菌種篩選和改良

第二節(jié)發(fā)酵工業(yè)菌種本節(jié)內(nèi)容

§1菌種篩選§2菌種改良§1菌種篩選一、常用的工業(yè)微生物二、發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選一、常用的工業(yè)微生物1、細菌醋桿菌屬的醋化醋桿菌、弱氧化醋桿菌乳酸桿菌枯草桿菌乳酸桿菌醋化醋桿菌枯草桿菌丙酮丁醇梭菌大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌丙酮丁醇梭菌谷氨酸棒狀桿菌一、常用的工業(yè)微生物2、酵母菌釀酒酵母假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母解脂假絲酵母熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬釀酒酵母熱帶假絲酵母熱帶假絲酵母產(chǎn)朊假絲酵母一、常用的工業(yè)微生物3、霉菌曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點青霉、產(chǎn)黃青霉桔青霉青霉屬產(chǎn)黃青霉曲霉屬米曲霉黑曲霉根霉屬:德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉根霉屬米根霉一、常用的工業(yè)微生物4、放線菌鏈霉菌屬小單孢菌屬地中海諾卡氏菌

5、未培養(yǎng)微生物※定義：指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物。其在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例，約為99％。一、常用的工業(yè)微生物二、發(fā)酵工業(yè)菌種選育菌株分離：將混雜著各種微生物的樣品按照實際需要和菌株的特性采取迅速、準確、有效的方法對它們進行分離、篩選，進而得到所需微生物的過程。

※（一）菌種選擇的要求培養(yǎng)基原料來源廣、產(chǎn)物易回收

發(fā)酵周期較短；條件易控制；抗病毒（噬菌體）、雜菌能力強；菌種不易變異退化；對放大設備的適應性強；菌種不是病原菌（二）自然界工業(yè)菌種篩選程序標本采集→預處理→富集培養(yǎng)→菌種分離（初篩、復篩）→發(fā)酵性能鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大？如何在后續(xù)的操作中使發(fā)酵產(chǎn)品可能性實現(xiàn)？目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問題：→菌種保藏1、采樣樣品來源越廣泛，獲得新菌種的可能性越大。※采樣時應注意的問題:

A、土壤的有機質(zhì)含量和通風狀況

B、土壤的酸堿度和植被狀況

C、地理條件

D、季節(jié)條件A、土壤的有機質(zhì)含量和通風狀況耕地、菜園、近郊土壤：土質(zhì)通氣保水性能好，微生物生長旺盛，數(shù)量多，尤其細菌和放線菌較多山坡上的森林土壤：有機質(zhì)豐富，微生物生陰暗潮濕，適合霉菌和酵母菌生長沙土、貧瘠的土地：細菌數(shù)量少果園：樹根土壤中酵母菌含量較高（偏酸）豆科植物根系土壤：根瘤菌較多B、土壤的酸堿度和植被狀況腐殖土：霉菌較多油田土壤：分解石油的微生物較多自然環(huán)境中的天然菌群，可因人類的生產(chǎn)或生活而改變。如在土壤中加去莠津（2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1,3,5-三嗪），會導致放線菌群的增加；在殺真菌劑存在下，諾卡氏菌屬的菌更容易分離到。C、地理條件南方溫度高、溫暖季節(jié)長、雨水多、相對濕度高、植被覆蓋面廣、土壤有機質(zhì)豐富：許多工業(yè)微生物菌種，如抗生素產(chǎn)生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大都從南方獲取北方：秋季采土樣最為理想D、季節(jié)條件采土樣的方法南方：用取樣鏟，將表層5cm（陽光直射，蒸發(fā)量大水分少，而且受紫外線照射）左右的浮土除去，取5～25cm處的土樣10～25g，裝入事先準備好的塑料袋內(nèi)扎好。

北方：土壤干燥，可在10～30cm處取樣。給塑料袋編號并記錄地點、土壤質(zhì)地、植被名稱、時間及其他環(huán)境條件。一般樣品取回后應馬上分離，以免微生物死亡。富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。

富集培養(yǎng)是在目的微生物含量較少時，根據(jù)微生物的生理特點，設計一種選擇性培養(yǎng)基或創(chuàng)造有利生長條件，使目的微生物數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣勢種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢種，以利于分離得到所需要的菌株。2、增殖（富集）培養(yǎng)富集的基本方法：

1、控制營養(yǎng)：如以唯一碳源或氮源作底物；

2、控制培養(yǎng)條件：如pH、溫度、通氣量等；

3、抑制不需要的種類。3、培養(yǎng)分離

從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的的設計培養(yǎng)基；利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素。

從形態(tài)的角度

菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。（1）、常規(guī)分離法：平板劃線法稀釋分離法涂布法A分區(qū)劃線法B連續(xù)劃線法

將樣品分散到最低濃度

倒平板，培養(yǎng)，挑取單菌落

后面3個稀釋度各取0.1ml涂布透明圈法變色圈法抑菌圈法生長圈法（2）、生化反應分離法：在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁，這樣能分解該底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈。

圈的大小可初步反映該菌株利用底物的能力，完全可以作為菌種初篩的判斷標準。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶及核酸酶產(chǎn)生菌的分離，產(chǎn)有機酸菌的初篩。

透明圈法例1：分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株時，在培養(yǎng)基中添加碳酸鈣。例2：分離淀粉酶產(chǎn)生菌時，培養(yǎng)基以淀粉為唯一碳源，待樣品涂布到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)形成單個菌落后，再用碘液浸涂，根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明的水解圈來區(qū)別產(chǎn)酶菌株。對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來。

變色圈法

例1：分離果膠酶產(chǎn)生菌，用含0.2%果膠為唯一碳源，菌落長成后加入0.2%的剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)降紅色的變色圈。例2：分離內(nèi)肽酶產(chǎn)生菌，除了用酪蛋白作底物平板產(chǎn)生透明圈進行鑒別外，還可用吲羥乙酸酯為底物加到分離培養(yǎng)基內(nèi)，產(chǎn)生蛋白酶的菌落由于水解吲羥乙酸酯為3-羥基吲哚，后者能氧化生成藍色產(chǎn)物，根據(jù)變色圈便可選出平板上產(chǎn)蛋白酶菌株。若被檢菌能分泌某些抑制工具菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，便會在該菌落的周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈，被鑒別出來。抑菌圈法：抑菌圈自動測量分析儀

如，嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品進行保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為

。嘌呤產(chǎn)生菌常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素等產(chǎn)生菌。其工具菌是一些相對應的營養(yǎng)缺陷型菌株，由于得到所需的營養(yǎng)，凡是目的微生物周圍便會出現(xiàn)一個混濁生長圈。

生長圈法：§2誘變育種一、誘變育種二、航天育種自然選育一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。單細胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗

自然選育是一種簡單易行的方法，可達到純化菌種、防止菌種退化、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量的目的。但其突變率很低，因而要采用新方法進行菌株的改良。改良的具體目標提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量提高目標產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品改良的方法常規(guī)育種(誘變育種)細胞工程育種基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù)基因工程育種蛋白質(zhì)工程育種代謝工程育種

一、誘變育種

誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)

人工利用各種誘變劑誘發(fā)基因突變，再通過適當?shù)暮Y選方法獲得所需要的優(yōu)良菌種的育種方法，稱為誘變育種。

從青霉素產(chǎn)量看誘變育種1945時間1943194319431947195519711977目前發(fā)酵單位(u/ml)100250500～850～850～8000～2萬～5萬5～10萬

效價：指有效成分的濃度。1μg/μ

l稱為1單位誘變劑

物理的：紫外線、快中子、x射線等化學的：堿基類似物、亞硝基胍、Y啶類物質(zhì)等{生物的：噬菌體、轉(zhuǎn)座子化學誘變劑都具毒性，其中90%以上是致癌物質(zhì)或極毒藥品，使用時要格外小心，不能宜接用口吸，避免與皮膚直接接觸，不僅要注意自身安全，也要防上污染環(huán)境，造成公害。（一）化學誘變劑使用過程的安全性是一種強烈致癌物質(zhì)，操作時要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風櫥中進行。凡接觸過NTG的器皿必須及時、單獨處理，例用自來水大量沖洗或用1-2N的NaOH浸泡過夜，洗凈。NTG（N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍）是劇毒的誘變劑，在整個誘變過程，包括配制藥品、操作處理、保存等都要嚴守安全，不能接觸皮膚，所有接觸過EMS的器皿，單獨用大量水沖洗洗滌，或用10％NaS2O3溶液浸泡過夜，再用清水沖洗干凈。EMS（甲基磺酸乙酯）※（二）誘變育種應考慮的因素1、選擇合適的出發(fā)菌株合適的出發(fā)菌株就是通過育種能有效地提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量的菌株。

定義：出發(fā)菌株指用于誘變育種的最初菌株或每代誘變的試驗菌株，也稱親株。（1）選擇出發(fā)菌株的要求★對菌株產(chǎn)量，形態(tài)、生理等情況了解；★生長繁殖快，營養(yǎng)要求低，產(chǎn)孢子多且早；★對誘變劑敏感；★菌株要有一定的生產(chǎn)能力；★多出發(fā)菌株：一般采用3~4個出發(fā)菌株，在逐代處理后，將產(chǎn)量高、特性好的菌株留作繼續(xù)誘變的出發(fā)菌株。出發(fā)菌株及生理狀態(tài)：真菌、酵母106個/ml，放線菌孢子106~107個/ml,細菌108個/ml，細菌選擇對數(shù)生長期，真菌和放線菌使用幼年孢子，芽孢細菌也可以用芽孢進行誘變處理。力求90%以上為單孢子，制菌懸液用生理鹽水或緩沖溶液。（2）出發(fā)菌株的選擇2、復合誘變劑的使用誘變劑復合處理的效果往往好于單獨處理。復合處理有幾類：一類是兩種或多種誘變劑的先后使用；第二類是同一種誘變劑的重復使用；第三類是兩種或多種誘變劑的同時使用。

菌種單獨處理復合處理誘變劑突變率(%)誘變劑突變率(%)土曲霉紫外線

X射線

21.3

19.7

X射線+紫外線42.8土曲霉氮芥(0.1%)

紫外線

不明顯

4.7

氮芥+紫外線11.0鏈霉菌紫外線

γ射線

31.0

35.0

紫外線+γ射線43.6金色鏈霉菌

(2U-84)

二乙烯三胺

硫酸二乙酯

紫外線

6.06

1.78

12.5二乙稀三胺+紫外線

硫酸二乙酯+紫外線

26.6

35.86灰色鏈霉菌

(JIC-1)

紫外線9.8紫外線+可見光照射1次

紫外線+可見光照射6次

9.7

16.6

劑量的大小常以致死率和誘變率來確定。最適劑量是指能夠提高正突變株變異頻率幅度的誘變劑量。處理劑量大，致死率高，誘變率也會提高，但達到一定程度后，再提高劑量反而會下降；但誘變劑量也不宜過低，否則很難獲得所需的正突變株。致死率90%~99.9%（過去）

70%~80%（現(xiàn)在）。

3、誘變劑劑量的選擇4、變異菌株的篩選挑選菌株一般要從菌落形態(tài)變異類型著手，發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)量相關(guān)的特征，并根據(jù)這些特征，進行篩選、鑒定。一般要經(jīng)過初篩和復篩兩個階段。如:青霉素產(chǎn)生菌高產(chǎn)突變菌種的篩選初篩：誘變后→稀釋→涂布平板→培養(yǎng)→挑單個菌落到斜面→培養(yǎng)→將斜面上的菌落逐個接種到搖瓶→振蕩培養(yǎng)→測抗生素效價→超過對照效價10%以上的菌種，進行復篩。復篩：過程與初篩基本相同，不同的是一般將斜面上的單個菌落接種到三個搖瓶中，得出平均效價。復篩可進行1～3次。由此篩選出的高產(chǎn)穩(wěn)定菌種還要經(jīng)過小型甚至中型試驗，才能用到發(fā)酵生產(chǎn)中。（三）誘變劑處理的方式（1）直接處理：將菌懸液用誘變劑直接處理，然后分離。（2）生長過程處理：適用于誘變作用強而致死率低的誘變劑，或只在分裂過程中對DNA起作用的誘變劑，如秋水仙素。這些誘變劑一般都直接加入到培養(yǎng)基中，混勻，倒入平皿制成平板后培養(yǎng)，在生長過程中誘發(fā)菌體突變。（3）振蕩培養(yǎng)處理：即在搖瓶培養(yǎng)基中加入一定量的誘變劑。菌體隨著振蕩培養(yǎng)，不斷地和誘變劑接觸，它們之間的作用遠比平板生長過程處理充分得多，所以誘變劑濃度不宜過高。（四）誘變篩選流程

(致死率、突變率、正變率、高產(chǎn)率、投產(chǎn)率)出發(fā)菌種斜面

或搖瓶培養(yǎng)24h細菌懸液

稀釋涂平板單孢子懸液

誘變處理挑取單菌落200個

搖瓶初篩50株挑出高產(chǎn)斜面

留種保藏菌種傳種斜面搖瓶復篩5株挑出高產(chǎn)菌株放大罐試驗，中試考查大型投產(chǎn)試驗誘變篩選過程中的致死率、突變率、正變率、高產(chǎn)率、投產(chǎn)率二