)乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)

乳酸菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，膜單一，在大量膜蛋白的表達(dá)方而提供了革蘭氏陰性菌無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，原因是革蘭氏陰性菌具有內(nèi)外膜并覆蓋著厚厚的、剛性的肚聚糖層的內(nèi)表而周質(zhì)空間影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，而蛋白在乳酸乳球菌中的表達(dá)是通過(guò)融合Mistic到目標(biāo)膜蛋白而加以改善，提高其表達(dá)量。芽袍桿菌表達(dá)系統(tǒng)

芽抱桿菌(Bacillus)也屬于革蘭氏陽(yáng)性菌。橋石短芽抱桿菌和枯草芽抱桿菌表達(dá)系統(tǒng)由Takara,MoBiTec公司開(kāi)發(fā)與提供。芽抱桿菌能過(guò)表達(dá)并且能分泌外源蛋白到培養(yǎng)基中，這適合分泌型蛋白的生產(chǎn)，如細(xì)胞因子或需要形成復(fù)雜二硫鍵的外源蛋白。真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)為了克服原核表達(dá)系統(tǒng)的不足，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入到真核基因調(diào)控領(lǐng)域?；蚬こ坛Ｓ玫恼婧吮磉_(dá)系統(tǒng)有:酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞酵母表達(dá)系統(tǒng)

酵母是一種低等的單細(xì)胞真核生物，它既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作等特點(diǎn)，同時(shí)又具有真核生物蛋白質(zhì)加工、折疊、翻譯后飾等的功能。目前工業(yè)生產(chǎn)中最重要的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)是酵母表達(dá)系統(tǒng)。優(yōu)越性：①蛋白可糖基化，有相對(duì)正確的天然結(jié)構(gòu)，可很好的生產(chǎn)分泌型蛋白；②表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中，實(shí)現(xiàn)高效率表達(dá)；③表達(dá)載體都為E.coli/PichiaPastoris的穿梭載體，可在獲得克隆后采用E.coli細(xì)胞大量擴(kuò)增。④易培養(yǎng)，成本低,可高密度發(fā)酵。缺點(diǎn)：①糖基化與哺乳動(dòng)物有所差別；②培養(yǎng)上清多糖濃度高，不利于純化。酵母表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展第37

頁(yè)釀酒酵母甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母粟酒裂殖酵母長(zhǎng)久以來(lái)被稱為真核生物中的“大腸桿菌”，最早應(yīng)用于酵母基因的克隆和表達(dá)。目前利用釀酒酵母為宿主細(xì)胞表達(dá)了多種外源基因，如乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細(xì)胞集落刺激因子、人血管抑制素等。1983年，美國(guó)Wegner等人最先發(fā)展了以甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母為代表的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)。甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母包括:畢赤酵母、漢森酵母、假絲酵母。以畢赤巴斯德酵母為宿主的外源基因表達(dá)系統(tǒng)近年來(lái)發(fā)展最為迅速，應(yīng)用也最為廣泛。酵母細(xì)胞中生理特性最接近高等生物的一種，其染色體結(jié)構(gòu)和功能，細(xì)胞循環(huán)的控制，RNA剪接蛋白表達(dá)分泌機(jī)制及翻譯后修飾等都與哺乳動(dòng)物細(xì)胞很相似。近年來(lái)，有學(xué)者提出它可能也是潛在的能有效表達(dá)真核膜蛋白的表達(dá)系統(tǒng).甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)，以PichiaPastoris應(yīng)用最多。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)模式載體甲醇氧化酶啟動(dòng)子A、目前已發(fā)現(xiàn)的、最強(qiáng)的真核啟動(dòng)子B、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控型啟動(dòng)子

AOX1：葡萄糖和甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo)

MOX：葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo)甲醇酵母的表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。這樣可以大大提高表達(dá)產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達(dá)外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達(dá)克級(jí)。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞，不會(huì)發(fā)生超糖基化。

近年來(lái)，用該表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)的蛋白達(dá)到了300多種，表達(dá)的蛋白主要包括基因工程疫苗，如乙肝疫苗及一些來(lái)自動(dòng)植物和細(xì)菌的各種酶、膜受體蛋白、抗原和抗體及一些用來(lái)研究晶體結(jié)構(gòu)的蛋白等。同時(shí)，該系統(tǒng)作為一種基礎(chǔ)研究的模型系統(tǒng)在分子生物學(xué)領(lǐng)域也發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用，如用該系統(tǒng)進(jìn)行過(guò)氧化物酶體的輸入和組裝及真核細(xì)胞的分泌途徑和功能等方面的研究。目前國(guó)內(nèi)也有多種蛋白在該系統(tǒng)中獲得了高效表達(dá)，如人白蛋白、人胰島素、干擾素、乙肝表面抗原、集落刺激因子等幾十種蛋白質(zhì)。昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是目前國(guó)內(nèi)外很推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)。依托桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子而構(gòu)建的表達(dá)載體，有效甚至高水平地使很多真核目的基因得到表達(dá)。利用重組桿狀病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞體系中表達(dá)外源蛋白是目前較為流行的表達(dá)方式。優(yōu)越性：①重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配；②可容納較大片段的外源DNA插入，因此是表達(dá)大片段DNA的理想載體；③可進(jìn)行分泌表達(dá)。缺點(diǎn)：①糖基化與哺乳動(dòng)物有所差別；②表達(dá)量有限；③作為藥物宿主細(xì)胞未被FDA認(rèn)可；

④培養(yǎng)成本高。2.昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒基因組：閉環(huán)雙鏈DNA，88-166kb表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BEVS）家蠶核型多角體病毒-家蠶表達(dá)系統(tǒng)宿主：鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、脈翅目、毛翅目的600多種昆蟲(chóng)克隆基因方法：轉(zhuǎn)移載體→共轉(zhuǎn)染→同源重組→空斑篩選→純化→重組病毒桿狀病毒載體的構(gòu)建發(fā)展3.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)表達(dá)系統(tǒng)

當(dāng)前，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)已成為生物藥物生產(chǎn)的重要技術(shù)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用于表達(dá)高活性的人源重組蛋白。優(yōu)越性：①糖基化與人源蛋白一致；②能表達(dá)天然結(jié)構(gòu)的完整蛋白，活性很高；③可進(jìn)行分泌表達(dá)。缺點(diǎn)：①表達(dá)量低；②培養(yǎng)成本很高，操作繁瑣。常用宿主細(xì)胞細(xì)胞名稱來(lái)源已投放產(chǎn)品BHK-21地鼠幼鼠腎凝血Ⅷ因子CHO-K1中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢tPA，Ⅷ因子，EPO，G-CSF等C127小鼠乳腺腫瘤GHMDCK長(zhǎng)耳狗腎臟獸用疫苗NamalwaBurkitt淋巴瘤病人的類淋巴母細(xì)胞EPO，LT，tPA，IFNVero成年非洲綠猴腎HBsAg，GH鼠骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤tPA，抗體COSSV40轉(zhuǎn)化的綠猴腎細(xì)胞CD34，CD69，TGF表達(dá)栽體哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體必須包含原核序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號(hào)等控制元件根據(jù)進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式，可將表達(dá)載體分為病毒載體與質(zhì)粒載體。病毒載體:是以病毒顆粒的方式，通過(guò)病毒包膜蛋白與宿主細(xì)胞膜的相互作用使外源基因進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。常用的病毒載體有SV40病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒桿狀病毒載體應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)在近幾年頗受重視，這是因?yàn)樗c其它病毒載體相比有特有優(yōu)勢(shì)，如可通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞大量制備病毒顆粒；可感染多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但在細(xì)胞內(nèi)無(wú)復(fù)制能力，生物安全度高；可插入高達(dá)38kb的外源基因等。

質(zhì)粒載體則是借助于物理或化學(xué)的作用導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)。依據(jù)質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)是否具有自我復(fù)制能力，可將質(zhì)粒載體分為整合型和附加體型載體兩類。整合型載體無(wú)復(fù)制能力，需整合于宿主細(xì)胞染色體內(nèi)方能穩(wěn)定存在，如SV40病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體和游離型如痘苗病毒、腺病毒載體。利用Sindbisvirus(SV)、ScmlikiForestvirus(sFV)和痘苗病毒載體感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白在結(jié)構(gòu)與功能上與天然哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒載體感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞獲得的外源蛋白占細(xì)胞總蛋白的；附加體型載體則是在細(xì)胞內(nèi)以染色體外可自我復(fù)制的附加體形式存在。整合型載體一般是隨機(jī)整合入染色體，其外源基因的表達(dá)受插入位點(diǎn)的影響，同時(shí)還可能會(huì)改變宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。相比之下，附加體型載體不存在這方面的問(wèn)題，但載體DNA在復(fù)制中容易發(fā)生突變或重排。 猴多瘤病毒DNA（SV40）

SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNASV40可以與所有哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的組蛋白H2、H3、H4結(jié)合，從而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。

SV40感染猴細(xì)胞時(shí)呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動(dòng)物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。SV40在裂解宿主細(xì)胞前的晚期狀態(tài)時(shí)，每個(gè)宿主細(xì)胞含有105個(gè)病毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效表達(dá)外源蛋白SV40的生物學(xué)特性SV40DNAoriVP2TVP3VP1tSV40DNA-質(zhì)粒DNA雜合載體的構(gòu)建

重組的SV40DNA分子必須經(jīng)過(guò)包裝后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。為了盡量提高SV40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細(xì)胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。AproriviralgenegptSV40oripV2-GPTpBR322pBR322SV40

pV2-GPT是一種SV40DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體，其中g(shù)pt為細(xì)菌來(lái)源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。該載體曾被成功地用于在猴腎細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的兔b-珠蛋白.人乳多瘤病毒DNA（BKV）

人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈DNA，感染宿主細(xì)胞后基因不發(fā)生整合，獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制，每個(gè)宿主細(xì)胞最高可達(dá)500個(gè)拷貝人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性人乳多瘤病毒表達(dá)載體的構(gòu)建BKV-E.coli

穿梭載體BKV

oriBKVgeneDREMMTPAp

rE.coli

oriSV40PNeor刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因，并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接，構(gòu)成穿梭載體，它不能整合，同時(shí)也不能形成成熟的病毒顆粒裂解受體細(xì)胞。安裝細(xì)胞色素P450dioxin介導(dǎo)的增強(qiáng)子DRE，控制小鼠乳腺癌啟動(dòng)子MMTP，由其帶動(dòng)外源基因的表達(dá)。SV40來(lái)源的啟動(dòng)子控制Neor

標(biāo)記基因，以G418篩選重組子。以此載體在人細(xì)胞系中表達(dá)b1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。利用SV40DNA載體表達(dá)外源基因的程序SV40載體病毒晚期基因啟動(dòng)子篩選標(biāo)記ori缺陷的SV40輔助病毒去除細(xì)菌序列插入外源基因重組分子分離病毒DNA轉(zhuǎn)化篩選增殖感染通過(guò)強(qiáng)化基因轉(zhuǎn)錄高效表達(dá)外源基因

在載體上安裝病毒或細(xì)胞來(lái)源的強(qiáng)啟Ap

rM13oriColE1oriCMVPPolylinkerGeneIntronSV40TPolyAsignal高效表達(dá)載體mRNA前體AAAAAAAAAmRNA動(dòng)子以及有效的翻譯元件，是使外源基因高效表達(dá)的一種手段，如：

細(xì)胞巨化病毒CMV的啟動(dòng)子

動(dòng)物珠蛋白基因的內(nèi)含子

SV40的終止子和polyA化信號(hào)序列

絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)型載體上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因?yàn)閙RNA前體的剪切能促進(jìn)成熟mRNA向胞質(zhì)的運(yùn)輸，有利于翻譯。有的還含有各種信號(hào)肽序列。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白的方式有兩種：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)是短期快速表達(dá)，滿足蛋白的小量制備。細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)能夠快速靈活的制備重組蛋白，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后1-4天內(nèi)即可收獲并進(jìn)行分析。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞系能夠滿足蛋白的大量、長(zhǎng)期生產(chǎn)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的是將外源基因整合到細(xì)胞自身基因組上，隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂外源基因可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)，同時(shí)經(jīng)過(guò)抗生素加壓篩選，最終得到能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白的細(xì)胞株。發(fā)展歷史1987年FDA批準(zhǔn)了基因泰克公司生產(chǎn)的組織型纖溶酶原激活劑（tPA）,世界上第一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備的重組蛋白質(zhì)藥物標(biāo)志著哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備重組蛋門時(shí)代的到來(lái)。經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展，哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備重組蛋白技術(shù)發(fā)生了巨大的變化。主要表現(xiàn)在:(1)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，由過(guò)去的7天延長(zhǎng)至21天；(2)細(xì)胞密度增加，過(guò)去：1-2X106細(xì)胞／毫升，現(xiàn)在：1-1.5X107細(xì)胞／毫升；

(3)產(chǎn)量增加，過(guò)去：10—20pg重組蛋白／細(xì)胞／天，50一100mg重組蛋白／升，現(xiàn)在：50-90pg重組蛋白／細(xì)胞／天，1-5g重組蛋白／升。

迄今為止，已有大約300種重組蛋白藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但在哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)的只有少數(shù)幾種：b

干擾素

g

干擾素凝血因子VIII 凝血因子IX促紅細(xì)胞生成素（EPO）

生長(zhǎng)因子（hGH）白介素2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原單克隆抗體 CD4受體組織型纖溶酶原激活劑（tPA）

利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體大多數(shù)惡性淋巴瘤細(xì)胞表面上都有一種特異性的糖蛋白campath，用人源化的小鼠抗campath抗體治療非霍金淋巴細(xì)胞瘤患者，效果良好。重組抗體采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達(dá)。Neor鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子b

肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子抗體輕鏈cDNAb

肌動(dòng)蛋白終止子pLdhfrSV40啟動(dòng)子b

肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子抗體重鏈cDNAb

肌動(dòng)蛋白終止子pH利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑

第一個(gè)由重組哺乳動(dòng)物dhfr啟動(dòng)子人tPA

cDNA終止子細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)的醫(yī)用蛋白是治療急性心肌梗塞的溶血栓藥物：人組織纖溶酶原激活劑（tPA）。同樣采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達(dá)，受體細(xì)胞選用CHO系統(tǒng)。目前，用該工藝路線生產(chǎn)的重組人tPA已經(jīng)商品化。信號(hào)肽編碼序列

此外，人tPA也可由重組大腸桿菌生產(chǎn)，但蛋白的重折疊效率低。利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子VIII

凝血因子VIII編碼基因的缺陷與血友病密切相關(guān)。多年來(lái)，血友病病人都是使用從人血中分離純化的凝血因子VIII生物制品進(jìn)行治療，然而由于人的血源污染乙肝病毒或愛(ài)滋病病毒，數(shù)千名使用這種血液制品的血友病人慘遭感染，其中10%的病人最終死于愛(ài)滋病而非血友病。早在上述情況發(fā)生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鑒定，血源的污染則加速了利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)該藥物的進(jìn)程。與tPA相似，人凝血因子VIII也是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子，必須通過(guò)重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)，但目前商品化了的重組人凝血因子VIII尚不能滿足幾代血友病人的大量需求。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以動(dòng)物個(gè)體為基因受體的基因表達(dá)技術(shù)，并由于這種外源基因的導(dǎo)入而產(chǎn)生可以遺傳的變異.這些遺傳改變包括：外源DNA至少整合到一條染色體上由于外源DNA的插入使任一基因發(fā)生改變由于外源DNA的插入使染色體發(fā)生重排有意識(shí)的導(dǎo)入可以持久存在的遺傳實(shí)體在各種器官和細(xì)胞中，乳腺組織可以進(jìn)行大規(guī)模的翻譯后修飾，并具有良好的滲透屏障。近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究已經(jīng)成為生物工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，一般用來(lái)高效、高質(zhì)量生產(chǎn)具有生物活性的蛋白。但多數(shù)研究表明，乳腺特異性表達(dá)的成功率很低，蛋白在乳汁中的表達(dá)水平較低。植物生物表達(dá)系統(tǒng)外源基因可以使用帶有分泌信號(hào)肽序列的植物體使重組蛋白分泌表達(dá)。利用植物做為生物反應(yīng)器生產(chǎn)的重組蛋白在折疊和組裝上與動(dòng)物細(xì)胞更為相似，從而具有與高等動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物基本一致的免疫原性和生物活性，并且不會(huì)存在被動(dòng)物、病原體污染的可能性。植物能夠表達(dá)來(lái)自動(dòng)物、細(xì)菌、病毒以及植物本身的蛋白質(zhì)易于大規(guī)模培