反義核酸與核酶

第1頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反義藥物第2頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容一、反義核酸與反義技術(shù)反義核酸和反義技術(shù)概念反義核酸的基本原理反義核酸的種類反義核酸與反義技術(shù)的應(yīng)用二、核酶技術(shù)及其應(yīng)用核酶概述核酶與RNA修復(fù)核酶技術(shù)在臨床上的應(yīng)用核酶技術(shù)面臨的問(wèn)題第3頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反義核酸和反義技術(shù)反義核酸(antisensenucleicacid)

是一段與靶基因的某段序列互補(bǔ)的天然存在或人工合成的核苷酸序列

它可通過(guò)堿基配對(duì)與細(xì)胞內(nèi)核酸特異結(jié)合形成雜交分子，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，具有合成方便、序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、容易修飾、選擇性高、親和力高等特點(diǎn)反義核酸技術(shù)（antisensenucleicacidstechnology)

是根據(jù)核酸雜交原理設(shè)計(jì)的，以選擇性地抑制特定基因表達(dá)為目的的一類核酸研究新技術(shù)

包括反義RNA(asRNA)、反義DNA(asDNA)、核酶(Rz)第4頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反義核酸的基本原理絕大多數(shù)DNA由兩條堿基互補(bǔ)的單鏈組成，生物信息以核苷酸不同排列順序編碼在DNA鏈上，基因組形成單順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)在DNA雙鏈上被轉(zhuǎn)錄為RNA的鏈為正義鏈，與其相對(duì)應(yīng)的鏈為反義鏈精心設(shè)計(jì)一段寡核苷酸與正義鏈互補(bǔ)，一般由7到30個(gè)核苷酸組成，將會(huì)阻斷基因轉(zhuǎn)錄；或?qū)⒑蟹戳x序列的載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，干擾特定基因表達(dá)利用這一原理可以在基因位點(diǎn)、前體mRNA、mRNA及蛋白水平，通過(guò)干擾特定基因功能限制細(xì)胞增殖、分化和凋亡第5頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反義基因治療

DNADNA

RNARNA

反義RNA

阻斷表達(dá)利用人工合成的反義RNA或DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞，控制細(xì)胞的中間階段使編碼蛋白的基因不能轉(zhuǎn)錄為mRNA或阻斷翻譯相應(yīng)蛋白第6頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第7頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反義技術(shù)的兩種技術(shù)路線將表達(dá)與體內(nèi)基因或mRNA互補(bǔ)序列的基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)，使細(xì)胞表達(dá)與目標(biāo)基因互補(bǔ)的mRNA，從而阻斷目標(biāo)基因的表達(dá)體外合成mRNA互補(bǔ)的核苷酸類似物，通過(guò)靜脈注射等途徑進(jìn)入細(xì)胞，特異性地與目標(biāo)mRNA作用以第二種為主來(lái)介紹第8頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反義核酸的種類反義RNA：一類能與特異mRNA互補(bǔ)的小分子質(zhì)量的、可擴(kuò)散的DNA轉(zhuǎn)錄物，能夠從翻譯、轉(zhuǎn)錄和核酸復(fù)制水平上高度特異地抑制靶基因表達(dá)反義DNA：人工合成一小段反義寡核苷酸，與DNA或mRNA序列互補(bǔ)結(jié)合，封閉靶基因表達(dá)（ASODN）

理論上認(rèn)為寡核苷酸與其意義鏈互補(bǔ)，會(huì)象“封條”一樣，阻斷mRNA拼接、轉(zhuǎn)錄、翻譯，下調(diào)特定基因表達(dá)第9頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反義RNA的最初發(fā)現(xiàn)反義RNA最先發(fā)現(xiàn)于原核細(xì)胞，是由Tomizarna在1981年對(duì)質(zhì)粒ColE1復(fù)制的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的第10頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月c-myc基因——真核細(xì)胞中天然反義RNA調(diào)節(jié)c-myc基因是禽類髓細(xì)胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的細(xì)胞同源序列，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)Saito等研究發(fā)現(xiàn)，c-myc基因有3個(gè)外顯子，第一個(gè)外顯子不編碼蛋白質(zhì)，它的序列與第二個(gè)外顯子互補(bǔ)，通過(guò)反義RNA與第二個(gè)外顯子mRNA的堿基配對(duì)而抑制基因表達(dá)在人Burkitt淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)c-myc基因失去了第一個(gè)外顯子，從而使c-myc基因表達(dá)失控由此可見(jiàn)，反義RNA的負(fù)調(diào)節(jié)被解除是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的原因之一第11頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月c-myc基因——真核細(xì)胞中天然反義RNA調(diào)節(jié)c-myc互補(bǔ)RNAC-MYC第12頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反義RNA的作用機(jī)制作用于外顯子和內(nèi)含子的連接區(qū)，阻止mRNA前體的剪接反義RNA與DNA結(jié)合時(shí)能阻止轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而阻止特定基因的轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)于特定mRNA的非編碼區(qū)，如SD序列或核糖體結(jié)合位點(diǎn)及其上游區(qū)，影響核糖體結(jié)合，從而抑制翻譯互補(bǔ)于特定mRNA的編碼區(qū)，抑制翻譯或激活RNaseH使mRNA易被核酸酶降解作用于靶mRNA的5’端，阻止帽子結(jié)構(gòu)形成，影響mRNA的成熟作用于PoIyA形成位點(diǎn)，阻止靶mRNA成熟及向胞漿內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)第13頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反義RNA的作用機(jī)制DNApreRNARNAProteinm7G5'pppAA…AArRNA第14頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反義RNA的獲得途徑化學(xué)會(huì)成法：利用核酸合成儀直接合成反義RNA體外轉(zhuǎn)錄法：利用帶有噬菌體SP6或T7等啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒，將特異基因的DNA片段反向插入其多克隆位點(diǎn)中，在RNA聚合酶的作用下體外合成特異性反義RNA細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄法：利用基因重組技術(shù)，在適宜啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子之間反向插人一段靶基因，人工構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體(病毒表達(dá)載體或質(zhì)粒表達(dá)載體)，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞并使之在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)反義RNA第15頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反義RNA的臨床作用抗病毒：將特定的病毒基因反向插入到表達(dá)性載體中，以構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體再將重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞(病毒宿主細(xì)胞)中表達(dá)特異性反義RNA從而抑制特異有害基因的表達(dá)或抑制病毒復(fù)制（皰疹病毒、流感病毒、人類免疫缺陷病毒）抗腫瘤：設(shè)計(jì)出針對(duì)腫瘤細(xì)胞的癌基因、突變基因、非正常表達(dá)基因及某些腫瘤相關(guān)病毒的癌基因反義RNA以阻斷這些有害基因的表達(dá)，達(dá)到治療腫瘤的目的第16頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反義DNA與靶基因結(jié)合形式寡核苷酸與雙股DNA結(jié)合，形成三股螺旋結(jié)構(gòu)，競(jìng)爭(zhēng)抑制激活轉(zhuǎn)錄蛋白與基因啟動(dòng)子結(jié)合，發(fā)揮其生物活性寡核苷酸與mRNA雜交形成了核糖核苷酸酶H(RNaseH)底物，激活RNaseH識(shí)別雜交體特異性地剪切雜交分子中的mRNARNaseHASODNmRNATFO第17頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月反義寡聚核苷酸與mRNA特異性結(jié)合，阻斷翻譯過(guò)程第18頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ANTISENSETECHNOLOGIESGENOMICSBASEDDRUGDISCOVERYPHARMACEUTICALSMOLECULARDIAGNOSTICSGENETHERAPYDRUGDELIVERYSYSTEMSRelationofantisensetechnologiestoothersegmentsofbiopharmaceuticalindustry反義技術(shù)與反義核酸的應(yīng)用第19頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月利用反義RNA的原癌基因失活療法：

阻止或抑制原癌基因的過(guò)度表達(dá)及抑制癌基因突變體mRNA成熟原癌基因調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖與分化正常情況下，表達(dá)受嚴(yán)格控制一旦調(diào)節(jié)失控，基因產(chǎn)物（生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子受體，胞內(nèi)外傳遞信號(hào)等癌蛋白）分泌過(guò)剩，細(xì)胞惡性增生，致癌治療方法根據(jù)已知癌基因的核苷酸序列合成反義RNA相應(yīng)的反義寡聚核苷酸與腫瘤癌基因活化表達(dá)的mRNA的起始翻譯位點(diǎn)結(jié)合成RNA/RNA雙鏈體雙鏈體阻止啟動(dòng)子與核糖體結(jié)合，或核糖體沿mRNA上移，抑制翻譯反義RNA的應(yīng)用（一）第20頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

反義RNA的應(yīng)用（二）第21頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

反義RNA的應(yīng)用（二）第22頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

反義RNA的應(yīng)用（二）抗HIV-l的作用：從翻譯水平封閉基因表達(dá)，并干擾mRNA的剪切、加工而實(shí)現(xiàn)抗病毒作用tat為HIV-l重要的調(diào)節(jié)基因，編碼反式激活因子Tat蛋白在逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子LTR之后連接反義tat與多聚TAR的構(gòu)建物(LTR-25TAR-AS-TAT)，具有反義tat及TAR誘餌的雙重作用由于LTR啟動(dòng)子受Tat蛋白反式激活，使tat在HIV-l感染的細(xì)胞中得以高表達(dá)將這種外源基因?qū)隡olt-3T細(xì)胞系、CEM-SST細(xì)胞系及健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，對(duì)實(shí)驗(yàn)及臨床分離病毒株均有抑制作用gag是HIV-1的結(jié)構(gòu)基因，編碼p24等病毒結(jié)構(gòu)蛋白Veres等構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)互補(bǔ)于gag區(qū)不同長(zhǎng)度的反義RNA(225-1225nt)

在CEM-SST細(xì)胞及外周血CD4細(xì)胞均有抑制HIV-l復(fù)制的作用長(zhǎng)片段反義RNA的抗HIV-l作用更好，可能由于它能與不同種的HIV-lRNA結(jié)合而限制了病毒的逃逸第23頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月部分反義藥物第24頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月針對(duì)腫瘤的反義藥物第25頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月針對(duì)其他疾病的反義藥物第26頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一個(gè)反義藥物——福米韋生Fomivirsen（ISIS2922）是FDA批準(zhǔn)上市的第1個(gè)反義藥物商品名Vitravene美國(guó)ISISPharma公司研制瑞士CibaVisionOphthalmics公司申請(qǐng)1998年8月在美國(guó)首次上市核苷酸序列為5’-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3’硫代磷酸化修飾主要用于治療艾滋病(AIDS)病人并發(fā)的巨細(xì)胞病毒(CMV)性視網(wǎng)膜炎第27頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一個(gè)反義藥物——福米韋生1藥效學(xué)1.1抗病毒作用機(jī)制主要依賴于反義作用，福米韋生與CMVmRNA特異序列互補(bǔ)結(jié)合，被RNA酶H識(shí)別，并使mRNA水解失活抑制CMV進(jìn)入宿主細(xì)胞是序列非依賴性的非反義作用1.2抗病毒活性對(duì)人類CMV病毒株AD169的EC50為0.37μmoL此EC50為更昔洛韋（ganciclovir）的l30～1901.3耐藥性耐受高濃度福米韋生的病毒突變株與福米韋生互補(bǔ)的基因區(qū)并無(wú)改變，這表明耐藥性不是互補(bǔ)基因區(qū)發(fā)生改變而引起的第28頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一個(gè)反義藥物——福米韋生2藥動(dòng)學(xué)2.1兔體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)以14C標(biāo)記的福米韋生單次66μg劑量，玻璃體液中消除t1/2為62h給藥10天后，仍對(duì)CMV復(fù)制有抑制作用，有22%的福米韋生存在，其余78%則降解為短鏈代謝物視網(wǎng)膜中消除t1/2約為79h2.2猴體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)玻璃體液藥物濃度與劑量曲線幾乎為直線關(guān)系峰值濃度出現(xiàn)在給藥2～3天后，14天后基本檢測(cè)不到在每周或每2周玻璃體內(nèi)注入11、57和115μg后，玻璃體液中未發(fā)現(xiàn)藥物累積現(xiàn)象但多次注射后，視網(wǎng)膜上出現(xiàn)藥物累積現(xiàn)象福米韋生115μg單次給藥，在視網(wǎng)膜中消除t1/2為78h第29頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一個(gè)反義藥物——福米韋生3臨床療效前3周每周福米韋生165μg玻璃體內(nèi)注射，以后每2周給藥1次，用藥組和對(duì)照組病情進(jìn)展時(shí)間中位數(shù)分別為71和14天福米韋生可以降低病人體內(nèi)的CMV活性，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系病情發(fā)展到威脅視力的病人，使用福米韋生后癥狀有所好轉(zhuǎn)，病情進(jìn)展明顯延緩4不良反應(yīng)最常見(jiàn)不良反應(yīng)是暫時(shí)性眼內(nèi)壓升高和輕、中度眼前、后房炎癥反應(yīng)所有研究對(duì)象均未發(fā)生視網(wǎng)膜剝脫和全身毒性反應(yīng)高劑量可引起少數(shù)病人外周視網(wǎng)膜色素沉著及周邊視力下降與眼外科手術(shù)相比，玻璃體內(nèi)注射發(fā)生出血、眼內(nèi)炎和視網(wǎng)膜剝脫的風(fēng)險(xiǎn)要小得多第30頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一個(gè)反義藥物——福米韋生5適應(yīng)證和禁忌證福米韋生為二線治療藥物，適用于對(duì)其他治療措施不能耐受或沒(méi)有效果或有禁忌的病人；禁用于2～4周內(nèi)使用西多福韋（cidofovir）治療的病人，以免增加發(fā)生眼內(nèi)炎的危險(xiǎn)性6與治療CMV視網(wǎng)膜炎的其他藥物比較更昔洛韋、西多福韋和膦甲酸鈉是CMV抑制劑，而非殺死劑；具有交叉耐藥性；可產(chǎn)生腎毒性；插管給藥、植入制劑費(fèi)用昂貴、重復(fù)手術(shù)以及視網(wǎng)膜剝脫發(fā)生率高（28%）使應(yīng)用受限福米韋生具有阻止病毒復(fù)制，療效持久、用藥次數(shù)少，不良反應(yīng)少而輕，局部玻璃體內(nèi)注射給藥優(yōu)于其他上述提及的給藥方法7展望第31頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移技術(shù)受體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)運(yùn)技術(shù)的啟發(fā)實(shí)現(xiàn)DNA和RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)例：脫唾液酸血清類粘蛋白(ASGP)受體

唾液酸血清類粘蛋白—唾液酸→ASGP

ASGP

+PL（多聚賴氨酸）→

ASGP-PL復(fù)合物反義RNA

+ASGP-PL復(fù)合物→

ASGP-PL-反義RNA復(fù)合物

ASGP-PL-反義RNA復(fù)合物→

肝細(xì)胞表面ASGP受體識(shí)別→吞噬→

釋放→發(fā)揮作用優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)，抗降解能力強(qiáng)第32頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月以聚合物微球?yàn)檩d體的輸送系統(tǒng)目前研究最多的聚合物微球是聚丙交酯及乳酸一羥乙酸（LA-GA）以丙交酯和乙交酯為單體形成的共聚物，降解屬于水解反應(yīng)產(chǎn)物均為人體正常代謝物，降解時(shí)間取決于兩種單體的配比和聚合物的分子量構(gòu)成的結(jié)合復(fù)合體具有潛在的轉(zhuǎn)運(yùn)反義核苷酸和核酶的作用第33頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酶技術(shù)及其應(yīng)用核酶(Ribozyme)——一種具有核酸內(nèi)切酶活性的RNA分子，可特異性地切割靶RNA序列，具有解離后重復(fù)切割相同靶分子的能力第34頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酶發(fā)展簡(jiǎn)史1968年，F(xiàn)rancisCrick在他的論文“基因密碼的起源”一文中提到：“可能第一個(gè)酶是具有復(fù)制能力的RNA”，沒(méi)有人予以注意1987年，第52屆冷泉港定量生物學(xué)國(guó)際討論會(huì)上，AlanWeiner做會(huì)議總結(jié)時(shí)重復(fù)了20年前FrancisCrick的話，會(huì)議注意力已集中到最近發(fā)現(xiàn)的具有酶活性RNA分子上1989年，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了分別獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)具有酶活性的RNA分子的Thomas.R.Cech（ColoradoUniversity）SidneyAltman（YaleUniversity）第35頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ThomasR.Cech切赫，美國(guó)人因發(fā)現(xiàn)RNA生物催化作用與S.Altman同獲1989年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獨(dú)立發(fā)現(xiàn)RNA不僅被動(dòng)地傳遞遺傳信息，還能催化細(xì)胞內(nèi)生命所必需的化學(xué)反應(yīng)，1982年公布其研究結(jié)果，1983年證實(shí)RNA的酶活動(dòng)此前，人們認(rèn)為僅蛋白質(zhì)才能起酶的作用第36頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酶的發(fā)現(xiàn)研究目的：rRNA中一些無(wú)意義的序列，或內(nèi)含子(intron)，如何從RNA分子中剪切下來(lái)？研究對(duì)象：原生動(dòng)物四膜蟲(chóng)(TetrahymenaThermophila)，只含一種RNA，除rRNA外還有一個(gè)由413個(gè)核苷酸組成的插入序列(interveningsequenc，IVS)研究發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物rRNA前體很不穩(wěn)定，在鳥(niǎo)苷和Mg2+存在下切除自身的IVS，使兩個(gè)外顯子拼接起來(lái)，變成成熟的rRNA分子。催化反應(yīng)是在無(wú)任何蛋白質(zhì)酶存在下發(fā)生的，稱為自我剪接研究結(jié)論：

IVS具有類似蛋白酶的功能，能夠打斷及重建磷酸二脂鍵rRNA前體能靠自己完成剪接過(guò)程，在一定條件下按一定方式盤(pán)繞，進(jìn)而切割自己，以后再把保留部分連接起來(lái)?？梢源呋杂傻孜锏木哂忻富钚缘腞NARNA分子具有自身斷裂的催化作用，以及酶活性的另一個(gè)重要方面即催化其他分子的反應(yīng)第37頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SidneyAltman奧爾特曼（1939—）美國(guó)人因發(fā)現(xiàn)RNA的生物催化作用而獲1989年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1978年奧爾特曼發(fā)現(xiàn)了核糖核酸(RNA)自身具有的生物催化作用不僅為探索RNA的復(fù)制能力提供了線索，而且說(shuō)明了最早的生命物質(zhì)是同時(shí)具有生物催化功能和遺傳功能的RNA，打破了蛋白質(zhì)是生物起源的定論第38頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月S.Altman的研究工作研究目的：t-RNA分子的剪接過(guò)程研究發(fā)現(xiàn)：在較高濃度的鎂離子和適量精氨酸參與下，核酸酶P（ribonucleaseP，RNaseP）中RNA能夠切割tRNA前體5’端研究結(jié)論：過(guò)去都認(rèn)為RNase

P的催化作用由RNA和蛋白質(zhì)共同完成的，而該實(shí)驗(yàn)證明，RNase

P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)僅僅起穩(wěn)定構(gòu)象的作用由于這類酶具有類似核糖核酸功能，而化學(xué)本質(zhì)為核酸，因此被切赫稱之為核酶第39頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酶的作用機(jī)制第40頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酶的分類剪切型核酶：這類核酶催化自身或者異體RNA的切割，相當(dāng)于核酸內(nèi)切酶剪接型核酶：這類核酶具有核酸內(nèi)切酶和連接酶兩種活性剪切型核酶剪接型核酶根據(jù)催化反應(yīng)錘頭核酶I型內(nèi)含子II型內(nèi)含子發(fā)夾核酶丁型肝炎病毒(HDV)核酶RNaseP鏈孢霉線粒體(VS)核酶自體催化異體催化第41頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月自體剪切型核酶-錘頭型核酶錘頭核酶是從類病毒中分離出來(lái)的本來(lái)是一個(gè)順式切割的酶，將其分為酶鏈和底物鏈兩部分后就轉(zhuǎn)變?yōu)榘袠?biāo)特異性的反式切割的酶在防止有害基因的表達(dá)上具有很大的應(yīng)用價(jià)值形狀：長(zhǎng)約30個(gè)核苷酸，呈球狀構(gòu)象，可粗略看成性折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)：3個(gè)超螺旋結(jié)構(gòu)域和13個(gè)保守核苷酸殘基構(gòu)成：催化區(qū)和底物結(jié)合區(qū)性質(zhì)：需要二價(jià)金屬離子(Mg2+)作為它的輔因子，核酶的活性形式是一種RNA鍵合金屬氫氧化物第42頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3個(gè)雙螺旋區(qū)13個(gè)核苷酸殘基保守序列剪切反應(yīng)在右上方GUX序列的3‘端自動(dòng)發(fā)生第43頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酶1989年漢普（Hample）研究煙草環(huán)斑病毒（sTRSV）的負(fù)鏈RNA的自我剪切反應(yīng)，提出發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpinstructure）模型發(fā)夾核酶催化機(jī)制：金屬離子在催化反應(yīng)中起結(jié)構(gòu)作用，其剪切活性比錘頭結(jié)構(gòu)核酶高第44頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5‘3‘剪切位點(diǎn)自體剪切型核酶-發(fā)夾結(jié)構(gòu)3個(gè)環(huán)和4個(gè)螺旋形成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域剪切反應(yīng)發(fā)生在底物識(shí)別序列GUC的5‘端兩個(gè)內(nèi)部環(huán)中的堿基及在螺旋區(qū)II的G11和底物中的G+1都是酶發(fā)揮作用所必需的第45頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月肝炎病毒（HDV）核酶目前唯一一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)具有天然核酶活性的動(dòng)物病毒來(lái)源于肝炎病毒的反義RNA和基因組RNA，為單股環(huán)狀負(fù)鏈RNA病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：有3個(gè)由堿基配對(duì)形成的莖，剪切時(shí)需要二價(jià)陽(yáng)離子參與，結(jié)果產(chǎn)生5‘-OH和2’,3’-環(huán)磷酸第46頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月剪切部位剪切部位自體剪切型核酶-斧頭結(jié)構(gòu)三個(gè)堿基對(duì)的莖需要二價(jià)陽(yáng)離子產(chǎn)生5’-OH和2’,3’-環(huán)磷酸第47頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月鏈孢霉線粒體（VS）核酶VS核酶球狀，由5個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)組成，這些螺旋結(jié)構(gòu)通過(guò)兩個(gè)連接域連接起來(lái)，連接域?qū)τ诖呋磻?yīng)很重要第48頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月異體剪切型核酶－RNasePRNaseP是內(nèi)切核酸酶，是核糖核蛋白體復(fù)合物，能剪切所有tRNA前體的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH

和5’-磷酸末端RNaseP由M1RNA和蛋白質(zhì)亞基組成體外：M1RNA具催化作用，蛋白質(zhì)作為輔助因子體內(nèi)：M1RNA和蛋白質(zhì)對(duì)酶活性都是必需的RNaseP可剪切前體5’端41nt,5’端成熟不同tRNA的5’端沒(méi)有順序共同性，剪切的準(zhǔn)確性與剪切部位周圍的核苷酸順序無(wú)關(guān)，表明在RNaseP的組分內(nèi)沒(méi)有引導(dǎo)序列，RNaseP所識(shí)別的是底物的高級(jí)結(jié)構(gòu)第49頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月剪切位點(diǎn)第50頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月G結(jié)合位點(diǎn)保守序列剪接部位引導(dǎo)序列G結(jié)合位點(diǎn)

I類內(nèi)含子二級(jí)結(jié)構(gòu)通式第51頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第52頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月型內(nèi)含子核酶一類具有酶催化功能的內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄成RNA后，可以自剪接其轉(zhuǎn)錄后可形成9個(gè)堿基配對(duì)形成的特定二級(jí)結(jié)構(gòu)，分別命名為P1至P9在剪接反應(yīng)中，需要游離的鳥(niǎo)苷作輔助因子可以用來(lái)修復(fù)體內(nèi)的有害突變基因第53頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月I型內(nèi)含子催化其他RNA分子反應(yīng)的幾種類型轉(zhuǎn)核苷酸作用

2CpCpCpCpC

→CpCpCpCpCpC+CpCpCpC

水解作用

CpCpCpCpC

→CpCpCpC+pC

轉(zhuǎn)磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpU→CpCpCpCpCpC+UpCpUp

去磷酸作用

CpCpCpCpCp

→CpCpCpCpC+Pi限制性內(nèi)切酶作用?CpUpCpUpN?

+G→CpUpCpU+GpN?第54頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月II型內(nèi)含子核酶由6個(gè)螺旋組成，分成3個(gè)部分：邊界序列5’GUGCG···YnAG，（Y代表嘧啶，n代表任意核苷酸）3’莖環(huán)結(jié)構(gòu)分支點(diǎn)順序

A處于未配對(duì)狀態(tài)，有一游離的2’-OH剪接機(jī)制：不需要鳥(niǎo)苷或鳥(niǎo)苷酸參加，但仍需要鎂離子(Mg2+)第55頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月II型內(nèi)含子核酶II型內(nèi)含子有一個(gè)保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域V：高度保守，催化活性必需結(jié)構(gòu)域VI：未配對(duì)的A提供2‘-OH第56頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月II型內(nèi)含子核酶第57頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月II型內(nèi)含子核酶剪接機(jī)制第58頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第59頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月脫氧核酶指具有催化功能的DNA分子稱為脫氧核酶(DNAzyme)，又稱酶性DNA在一定條件下可切割RNA分子特定位點(diǎn)內(nèi)部的磷酸二酯鍵脫氧核酶的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步延伸了酶的概念具有水解酶活性的脫氧核酶以RNA為底物的脫氧核酶：包括“10-23”DRz和“8-17”DRz

以DNA為底物的脫氧核酶：手槍型脫氧核酶具有N-糖基化酶活性的脫氧核酶具有連接酶活性的脫氧核酶具有激酶活性的脫氧核酶第60頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月10-23型脫氧核酶作用機(jī)理第61頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月手槍型脫氧核酶自我剪切作用機(jī)理第62頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酶與RNA修復(fù)核酶是天然的具有催化能力的RNA分子，能特異性地催化RNA剪接經(jīng)過(guò)基因工程改造的核酶，可以位點(diǎn)特異性地切割任意給定的RNA分子剪接有兩種形式：一是分子內(nèi)不同部分間的剪接，稱為順式剪接；一是不同分子間的剪接，稱為反式剪接反式剪接是修復(fù)RNA外顯子突變的重要方法可以把正?；蚧蚓哂蓄愃乒δ艿幕蛳鄳?yīng)片段，剪接到異常RNA上去，換下突變的部分第63頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月修復(fù)RNA結(jié)構(gòu)缺陷利用核酶的剪接能力，可引入新的基因功能或修復(fù)已有的基因缺陷N.Lan等對(duì)鐮形細(xì)胞貧血突變的β珠蛋白mRNA進(jìn)行了修復(fù)鐮刀形細(xì)胞貧血是由于β珠蛋白基因第6密碼子中的一個(gè)A→T突變引起的將來(lái)源于四膜蟲(chóng)組I內(nèi)含子的核酶改造，使之能專一性識(shí)別β珠蛋白mRNA突變位點(diǎn)上游的特定序列將γ珠蛋白cDNA下游包括外顯子在內(nèi)的對(duì)應(yīng)片段連接到這一核酶的3’端轉(zhuǎn)染培養(yǎng)到病人外周血和臍帶血干細(xì)胞后，均檢測(cè)到β珠蛋白mRNA被剪接成β珠蛋白γ融合RNA分子，說(shuō)明引入的功能基因得到表達(dá)第64頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第65頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月胎兒型血紅蛋白(HbF，α2γ2)與成人型血紅蛋白(HbA，α2β2)功能相近，所以γ珠蛋白的引入，可以代償βS珠蛋白所喪失的功能，起到治療鐮形細(xì)胞貧血的作用Tγγββ第66頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月恢復(fù)正常剪接途徑基因突變有時(shí)會(huì)在內(nèi)含子中生成新的剪接點(diǎn)，當(dāng)然也是異常的剪接點(diǎn)。它們與左鄰右舍原來(lái)不起作用的隱匿的剪接點(diǎn)搭配起來(lái)，就會(huì)形成錯(cuò)誤剪接由于原有的正常剪接點(diǎn)并未喪失功能，只是作用被異常剪接抑制，所以用反義核酸通過(guò)堿基互補(bǔ)，封閉異常剪接點(diǎn)或其他剪接元件，就可堵住異常剪接途徑，迫使剪接系統(tǒng)選擇正確的途徑，形成正常RNA。這就間接地對(duì)RNA缺陷作了“修復(fù)”剪接缺陷型突變往往使mRNA失活，影響嚴(yán)重β地中海貧血是由于患者β珠蛋白基因突變，導(dǎo)致正常β鏈減少，紅細(xì)胞內(nèi)α和β鏈不平衡，締合形成的成人型血紅蛋白（α2β2）少了或者完全沒(méi)有引起的已發(fā)現(xiàn)的190多種β地中海貧血突變型中，有一部分屬于剪接缺陷型第67頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CCC—CCC—CCCC反義RNA第68頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月β地中海貧血我國(guó)常見(jiàn)的內(nèi)含子2第654位C→T突變（β654），就是在653位形成了一個(gè)新的剪接點(diǎn)，同時(shí)又激活了其上游579位一個(gè)潛在的剪接點(diǎn)，導(dǎo)致一段長(zhǎng)度為73個(gè)堿基的內(nèi)含子2序列插入到外顯子2和3之間，形成異常mRNA，引起地中海貧血表型由于突變基因原有的正常剪接點(diǎn)并未遭到破壞，仍然可以發(fā)揮作用，所以用反義核酸封閉異常的653或579位點(diǎn)，就能迫使人體剪接系統(tǒng)回到正常剪接途徑，減少異常mRNA的形成反義封閉雖沒(méi)有對(duì)β珠蛋白基因的突變作任何修正，但是對(duì)突變RNA的錯(cuò)誤剪接方式作了糾正，所產(chǎn)生的成熟mRNA可以指導(dǎo)合成正常珠蛋白鏈。第69頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月調(diào)整蛋白質(zhì)肽鏈比例

突變基因的異常表達(dá)，往往擾亂體內(nèi)蛋白質(zhì)肽鏈之間的平衡，引起疾病反義封閉技術(shù)也可用來(lái)糾正基因表達(dá)的紊亂。常見(jiàn)的血紅蛋白H?。匀苎载氀┑难芯?，就是一個(gè)比較理想的范例正常人每個(gè)細(xì)胞有4個(gè)α珠蛋白基因，2個(gè)β珠蛋白基因，合成的α和β鏈正好締合成四聚體α2β2第70頁(yè)，課件共78頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月血紅蛋白H病如果在4個(gè)α珠蛋白基因中只有1個(gè)正常，其余3個(gè)丟失或有缺陷，則紅細(xì)胞中α鏈合成不足，β鏈相對(duì)過(guò)剩。多余的β鏈自行聚合為四聚體β4，即血紅蛋白H血紅蛋白H不穩(wěn)定，容易解體生成游離的β鏈，游離鏈在紅細(xì)胞內(nèi)沉淀形成H包涵體，附著在紅細(xì)胞膜上，使膜受損失去柔韌性。這種紅細(xì)胞易被脾臟破壞，導(dǎo)致血紅蛋白H病血紅蛋白H