多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 教案

------------------------------------------------------------------------多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段教案《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段》教學(xué)設(shè)計(jì)教學(xué)目標(biāo)（一）知識與技能1、了解PCR技術(shù)的基本操作2、理解PCR的原理3、討論P(yáng)CR的應(yīng)用（二）過程與方法在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段的實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)避免外源DNA污染，嚴(yán)格控制溫度等反應(yīng)條件（三）情感、態(tài)度與價(jià)值觀通過對PCR實(shí)驗(yàn)的操作及結(jié)果分析，培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和實(shí)事求是的科研精神教學(xué)重難點(diǎn)教學(xué)重點(diǎn)：PCR的原理和PCR的基本操作教學(xué)難點(diǎn)：PCR的原理教學(xué)工具多媒體教學(xué)過程（一）引入新課在現(xiàn)代生物技術(shù)中，DNA技術(shù)可謂是尖端技術(shù)。人類基因組計(jì)劃、基因工程、基因診斷、基因檢測、古生物鑒定等都離不開對DNA分子堿基序列的分析。而分析DNA堿基序列，就需要一定量的DNA片段。怎樣迅速獲得足夠量的DNA片段呢？今天我們來研究學(xué)習(xí)DNA分子的擴(kuò)增技術(shù)――PCR技術(shù)。（二）進(jìn)行新課1．基礎(chǔ)知識PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA的過程，與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程類似：1．1細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析：1．2細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程（1）DNA的反向平行結(jié)構(gòu)：（結(jié)合投影圖）核苷酸分子的結(jié)構(gòu)與方向性：（分子結(jié)構(gòu)模式圖）由核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長鏈：（模式圖，體現(xiàn)方向性）。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的反向平行結(jié)構(gòu)：（2）DNA的復(fù)制過程:解旋：解旋酶、ATP，DNA兩條鏈打開，，形成兩條DNA單鏈。引物結(jié)合：在DNA單鏈3’端與DNA反向配對結(jié)合，確保引物3’端與DNA單鏈準(zhǔn)確配對。DNA聚合酶結(jié)合：子鏈合成：DNA聚合酶從引物3’端開始，將配對的脫氧核苷酸連接起來。后續(xù)加工：DNA聚合酶I將引物切去，并合成空缺處的DNA單鏈，再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來（半不連續(xù)合成。先導(dǎo)鏈，滯后鏈）子鏈合成特點(diǎn)：不能從頭合成；合成方向?yàn)椤?’→3’合成”。感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成，還具有校對功能。它在每引入一個(gè)核苷酸后都要復(fù)查一次，只有堿基配對無誤后才能繼續(xù)往下聚合，它不能從頭合成。RNA聚合酶沒有校對功能，因此RNA的合成不需要引物，而是從頭合成的，它的錯(cuò)配可能性較大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I刪去，代之以高保真的DNA鏈。［思考］DNA分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些？DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供模板；堿基互補(bǔ)配對；DNA聚合酶的復(fù)查功能。［思考］細(xì)胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的？RNA合成、蛋白質(zhì)合成。1．3DNA分子復(fù)制的人工控制解開螺旋：在80～100℃時(shí)，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性?；謴?fù)螺旋：在50℃左右時(shí)，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)性。復(fù)制條件：緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷酸,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,兩種引物。反應(yīng)場所：PCR儀（自動(dòng)溫度周期性調(diào)節(jié)）。［思考］緩沖液相當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的什么成分？（核基質(zhì)）1．4PCR的反應(yīng)過程變性：在95℃時(shí)DNA解旋復(fù)性：在50℃時(shí)引物與DNA單鏈結(jié)合延伸：在72℃時(shí)合成DNA子鏈（兩個(gè)引物間的序列）2．實(shí)驗(yàn)操作2．1PCR反應(yīng)體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物，水2．2實(shí)驗(yàn)操作步驟2．3按照PCR反應(yīng)體系配方配制反應(yīng)液；（2）將PCR反應(yīng)體系50μL用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5mL）中；（3）將微量離心管放到PCR儀中；（4）設(shè)置PCR儀的工作參數(shù)。（5）DNA在PCR儀中大量擴(kuò)增。2．4水浴法：將微型離心管依次在95℃、55℃、72℃的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應(yīng)時(shí)間。3．實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)3．1避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。3．2緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存。3．3每添加一種反應(yīng)成分，更換一個(gè)移液器的槍頭。3．4混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。4．結(jié)果分析與評價(jià)4．1反應(yīng)液稀釋：取2uLPCR反應(yīng)液，添加98uL蒸餾水；2．分光光度計(jì)調(diào)零：將100uL蒸餾水添加到比色杯中，在260nm處將分光光度計(jì)調(diào)整讀數(shù)為零。4．2將100uL反應(yīng)稀釋液倒入比色杯中，測定在260nm處的光吸收值。4．3計(jì)算：DNA含量＝50×光吸收值×稀釋倍數(shù)課后小結(jié)課后習(xí)題1．DNA分子復(fù)制時(shí)，解旋的兩條鏈中（）A僅一條作為復(fù)制模板B兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)不同的DNA分子C兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)相同的DNA分子D兩條鏈作為模板，各自合成一條子鏈，然后兩條母鏈重新結(jié)合為原來的雙螺旋分子，兩條新鏈結(jié)合成一個(gè)全新的DNA分子2.下列關(guān)于DNA復(fù)制過程的正確順序是（）①互補(bǔ)堿基對之間氫鍵斷裂②互補(bǔ)堿基對之間形成氫鍵③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母鏈為模板進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對⑤子鏈與母鏈盤旋成雙螺旋狀結(jié)構(gòu)A①③④②⑤B①④②⑤③C①③⑤④②D③①④②⑤3.下列各項(xiàng)過程中，遵循“堿基互補(bǔ)配對原則”的有（）①DNA復(fù)制②RNA復(fù)制③轉(zhuǎn)錄④翻譯⑤逆轉(zhuǎn)錄A①②③④⑤B①②③④C①②③⑤D①③④⑤4.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬生物體DNA的復(fù)制必需的一組條件是（）①酶②游離的脫氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦適宜的溫度⑧適宜的酸堿度A①②③④⑤⑥B②③④⑤⑥⑦C②③④⑤⑦⑧D①②③