抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子

抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第1頁(yè)抗體檢測(cè)技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)放射免疫測(cè)定蛋白印跡免疫共沉淀親和力測(cè)定

抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第2頁(yè)凝集反應(yīng)

凝集反應(yīng)是指顆粒抗原與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合反應(yīng)出現(xiàn)可見性現(xiàn)象。顆?？乖缤暾?xì)菌、紅細(xì)胞等與對(duì)應(yīng)抗體相混合，在一定條件下出現(xiàn)凝集。凝集反應(yīng)中抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素?？贵w檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第3頁(yè)沉淀反應(yīng)1、絮狀沉淀反應(yīng)2、環(huán)狀沉淀反應(yīng)3、雙向擴(kuò)散4、單向免疫擴(kuò)散抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第4頁(yè)雙向擴(kuò)散法操作：生理鹽水配制1%-5%瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測(cè)定抗體效價(jià)，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測(cè)抗原存在和定性抗原?？贵w檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第5頁(yè)抗原抗體為單一體系時(shí)，抗原濃度不一樣，沉淀弧特征不一樣：抗原抗體為多體系時(shí)，出現(xiàn)沉淀弧有多條，彼此互不干擾?？贵w檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第6頁(yè)

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試驗(yàn)

(ELISA)

Enzymelinkedimmunosorbentassay

抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第7頁(yè)試驗(yàn)原理ELISA利用了免疫反應(yīng)高度特異性和酶促反應(yīng)高度敏感性檢測(cè)抗原或抗體使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶活性按一定步驟進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)加底物顯色，依據(jù)顏色反應(yīng)深淺進(jìn)行定性或定量分析抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第8頁(yè)方法類型

ELISA既可測(cè)抗原又可測(cè)抗體，依據(jù)試劑起源、標(biāo)本性狀以及檢測(cè)詳細(xì)條件，可設(shè)計(jì)出不一樣類型檢測(cè)方法：

1.直接法

2.間接法

3.雙抗體夾心法

4.雙夾心間接法抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第9頁(yè)抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第10頁(yè)抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第11頁(yè)抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第12頁(yè)AsandwichELISA.(1)Plateiscoatedwithacaptureantibody;(2)sampleisadded,andanyantigenpresentbindstocaptureantibody;(3)detectingantibodyisadded,andbindstoantigen;(4)enzyme-linkedsecondaryantibodyisadded,andbindstodetectingantibody;(5)substrateisadded,andisconvertedbyenzymetodetectableform.抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第13頁(yè)一、試劑及儀器準(zhǔn)備（一）免疫吸附劑1.固相載體⑴要求：①吸附力強(qiáng)②能保持Ag或Ab活性③不參加化學(xué)反應(yīng)

抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第14頁(yè)⑵載體性能比較

要求：載體材料+、-結(jié)果差異大

檢測(cè)方法：10ug/LIgG包被,加酶標(biāo)抗IgG，顯色后，測(cè)20孔OD，要求CV<10%⑶常見載體：

材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等

形狀：小試管、小珠、微量反應(yīng)板抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第15頁(yè)2.Ag或Ab：純度高、效價(jià)高、結(jié)協(xié)力高3.免疫吸附劑(固相Ag或Ab)：

包被：將Ag或Ab固相化過(guò)程

包被緩沖液

封閉：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特異吸附干擾抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第16頁(yè)㈡酶結(jié)合物：1.要求：純度高、催化轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、起源豐富、標(biāo)識(shí)后穩(wěn)定2.常見酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等3.底物：HRP可溶性底物及呈色：鄰苯二胺(OPD)：橙紅(492nm)；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：藍(lán)色(450nm)5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm)魯咪諾+H2O2：熒光HRP不可溶性底物及呈色：

DAB：棕黃色α-萘酚：紅色3-氧基-9-乙基卡唑：紅色4-氯-1-萘酚：灰藍(lán)色AP可溶性底物及呈色：對(duì)硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm)4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光AP不可溶性底物及呈色：

NBT和BCIP混合液：紫色堅(jiān)固紅和萘酚ASMX混合液：紅色

?-半乳糖苷酶：

4-甲基傘基-?-半乳糖苷：熒光抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第17頁(yè)4.酶結(jié)合物制備：戊二醛交聯(lián)法過(guò)碘酸鹽氧化法抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第18頁(yè)（三）設(shè)備：酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀

指測(cè)讀ELISA光度計(jì)；針對(duì)固相載體形式不一樣，各有特制適合用于板、珠和小試管設(shè)計(jì)性能指標(biāo)：測(cè)讀速度、讀數(shù)準(zhǔn)確性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度和可測(cè)范圍、線性優(yōu)良酶標(biāo)儀讀數(shù)普通可準(zhǔn)確0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%操作：室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30min，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀A值時(shí)，要選取產(chǎn)物敏感吸收峰，如OPD用492nm波長(zhǎng)。有酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第19頁(yè)抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第20頁(yè)用途DrDennisEBidwellandAlisterVollercreatedtheELISAtesttodetectvariouskindofdiseases,suchasmalaria,Chagasdisease,andJohne'sdisease.ELISAtestsalsoareusedasininvitrodiagnosticsinmedicallaboratories.TheotherusesofELISAinclude:detectionofMycobacteriumantibodiesintuberculosisdetectionofrotavirusinfecesdetectionofhepatitisBmarkersinserumdetectionofenterotoxinofE.coliinfeces抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第21頁(yè)WESTERNBLOT步驟：試劑準(zhǔn)備：1、SDS試劑:見電泳試驗(yàn)。2、勻漿緩沖液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4、0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。5、膜染色液：考馬斯亮蘭0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g溶于20ml0.01MPBS中。6、顯色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸鎳胺0.1ml；H202

1.0μl。

抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第22頁(yè)樣品制備含量測(cè)定抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第23頁(yè)SDS－PAGE電泳抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第24頁(yè)轉(zhuǎn)膜抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第25頁(yè)免疫反應(yīng)抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第26頁(yè)化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第27頁(yè)類風(fēng)濕因子類風(fēng)濕因子（rheumatoidfactor,RF）可分為IgM、IgA、IgG、IgD、IgE五型（注：在臨床內(nèi)科學(xué)中描述為四型，沒有IgD型；但在試驗(yàn)室診療學(xué)中描述為5型），是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清中針對(duì)IgGFC片段上抗原表位一類本身抗體，類風(fēng)濕因子陽(yáng)性患者較多伴相關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，如皮下結(jié)節(jié)及血管炎等?？贵w檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第28頁(yè)類風(fēng)濕因子約90%類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者RF呈陽(yáng)性。IgA-RF與骨質(zhì)破壞相關(guān)，早期IgA-RF升高常提醒病情嚴(yán)重，預(yù)后不良；IgE-RF升高時(shí)，已屬病情晚期。一些本身免疫病，如冷球蛋白血癥、進(jìn)行性全身性硬化癥、干燥綜合征、SLE等患者都有較高陽(yáng)性率；一些其它疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出現(xiàn)RF。抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子第29頁(yè)類風(fēng)濕因子多年來(lái)對(duì)IgM型類風(fēng)濕因子生物作用已經(jīng)有所了解，這些生物作用包含：1、調(diào)整體內(nèi)免疫反應(yīng)；2、激活補(bǔ)體，加緊去除微生物感染