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文檔簡介

藥物分離與純化技術(shù)課程電泳技術(shù)--等電聚焦電泳等電聚焦電泳—電泳技術(shù)大綱1.等電聚焦電泳概念2.等電聚焦電泳特點3.等電聚焦操作等電聚焦電泳—電泳技術(shù)將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH值梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一段時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pH值位置上，最后，樣品的各組分在各自的等電點聚焦成一條清晰而穩(wěn)定的窄帶。（一）等電聚焦電泳概念等電聚焦電泳—電泳技術(shù)①使用兩性載體電解質(zhì)，在電極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)、線性的pH梯度；②由于“聚焦效應(yīng)”，即使很小的樣品也能獲得清晰、鮮明的區(qū)帶界面；③電泳速度快;④分辨率高;（二）等電聚焦電泳特點等電聚焦電泳—電泳技術(shù)⑤加入樣品的位置可任意選擇；⑥可用于測定蛋白質(zhì)類物質(zhì)的等電點;⑦適用于中、大分子量（如蛋白質(zhì)、肽類、同工酶等）生物組分的分離分析。（二）等電聚焦電泳特點等電聚焦電泳—電泳技術(shù)

（1）凝膠配制：凝膠濃度T為5％-7.5％

（2）加樣：任意位置（三）等電聚焦電泳操作等電聚焦電泳—電泳技術(shù)（3）電泳

①開始電泳時恒壓60V，15min，目的在于使小分子的，泳動快的載體兩性電解質(zhì)可在短時間內(nèi)形成一個粗略的pH梯度。

②此后，恒流為8mA，是為了避免電泳開始時介質(zhì)中帶電顆粒較多，電泳電流過高而破壞凝膠。（三）等電聚焦電泳操作等電聚焦電泳—電泳技術(shù)③當(dāng)各種蛋白質(zhì)逐漸泳動，到各自等電點位置時，帶電顆粒逐漸減少，出現(xiàn)電阻增大，電壓隨之增高現(xiàn)象。（三）等電聚焦電泳操作等電聚焦電泳—電泳技術(shù)④當(dāng)電壓升到550V時，帶電顆粒已大為減少，電流不再偏高，故恒壓到580V，繼續(xù)電泳120min后，蛋白質(zhì)顆粒慢慢地集中到它等電點位置。⑤電流接近于零時，蛋白質(zhì)顆粒不再泳動，電泳也到此結(jié)束。

（三）等電聚焦電泳操作等電聚焦電泳—電泳技術(shù)（4）固定及染色：

TCA固定，考馬斯亮藍染色。（5）等電點測定：Marker與未知樣品同時電泳染色后，以pH值為縱軸，距陰極距離為橫軸，做pH梯度標準曲線，據(jù)未知蛋白遷移距離可推知pI

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