七發(fā)酵過程的調(diào)控

酶制劑生產(chǎn)技術(shù)

模塊二酶的發(fā)酵生產(chǎn)生物化工學院蘭欣引入同學們,上節(jié)課我們學習了發(fā)酵工藝流程中最為基本的消毒滅菌與無菌操作（回顧）。接下來介紹發(fā)酵過程中的調(diào)控。學習情境七

發(fā)酵過程的調(diào)控工作任務（一）酶的發(fā)酵動力學工作任務

（二）pH﹑溫度與通氣等因素的調(diào)控大型空氣壓縮機180M3發(fā)酵罐車間發(fā)酵控制生產(chǎn)車間計算機控制室杯式補料系統(tǒng)

工作任務（一）酶的發(fā)酵動力學

研究對象：菌體生長、基質(zhì)消耗、產(chǎn)物生成三者間的動態(tài)平衡及內(nèi)在規(guī)律。研究目的：為最佳發(fā)酵條件控制提供依據(jù)。同步合成型（生長偶聯(lián)型），其生物合成伴隨著細胞的生長而開始；在細胞進入旺盛生長期時，酶大量生成，生長進入平衡期時，酶合成停止延續(xù)合成型：細胞生長進入平衡期后酶可延續(xù)合成

中期合成型：細胞生長一段時間后合成，進入平衡期后終止滯后合成型：細胞生長一段時間或進入平衡期后大量生成并大量積累在酶的工業(yè)生產(chǎn)中，為了提高酶產(chǎn)率和縮短發(fā)酵周期,最理想的酶合成模式是延續(xù)合成型；對于其它類型的酶,要在菌種選育和工藝條件上加以調(diào)節(jié)；對于同步合成型，盡量提高mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度;對于滯后合成型,盡量減少阻遏物；對于中期合成型，要從提高mRNA穩(wěn)定性和解除阻遏兩方面進行。微生物的生長（一）、微生物群體生長的規(guī)律任何生物都有出生、發(fā)育、繁殖、衰老和死亡的過程。微生物也不例外。研究微生物的生長規(guī)律通常以什么為研究對象？以個體為研究對象來研究微生物，會有什么難度？生長不明顯持續(xù)時間短生長和繁殖交替進行，界限難以劃清細菌種類培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度（℃）代時（分）大腸桿菌牛奶3712.5蠟樣芽孢桿菌肉湯3018枯草芽孢桿菌肉湯2526-32乳酸鏈球菌牛奶3726金黃色葡萄球菌肉湯3727-30褐球固氮菌葡萄糖25240漂游假單胞桿菌合成培養(yǎng)基279.8研究步驟：人工培養(yǎng)—定期取樣—測定生長研究方法以細菌為例將少量同種細菌接種到液體培養(yǎng)基中容積恒定定期檢測培養(yǎng)基中細菌群體的生長情況于適宜條件下培養(yǎng)如何測定？以群體為研究單位微生物群體數(shù)量的測定方法測數(shù)目測重量例待測樣品1ml,稀釋100倍后,取1ml稀釋液與1ml含有紅細胞1000個的液體混合均勻,顯微鏡下隨機選若干個視野計數(shù),得出細菌個數(shù)與紅細胞個數(shù)比為5:1,則待測樣品中含細菌多少個？稱干重：一般干重為濕重的10～20%。將待測培養(yǎng)液放入離心管中，清水離心洗滌1～5次后，干燥處理，然后稱干重。一個細胞（細菌）一般重約10－12～10－13g。5×105個細菌的生長曲線1.調(diào)整期2.對數(shù)期3.穩(wěn)定期4.衰亡期生長特點成因菌體特征應用及其它調(diào)整期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期不立即繁殖繁殖速度最快出生率等于死亡率,活菌數(shù)最大,代謝產(chǎn)物大量積累死亡超過繁殖適應新環(huán)境條件適宜生存條件開始惡化生存條件極度惡化代謝活躍,體積增長較快個體形態(tài)和生理特性穩(wěn)定有些種類出現(xiàn)芽孢出現(xiàn)畸變與菌種和培養(yǎng)條件有關(guān)生產(chǎn)用菌種科研材料改善和控制條件,延長穩(wěn)定期細胞裂解釋放產(chǎn)物細菌群體生長的四個時期微生物生長曲線的實踐意義處于對數(shù)期的細菌，生長繁殖速率快，代謝旺盛進入穩(wěn)定期后，抗生素等代謝產(chǎn)物逐漸增多生產(chǎn)上常用這個時期的細菌作為菌種，以縮短生產(chǎn)周期。

如果適當補充營養(yǎng)物質(zhì)，就有助于延長穩(wěn)定期、提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量

微生物連續(xù)培養(yǎng)裝置21工作任務

（二）pH﹑溫度與通氣等因素的調(diào)控

培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。為了維持培養(yǎng)基pH的相對恒定，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑，或在進行工業(yè)發(fā)酵時補加酸、堿。通常培養(yǎng)條件：細菌與放線菌：pH7~7.5酵母菌和霉菌：pH4.5~6范圍內(nèi)生長1.pH值的控制細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH值與生長最適pH值往往有所不同。細胞生產(chǎn)某種酶的最適pH值通常接近于該酶催化反應的最適pH值。有些細胞可以同時產(chǎn)生若干種酶，在生產(chǎn)過程中，通過控制培養(yǎng)基的pH值，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。22通常在生物學范圍內(nèi)每升高10℃，生長速度就加快一倍，2.溫度的控制有些細胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與細胞生長最適溫度有所不同，而且往往低于生長最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所對應的mRNA的穩(wěn)定性，增加酶生物合成的延續(xù)時間，從而提高酶的產(chǎn)量。枯草桿菌的最適生長溫度為34～37℃黑曲霉的最適生長溫度為28～32℃233.溶解氧的控制在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，處于不同生長階段的細胞，其細胞濃度和細胞呼吸強度各不相同，致使耗氧速率有很大的差別。因此必須根據(jù)耗氧量的不同，不斷供給適量的溶解氧。

一般說來，通氣量越大、氧氣分壓越高、氣液接觸時間越長、氣液接觸面積越大，則溶氧速率越大。培養(yǎng)液的性質(zhì)，主要是黏度、氣泡、以及溫度等對于溶氧速率有明顯影響。調(diào)節(jié)通氣量調(diào)節(jié)氧的分壓調(diào)節(jié)氣液接觸時間調(diào)節(jié)氣液接觸面積改變培養(yǎng)液的性質(zhì)控制溶解氧方法大型發(fā)酵罐攪拌裝置通氣攪拌解決了液體深層培養(yǎng)時的供氧問題。254、提高酶產(chǎn)量的措施

A添加誘導物對于誘導酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵過程中的某個適宜的時機，添加適宜的誘導物，可以顯著提高酶的產(chǎn)量。例如，乳糖誘導β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導蔗糖酶的生物合成等。誘導物一般可以分為3類

酶的作用底物酶的催化反應產(chǎn)物作用底物的類似物1)通過條件控制提高酶產(chǎn)量B控制阻遏物的濃度阻遏作用根據(jù)機理不同，可分為：產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。1.產(chǎn)物阻遏作用是由酶催化作用的產(chǎn)物或者代謝途徑的末端產(chǎn)物引起的阻遏作用。2.分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過分解代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)）引起的阻遏作用?？刂谱瓒粑锏臐舛仁墙獬瓒?、提高酶產(chǎn)量的有效措施。

為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應當控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度。27采用其他較難利用的碳源，如淀粉等采用補料、分次流加碳源添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP）對于受代謝途徑末端產(chǎn)物阻遏的酶，可以通過控制末端產(chǎn)物的濃度的方法使阻遏解除。28C添加表面活性劑表面活性劑可以與細胞膜相互作用，增加細胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。

將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、

(Triton)等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產(chǎn)量增加。由于離子型表面活性劑對細胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑是消毒劑，對細胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中添加到培養(yǎng)基中。29D添加產(chǎn)酶促進劑

產(chǎn)酶促進劑是指可以促進產(chǎn)酶、但是作用機理未闡明清楚的物質(zhì)。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1～20倍；添加聚乙烯醇（Polyvinylalcohol）可以提高糖化酶的產(chǎn)量。產(chǎn)酶促進劑對不同細胞、不同酶的作用效果各不相同，現(xiàn)在還沒有規(guī)律可循，要通過試驗確定所添加的產(chǎn)酶促進劑的種類和濃度。

在用葡萄糖和乳糖作碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌，開始時，大腸桿菌只能利用葡萄糖而不能利用乳糖，只有當葡萄糖被消耗完畢以后，大腸桿菌才開始利用乳糖。分解葡萄糖的酶是大腸桿菌細胞內(nèi)一直存在的酶——組成酶思考：這樣有什么意義？分解乳糖的酶是在乳糖誘導下合成的酶——誘導酶

實例１抑制葡萄糖中間產(chǎn)物α-酮戊二酸谷氨酸

實例2：

谷氨酸棒狀桿菌合成谷氨酸的途徑谷氨酸脫氫酶NH4+分析：１、兩實例的共同點是：２、由兩實例區(qū)別得出：微生物代謝調(diào)控主要是通過酶的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的實例１，通過調(diào)節(jié)酶的合成，控制代謝過程實例２，通過調(diào)節(jié)酶的活性，控制代謝過程抑制葡萄糖中間產(chǎn)物α-酮戊二酸谷氨酸谷氨酸棒狀桿菌合成谷氨酸的途徑谷氨酸脫氫酶NH4+思考：要想提高谷氨酸的產(chǎn)量，可以采取什么措施?控制生產(chǎn)過程中的條件改變微生物的遺傳特性改變細胞膜的透性，使谷氨酸迅速排放到細胞外面，解除谷氨酸的抑制作用。抑制天冬氨酸中間產(chǎn)物Ⅰ實例3