分子病理學技術講稿

關于分子病理學技術講稿第1頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第2頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第3頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月

器官病理學細胞病理學超微病理學免疫病理學分子病理學遠程病理學大體細胞超微結構分子基因病理學的進步是病理技術的進步第4頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月病理學技術包括：

傳統(tǒng)病理學技術和現(xiàn)代新技術

人體病理學技術和實驗病理學技術

第5頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月一免疫組織化學與免疫細胞化學第6頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月原理與方法

免疫組織與細胞化學（Immunohistochemistryandimmunocytochemistry）：

是在單克隆抗體技術產(chǎn)生后，利用免疫學原理，將抗原抗體反應應用與組織細胞化學而進一步通過級連放大，增加敏感性。最后用辣根過氧化物酶顯色。從而定位組織細胞中抗原（蛋白多肽、酶）等多種基因產(chǎn)物的特異方法。在病理學外檢工作中可用于對不同來源，HE難以診斷的的腫瘤進行確診和鑒別診斷。

基本原理：形成“抗原－抗體復合物”。第7頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月圖1：CK19陽性的BEL-7402細胞

圖2：OV-6陽性的HepG2細胞第8頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月肌動蛋白第9頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月雄激素受體第10頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月CD3-T細胞第11頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月雌激素受體（ER）第12頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫組織化學技術的主要步驟：

1．提取抗原(免疫原Immunogen);2．用免疫原免疫動物(兔)制備抗血清(多克隆抗體)或免疫動物(鼠)后，用雜交瘤技術制備單克隆抗體；3．純化抗體；4．抗體標記組織切片；5．染色反應；6．觀察結果。第13頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的抗體標記物：1．酶為最常用的標記物。作為標記的酶應具有以下條件：①底物是特異性的，且易于顯示；②酶反應產(chǎn)物穩(wěn)定，不易擴散；③容易獲得純酶分子且較穩(wěn)定；④酶標記抗體后，不影響兩者的活性；⑤被檢組織中不應存在內(nèi)源性相同的酶或其底物。常用的標記酶有辣根過氧化物酶（HRP）、鹼性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。2．熒光素指在高能量光波的激發(fā)下能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。常用的有異硫氰酸熒光素（FITC）、四甲基異硫氰酸羅達明（TRITC）。3．生物素其與卵白素的親和力明顯高于抗原抗體的結合力。4．金屬標記物如鐵蛋白和膠體金。多用于免疫電鏡。第14頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月三．常用免疫組織化學染色方法（一）直接法將熒光素(免疫熒光法)或酶直接標記在第一抗體上，以檢查相應的抗原。直接法具有特異性強的優(yōu)點，但敏感性差，耗費抗體多。第15頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）間接法先用熒光素或酶標記第二抗體，一抗為特異性抗體，二抗僅有種族特異性。特點:⑴預先標好二抗，較方便；⑵比直接法敏感，但仍差。第16頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）PAP法與雙PAP法：既過氧化物酶抗過氧化物酶復合物法(PerixidaseAntiperoxidaseComplexMethod,PAP)先將過氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗ＨＲＰ；然后再與ＨＲＰ結合，形成一個穩(wěn)定的多角形結構（PAP）。特點：⑴敏感性較高；⑵背景染色低（相對）；⑶雙PAP敏感性更高，但背景相對較重。第17頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）ABC法：既卵白素－生物素過氧化物酶復合物法(AvidinBiotin-peroxidaseComplex,ABC)利用卵白素與生物素特有的高度親和力，先將生物素與酶結合形成生物素化HRP，再以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成一個復合物；同時先將二抗生物素化。１．如將卵白素換成鏈霉親和素，則為：ＳＡＢＣ法：(StreptAvidinBiotin-peroxidaseComplex)２．將鏈霉親和素和生物素先連結起來，則稱：ＬＳＡＢ法：labelledStreptAvidin-Biotin３．用鏈霉素抗生物素蛋白連結辣根過氧化物酶，則為：Ｓ－Ｐ法：(StreptAvidinPeroxidaseconjugataedmethod)若用堿性磷酸酶標記鏈霉卵白素則稱ＳＡＰ法。若分別用堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，則稱ＤＳ法特點:⑴敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍）；⑵背景淡，鏈霉親和素更好；⑶方法較簡便，時間較短；⑷應用范圍廣，也可用于原位雜交和免疫電鏡。

第18頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月四．免疫組織化學染色過程中需注意的有關事項

１．正確設置免疫組織化學的對照

對照原則：首先對照第一抗體；替代對照要注意相同的原則；陽性結果陰性對照，陰性結果陽性對照；染色清晰，定位準確。陰性對照：（１）空白對照：用ＰＢＳ置換第一抗體；（２）血清替代對照：用同種動物的正常血清代替第一抗體；陽性對照：用已知或已被實驗證明為陽性的組織；自身對照：利用組織切片內(nèi)的各種不同的組織成分作對照。第19頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月2．假陽性反應：⑴非特異性反應：邊緣現(xiàn)象、皺折和刀痕、出血和壞死等；⑵內(nèi)源性過氧化物酶：紅細胞、炎細胞、退變壞死細胞和某些腺上皮分泌物，以及某些富含過氧化物酶的組織，如腦、肝等；⑶抗體的交叉反應：抗體本身含有與人體組織發(fā)生交叉反應的成分；⑷試劑濃度過高或失效。第20頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月3．假陰性反應：

⑴組織固定不當或固定時間過長；⑵抗體效價過低或久置失效；⑶組織中抗原被粘稠基質(zhì)或分泌物阻隔；⑷DAB或H2O2的濃度不當。第21頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月五、免疫組織化學在腫瘤診斷和鑒別診斷中的應用

（一）在腫瘤診斷中應用免疫組織化學染色的原因：１在常規(guī)病理活檢中,通常有５～１０％的疑難病例不能明確診斷。２形態(tài)結構相似的腫瘤可為不同的組織來源（如未分化癌和惡性淋巴瘤）因而難于識別，給治療帶來困難。３一些轉移性腫瘤常常缺乏特有的組織學特征，因而無法確定其原發(fā)病灶（如甲狀腺癌和前列腺癌）。４通過一些反映細胞增殖和與腫瘤惡性程度有關的標記物協(xié)助識別腫瘤的良惡性。第22頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）各種不同組織及其腫瘤常見的標記物：

1．上皮組織及其腫瘤標記物：（１）存在于所有上皮細胞內(nèi)的標記物：細胞角蛋白（Cytokeratin,ＣＫ）：一種中間絲蛋白（２）存在于大部分上皮細胞內(nèi)的標記物：①角蛋白多肽（如ＣＫ１９）；②上皮細胞膜抗原（epithelialmembraneantigen,ＥＭＡ）。（３）選擇性存在于某些上皮細胞內(nèi)的標記物：①癌胚抗原（ＣＥＡ）；②甲胎蛋白（ＡＦＰ）；③前列腺特異性抗原（ＰＳＡ）及激素類等。第23頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月2．間葉組織（軟組織）及其腫瘤標記物：

（１）間葉源性腫瘤：波形蛋白（Vimentin）；（２）纖維組織源性腫瘤：纖維瘤、肉瘤，惡纖組。①抗胰蛋白酶（α1—ＡＴ，ＡＡＴ）；②抗胰糜蛋白酶（α—ＡＣＴ，ＡＣＴ）；③溶菌酶（Lysozyme）。第24頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月3．肌細胞及肌上皮腫瘤及其標記物：肌瘤、肌肉瘤、肌上皮瘤。⑴結蛋白（Desmin），最常用，肌細胞分化最早的標記；⑵肌動蛋白（Actin），屬肌絲蛋白，６種亞型分別存在于不同的肌細胞、肌上皮細胞⑶肌球蛋白（Myosin），屬肌絲蛋白，分Ⅰ型（慢）和Ⅱ型（快）收縮纖維，存在于心肌、橫紋肌及平滑肌中，肌動蛋白和肌球蛋白均出現(xiàn)在肌細胞發(fā)育分化中期。⑷肌紅蛋白（Myoglobin），是心肌和橫紋肌結合氧的肌紅蛋白，存在于分化成熟的橫紋肌中。第25頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月４．內(nèi)皮細胞腫瘤及其標記物：血管內(nèi)皮肉瘤⑴第Ⅷ因子相關抗原（FactorⅧ-relatedAntigen,Ｆ８）⑵荊豆凝集素（UlexEuropaeus－1Lectin,ＵＥＡ－１）；⑶ＢＭＡ２００、ＣＤ３１、ＣＤ３４等。第26頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月５．骨、軟骨和脂肪組織腫瘤及其標記物：

⑴Ｓ－１００，Vimentin陽性；⑵Lysozyme少數(shù)陽性。第27頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月６．滑膜及間皮腫瘤及其標記物：雙向分化，無特異性標記物。Keratin,EMA;Vimentin,FN,AAT,ACT,Lysozyme等均有可能陽性。第28頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月７．周圍神經(jīng)腫瘤及其標記物：

⑴S-100：神經(jīng)纖維腫瘤，神經(jīng)鞘腫瘤。⑵髓性堿性蛋白（Myelinbasicprotein,MBA）；⑶髓鞘相關蛋白（MAG）；⑷層粘連蛋白（Laminin）。第29頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月8．淋巴造血組織腫瘤及其標記物：(１)LCA（LeucocyteCommonAntigen，白細胞共同抗原）；(２)CD19，CD25，CD20－－標記Ｂ淋巴細胞；(３)CD4，CD8，CD3－－標記Ｔ淋巴細胞；(４)ＭＡＣ３８７、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ－－標記組織細胞；(５)ＣＤ１５、ＣＤ３０（Ki-antigen）－－標記Ｒ－Ｓ細胞；(６)CD11，CD14－－標記單核細胞、粒細胞。第30頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月9．神經(jīng)及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤及其標記物：（１）膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glialfibrillaryacidicprotein,ＧＦＡＰ）：膠質(zhì)細胞、室管膜細胞；（２）髓鞘堿性蛋白（ＭＢＰ）：少突膠質(zhì)細胞；（３）神經(jīng)細胞烯醇化酶（Neurunspecificenolosa,ＮＳＥ）：神經(jīng)細胞；（４）神經(jīng)微絲（Neurofilaments,ＮＦ）神經(jīng)細胞、嗜鉻細胞、副節(jié)細胞、ＡＰＵＤ瘤；（５）嗜鉻素Ａ（ChromograninＡ）：神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。（６）其它：ＡＣＴＨ、Calcitotin、Gastrin、Glucagon、hGH、Insulin、Serotonin等。第31頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫組織化學最突出的優(yōu)點：能在原位確定組織及細胞結構的化學成分。深入---------原位分子雜交和免疫電鏡。第32頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月電子顯微鏡技術電子顯微鏡（electronmicrosocope）簡稱電鏡，是以電子束為照明源，通過電子流對生物樣品的透射以及電磁透鏡的多級放大后的熒光屏上成像的大型精密儀器。按工作原理和用途的不同可分為透射式電鏡（transmissionelectronmicroscope,TEM）和掃描式電鏡（scanningelectronmicroscope,SEM）二種基本類型。第33頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月圖白藜蘆醇處理Jurkat細胞超微結構

第34頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月一．透射式電鏡

主要用于觀察細胞內(nèi)部的微細結構，由于電子的穿透力較弱，故用于透射電鏡觀察的標本必須切成50~100nm的超薄切片。換句話說，一個細胞要被切成100~200個薄片才適于在透射電鏡下觀察。樣品在被超薄切片之前，一般要經(jīng)過固定、脫水和包埋等處理，在切片之后還要經(jīng)過染色等處理才能進行觀察。第35頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月超薄切片術（techniquesofultrathinsection）是最基本的電鏡樣品制備技術，其基本過程同石蠟切片大體相似，包括取材、固定、漂洗、脫水、滲透與聚合、切片和染色等多個環(huán)節(jié)，但操作過程比石蠟切片更為細致與復雜。為了獲得理想的超薄切片，操作者必須認真對待每一步驟，任何環(huán)節(jié)的疏忽都可能導致制樣的失敗。第36頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月合格的超薄切片樣品應該達到以下基本要求：（1）切片的厚度應在50nm左右，不能超過100nm，以獲得較高的分辨率和較高的反差；（2）切片應能耐受電子束的強烈照射而不發(fā)生破裂、變形；（3）細胞超微結構保持良好，沒有明顯的物質(zhì)凝聚和丟失。第37頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月電子顯微鏡技術：細胞內(nèi)的細胞器、細胞骨架或大分子水平的變化。細胞內(nèi)的病毒顆粒等。

腫瘤鑒別診斷病毒包涵體腎炎的分型

第38頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月二．掃描電鏡

掃描電子顯微鏡就是用聚得很細的電子束流照射要檢測的樣品表面。由于電子束與樣品的相互作用產(chǎn)生各種信息然后通過不同的檢測器接收相應的信息，經(jīng)過處理后顯示出樣品的各種特征。

掃描電鏡具有以下特點：能夠直接觀察樣品的表面的結構；樣品制備過程簡單，不用切成超薄切片；可以從各種角度對樣品進行觀察；景深大，圖像富有立體感；圖像的放大范圍廣，分辨率也比較高；電子束對樣品的損傷與污染程度較??；在觀察形貌的同時，還可利用從樣品發(fā)出的其他信號作微區(qū)成分分析。第39頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月掃描電鏡：血管破裂第40頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月掃描電鏡：小腸微絨毛第41頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)生物芯片技術

生物芯片技術（biochiptechnology）是將大量具有生物識別功能的分子或生物樣品有序地點陣排列在支持物上并與標記的檢體分子同時反應或雜交，通過放射自顯影、熒光掃描、化學發(fā)光或酶標顯示可獲得大量有用的生物信息的新技術。生物芯片技術包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細胞芯片、組織芯片、以及元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片?？蓪NA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)、細胞、組織以及其它生物成分進行高效快捷的測試和分析。第43頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月一、基因芯片基因芯片(genechip)是指采用原位合成或顯微打印方法，將大量DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號來實現(xiàn)對生物樣品快速、并行、高效地檢測?？勺詣?、快速地檢測出成千上萬個基因的表達情況，為基因診斷、藥物篩選以及新基因發(fā)現(xiàn)提供了有力的手段。第44頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月圖基因芯片第45頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月二、蛋白芯片

蛋白芯片技術的基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測用的芯片，然后，用標記了特定熒光素的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，經(jīng)漂將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補結合的成分洗去，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃可描技術，測定芯片上各點的熒光強度，通過熒光強度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關系，由此達到檢測多種蛋白質(zhì)及其功能的目的。如抗體芯片可排列數(shù)百種單克隆抗體，通過這張芯片，人們在一次實驗中就能夠比較幾百種蛋白的表達變化。對于診斷疾?。喝鐐魅静?、腫瘤、遺傳病等臨床工作以及信號傳導、細胞周期調(diào)控、細胞結構、細胞凋亡和神經(jīng)生物學等基礎研究都具有廣泛的應用前景第46頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月三、組織芯片

織芯片又稱組織微列陣（tissuemicroarray）是將數(shù)十個數(shù)百個乃至上千個小的組織片整齊的排列在一起到載玻片,形成微縮的組織切片。

其特點有:1.體積小信息含量高.可根據(jù)不同需要進行組合和設計;2.即可用于形態(tài)學觀察也可用于免役組織化學染色.原位雜交,FISH等原位組織細胞學觀察和研究.3.高效快速,低消耗,自身內(nèi)對照和可比性強,節(jié)時、省力、少材、高效利用庫存蠟塊腫瘤標本的新方法。一個蠟塊可連續(xù)切片200張，以供原位分析腫瘤相關基因DNA及其表達的mRNA和蛋白質(zhì)，熒光原位分子雜交（FISH），mRNA原位雜交、免疫組化三種方法可同時在一個芯片蠟塊的連續(xù)組織芯片中應用。因而可提高實驗效率，一張組織芯片上可列陣數(shù)十至數(shù)百個樣本。實驗條件最大程度上保持一致，有助于減少實驗誤差，一個組織芯片蠟塊可連續(xù)切200張片，進行許多分子標記檢測。最大限度地利用有限的標本資源，尤其是少見的病例標本，最小破損原有蠟塊?？赏瑫r檢測一種腫瘤不同階段的基因表達狀況。能在一張片上同時看到一個腫瘤組織在原位、轉移、復發(fā)中的基因擴增情況。第47頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月六激光顯微切割術

顯微切割（Lasermicro-desection）就是在顯微鏡下用手工或儀器采樣的方法從組織切片或細胞涂片上將所要研究的形態(tài)或表型相同的細胞從組織三維構造中分離出來，獲得純的細胞群（purecellpopulation），以備進一步作分子水平的研究。微切割技術的貢獻就是克服了組織的細胞成分非常繁雜這一重大的缺點。第48頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月圖激光顯微切割儀

第49頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月一、微切割的方法

1．材料來源

組織切片冰凍切片培養(yǎng)細胞細胞涂片第50頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月二、微切割后的細胞處理

1．DNA提取

如果所獲細胞數(shù)量在105以上，則可用常規(guī)的方法提取DNA。2．RNA提取3.蛋白提取第51頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月三、微切割的應用

1．細胞基因突變及微衛(wèi)星變異的研究2．細胞基因拷貝數(shù)的變化和甲基化水平的檢測3．定量RT-PCR4．比較基因組雜交5．cDNA微陣列（芯片）第52頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月七原位分子雜交

原位核酸分子雜交（insituhybridization,ISH）是應用特定標記的已知核酸探針與組織或細胞中待測的核酸按堿基配對的原則進行特異性結合，形成雜交體，雜交后的信號可以在光鏡或電鏡下進行觀察。由于核酸分子雜交的特異性強、敏感性高、定位精確、定量可能，因此該技術已廣泛應用于生物學、醫(yī)學等各個領域的研究之中。第53頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月圖食管癌腫瘤細胞c-fosmRNA原位雜交圖片

第54頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月八熒光原位分子雜交染色體分析技術

染色體原位分子雜交技術（ChromsomeAnalysisbyFluorescenceinsituHybridization）的發(fā)展為研究染色體上DNA的序列提供了一個最直接的方法。具有經(jīng)濟、安全、快速、穩(wěn)定，靈敏度高，多色彩FISH可在同一核內(nèi)顯示兩種或多種序列，還可對間期核染色體進行研究；應用不同的探針可顯示某一物種的全部基因，某一染色體染色片段及單拷貝序列；結合共焦激光顯微鏡可對間期核及染色體進行三維結構研究，精確檢測雜交信號優(yōu)點。第55頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月組織切片間期染色體熒光原位雜交

第56頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月3．FISH基因定位（FISHmapping）基因定位時，不但需要確定某段靶序列在染色體上的位置，尚需確定兩個或兩個以上靶序列在線性DNA分子的排列次序和距離，才能繪出基因圖。一般用同位素雜交：先確定每一靶序列在中期染色體上的位置，然后根據(jù)它們到端粒的距離確定出線形排列次序。而用FISH方法，兩種或兩種以上的探針能同時與中期染色體雜交，只要根據(jù)兩種顏色雜交位點的相互位置，就能直接確定次序。但中期染色體是線形DNA分子經(jīng)過折疊和包裝后形成的，若兩個靶序列相距很近，例如間距小于1Mbp，受包裝過程的影響，它們在線形DNA分子上的排列與在中期染色體上的排列不一定相同，甚至可能完全相反。學者們發(fā)現(xiàn)，靶序列之間在間期核的平均相對距離與它們在線形DNA分子上的距離呈正相關。利用間期核FISH分析不但能排除染色體包裝的影響，還能提高測距的分辨率。

第57頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月圖食管癌細胞單條染色體涂染熒光原位分子雜交，用BAC位點探針特異位點定位BACFISH第58頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月四、FISH的應用

1．基因定位與基因制圖（Genemapping）

FISH已經(jīng)極大地加速了人類基因定位和基因制圖的進程。第59頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月2．基因診斷(Genediagnosis)

精確、直觀、明了第60頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月4．FISH在腫瘤生物學中的應用（1）腫瘤細胞遺傳學（Onco-cytogenetics）（2）基因定位：FISH可用于分離出的癌基因與抑癌基因初步定位（3）病毒基因插入基因組部分的檢測：雖然逆轉錄病毒以激活原癌基因為主，也有象腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白產(chǎn)物與抑癌基因蛋白產(chǎn)物相互作用而誘導細胞轉化。但病毒基因特別是