制藥用水微生物檢查方法的驗證

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介紹內(nèi)容

一、微生物基礎(chǔ)知識二、微生物檢驗方法驗證制藥用水微生物檢查方法的驗證第2頁

微生物基礎(chǔ)知識

微生物（microorganism,microbe）是一些肉眼看不見微小生物總稱。微生物（microorganism）包含細菌、支原體、螺旋體、衣原體、立克次體、病毒及真菌霉菌、酵母菌和放線菌）等。制藥用水微生物檢查方法的驗證第3頁

微生物特點

種類多分布廣

迄今為止，咱們知道微生物約有10萬種，只占地球上實際存在微生物總數(shù)20%。制藥用水微生物檢查方法的驗證第4頁

微生物特點

各體小，表面積大物體表面積和體積之比稱為表面積，大腸埃希菌表面積是人30萬倍。

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微生物特點

吸收多轉(zhuǎn)化快如大腸埃希菌在適當(dāng)條件下，每小時能夠消耗相當(dāng)于本身重量倍數(shù)量，而人體則需要40年之久。

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微生物特點

適應(yīng)強易變異多數(shù)細菌能耐0～－196℃低溫；硫細菌可在250～300℃高溫條件下正常生長；一些嗜鹽細菌甚至能在飽和鹽水中正常生活；產(chǎn)芽孢細菌和真菌孢子在干燥條件下能保藏幾十年、幾百年。制藥用水微生物檢查方法的驗證第7頁

微生物類群和形態(tài)結(jié)構(gòu)

微生物按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及生活習(xí)性等分為三大類：原核細胞型：細菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次氏體、螺旋體等真核細胞型：真菌非細胞型：病毒噬菌體

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細菌繁殖

細菌（bacterium）屬于原核細胞型微生物，其特點是含有細胞壁、原始核質(zhì)，以二分裂方式繁殖。了解細菌基礎(chǔ)特征、細菌判別，對新藥研發(fā)和預(yù)防藥品污染，確保藥品質(zhì)量含有主要意義。制藥用水微生物檢查方法的驗證第9頁

細菌形態(tài)

-細菌體積微小，是無色半透明，用肉眼直接觀察難以看到，其結(jié)構(gòu)和形狀須經(jīng)過顯微鏡放大數(shù)百倍至上千倍才能觀察。-普通以微米（μm）作為測量單位。-在細菌學(xué)中，按其形態(tài)可分為球菌、桿菌、弧菌和螺桿菌。經(jīng)革蘭染色法（Gramstain）可將細菌分成兩大類：革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）。制藥用水微生物檢查方法的驗證第10頁

細菌形態(tài)制藥用水微生物檢查方法的驗證第11頁

細菌形態(tài)

真菌（fungus；eumycetes）是含有真核和細胞壁生物。種類很多，已報道種超出10萬個。大多是由纖細管狀菌絲組成菌絲體。許多菌絲在一起統(tǒng)稱菌絲體。菌絲體在基質(zhì)上生長形態(tài)稱為菌落。制藥用水微生物檢查方法的驗證第12頁

細菌形態(tài)

真菌形態(tài)含有多樣性，大小不一，大用肉眼能夠看到，小用普通光學(xué)顯微鏡放大數(shù)倍乃至千倍方可觀察到。其形態(tài)分單細胞、多細胞，單細胞呈圓形或卵圓形，如酵母菌（yeast）。多細胞由菌絲和孢子組成，并交織成團。制藥用水微生物檢查方法的驗證第13頁

藥品污染常見真菌

毛霉屬、根霉屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬

-毛霉屬（MucorMicheliexFries）

毛霉屬在自然界分布很廣，常見于發(fā)酵工業(yè)。并引發(fā)水分高糧食及食品霉?fàn)€變質(zhì)。毛霉屬分枝類型：1.單生（不分枝）2.總狀分枝3.假軸狀分枝⑵毛霉孢子囊：1.孢子2.膜3.囊軸4.孢子囊柄制藥用水微生物檢查方法的驗證第14頁

根霉屬（RhizopusEhrenberg）

根霉屬廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，在潮濕糧食及食品上能快速蔓延生長，引發(fā)糧食及食品腐爛。

根霉A：1．營養(yǎng)菌絲B：2.匍匐菌絲3.假根4.孢囊柄C：孢囊放大圖1.囊壁2.囊軸3.囊托制藥用水微生物檢查方法的驗證第15頁

曲霉屬（Aspergillus）

曲霉屬菌絲無色、淡色或表面凝聚有色物質(zhì)，為有隔多細胞。本屬常見產(chǎn)毒霉菌有8個種，含有強烈致癌性。

曲霉

1．雙層小梗分生孢子頭

2.單層小梗分生孢子頭

3.分生孢子?；孔慵毎?/p>

4.雙層小梗細胞微結(jié)構(gòu)制藥用水微生物檢查方法的驗證第16頁

常見青霉分生孢子梗

青霉屬菌絲無色或有色，為有隔多細胞。分生孢子梗從菌絲垂直生出，無足細胞，頂端不膨大，無頂囊，產(chǎn)生一輪至數(shù)輪分叉，在最終一級分枝小梗上，長出成串分生孢子，形似掃帚狀，稱為帚狀枝。本屬常見產(chǎn)毒霉菌有9個種，其中展青霉可產(chǎn)生展青霉素，是一個神經(jīng)毒素，并含有致畸、致突變和致癌性；制藥用水微生物檢查方法的驗證第17頁

霉菌菌落形態(tài)制藥用水微生物檢查方法的驗證第18頁

霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上形態(tài)

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酵母菌顯微鏡下形態(tài)制藥用水微生物檢查方法的驗證第20頁

微生物檢驗法

微生物程度檢驗方法系檢驗非要求滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度方法。檢驗項目包含細菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢驗。檢驗方法多用平皿法、薄膜過濾法、涂抹法和MPN法，國家藥典要求應(yīng)用經(jīng)驗證合格方法。

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檢驗方法驗證

試驗環(huán)境

無菌檢驗應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下局部潔凈度100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行，其全過程應(yīng)嚴(yán)格恪守?zé)o菌操作，預(yù)防微生物污染，預(yù)防污染辦法不得影響供試品中微生物檢出。檢驗依據(jù)單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定時按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌測試方法》現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進行潔凈度驗證。

-版藥典

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隔離系統(tǒng)應(yīng)用

應(yīng)用隔離系統(tǒng)主要目標(biāo)-是保護產(chǎn)品免受外源性污染，包含操作人員、操作環(huán)境及外包裝等污染，確保無菌試驗結(jié)果可靠性，實現(xiàn)一次檢出要求。-是保護操作人員免受試驗過程中有害物質(zhì)帶來污染。隔離系統(tǒng)應(yīng)按相關(guān)要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境潔凈度須符合無菌檢驗要求。日常檢驗還需對試驗環(huán)境進行監(jiān)控。制藥用水微生物檢查方法的驗證第23頁

-為確保檢驗結(jié)果可靠性，真實性，選擇正確檢驗方法是至關(guān)主要。所以試驗前必須對選擇方法進行驗證。-證實所采取方法是適宜，確認所采取方法適宜于被檢供試品微生物污染檢驗。

方法驗證必要性制藥用水微生物檢查方法的驗證第24頁

檢驗結(jié)果影響原因供試品組分抑菌劑、增溶劑、乳化劑及抗氧化劑，這些組分在一定濃度下對微生物起一定抑制作用也可對污染菌造成損傷。環(huán)境影響不一樣類型微生物及不一樣存活狀態(tài)對環(huán)境抗性是不一樣。如培養(yǎng)基質(zhì)量、檢驗人員操作誤差等。制藥用水微生物檢查方法的驗證第25頁

方法驗證

試驗全方面驗證

如試驗環(huán)境，培養(yǎng)基，供試液制備，滅菌方法等全部進行驗證。當(dāng)驗證試驗符合要求時，就可認為在該試驗條件下該供試品對微生物無抑菌作用或抑菌作用可忽略不計，供試品檢驗結(jié)果可真實表達。制藥用水微生物檢查方法的驗證第26頁

驗證方法菌液制備50～100cfu/ml。驗證方法試驗組、菌液組、供試品對照組、釋劑對照組。結(jié)果判斷供試品組、對照組、稀釋劑對照組菌回收率均不低70%。制藥用水微生物檢查方法的驗證第27頁

方法驗證

驗證方法

⒈按供試液制備和細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)所要求方法及以下要求進行。⒉對各試驗菌回收率應(yīng)逐一進行驗證。⒊驗證試驗最少應(yīng)進行3次獨立平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗回收率。制藥用水微生物檢查方法的驗證第28頁

方法驗證試驗菌株大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草桿菌。菌液制備

同計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢驗。制藥用水微生物檢查方法的驗證第29頁

方法驗證

試驗組

-平皿法

取最低稀釋級供試液1ml和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，馬上傾注瓊脂培養(yǎng)基(平行制備2個平皿)，按平皿法測定其菌數(shù)。

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薄膜過濾法

取最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最終一次沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。制藥用水微生物檢查方法的驗證第30頁

方法驗證-菌液組所加試驗菌數(shù)。

-供試品對照組測定供試品本底菌數(shù)。

-稀釋劑對照組用對應(yīng)稀釋液替換供試品，加入試驗菌按試驗組測定其菌數(shù)。考查供試液制備過程中微生物受影響程度。制藥用水微生物檢查方法的驗證第31頁

方法驗證

試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)試驗組菌回收率(％)=————————————————